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Methodenartikel

Immobilisierung von Caenorhabditis Elegans analysieren intrazellulären Transport in Neuronen

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DOI:

10.3791/56690

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18. Oktober 2017

1Frontier Research Institute for Interdisciplinary Sciences and Graduate School of Life Sciences, Tohoku University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Caenorhabditis elegans (C. Elegans) ist ein gutes Modell, axonalen und intrazellulären Transport zu studieren. Hier beschreibe ich ein Protokoll zur in-Vivo -Erfassung und Analyse der axonalen und intraflagellar Transport in C. Elegans.

Zusammenfassung

Axonalen Transport und intraflagellar Transport (IFT) sind wesentlich für Axon und Zilien Morphogenese und Funktion. Kinesin-Superfamilie Proteine und Dynien sind molekulare Motoren, die Anterograde und retrograder Transport bzw. regulieren. Diese Motoren verwenden Mikrotubuli Netzwerke als Schienen. Caenorhabditis elegans (C. Elegans) ist eine leistungsstarke Modellorganismus axonalen Transport und IFT in Vivozu studieren. Ich beschreibe hier ein Protokoll zur axonalen Transport und IFT in lebenden beobachten C. Elegans. Beförderten Güter kann durch die Kennzeichnung Ladung Proteine mit fluoreszierenden Proteinen wie grün fluoreszierendes Protein (GFP) visualisiert werden. C. Elegans ist transparent und GFP-Tags Ladung Proteine in bestimmten Zellen unter zellspezifische Promotoren ausgedrückt werden können. Lebende Würmer können durch Microbeads auf 10 % Agarose-Gel fixiert werden, ohne zu töten oder betäuben die Würmer. Unter diesen Bedingungen kann Fracht Bewegung direkt in die Axone und Zilien des Lebens beobachtet werden C. Elegans ohne Dissektion. Diese Methode kann angewendet werden, um die Beobachtung Fracht-Moleküls in alle Zellen durch Ändern der Zielproteine und/oder die Zellen, die, denen Sie in ausgedrückt werden. Grundlegendsten wie molekulare Motoren und Adapter-Proteine, die axonalen Transport und IFT beteiligt sind sind in C. Eleganskonserviert. Im Vergleich zu anderen Modellorganismen, werden Mutanten erhalten und leichter in C. Elegansgepflegt. Kombination dieser Methode mit verschiedenen C. Elegans Mutanten kann die molekularen Mechanismen der axonalen Transport und IFT klären.

Einleitung

Live Cell Imaging ist ein wesentliches Instrument für die Analyse von intrazellulären Transport. In neuronale Zellbiologie sind Analysen des axonalen Transports mit live Cell Imaging unerlässlich für das Verständnis der neuronalen Funktion und Morphogenese1. Mängel im axonalen Transport unterliegen verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen2. Kinesin-Superfamilie Proteine und Dynien durchführen bzw. axonalen Transport Anterogradely und Doppelthebel,1,2.

Zilien sind ein weiteres zellulären Fach, in dem die Mikrotubuli Netzwerk und Menschenhandel Maschinen hochentwickelte3sind. Protein Synthese Maschinen ist nicht in Zilien, lokalisiert, d.h. ciliary Proteine zu den Zilien-Tipps aus dem Zytoplasma transportiert werden müssen. Zilien-spezifische Kinesin und Dynien, namens Kinesin-2 und zytoplasmatischen Dynien-2, bzw., transport der Komponenten der Zilien4, in ein Phänomen namens intraflagellar Transport (IFT)5. Beeinträchtigung der IFT verursacht ein Spektrum von Krankheiten genannt Ciliopathies6. Somit ist Analyse der IFT-Mechanismus von live Cell Imaging erforderlich grundlegende Mechanismen der ciliary Entstehung und Pathogenese zu verstehen.

Caenorhabditis elegans (C. Elegans) ist ein gutes Modell, axonalen Transport und IFT7,8,9zu studieren. Um IFT zu beobachten, hat Chlamydomonas als Modell Organismus5,6verbreitet. Wie Chlamydomonas eines einzelligen Organismus ist, wäre das Verhältnis von IFT mit Altern, neuronale Funktion und Verhalten schwer zu analysieren. Darüber hinaus wurden wichtige genetische Techniken wie CRISPR/Cas9 nicht auf Chlamydomonasangewendet. Bei höheren Modellorganismen wie Mäuse und Drosophilaverursacht Störung des axonalen Transports und IFT oft tödliche Phänotypen, weil axonalen Transport und IFT für die Morphogenese und Homöostase der Tiere 10notwendig sind, 11. Bei Mäusen ist Zellkultur und Transfektion in der Regel zu beobachten axonalen Transport und IFT, wonach viele Fähigkeiten und umfangreiche Zeit12,13erforderlich. Darüber hinaus kann viele wichtige physiologische Zusammenhänge in kultivierten Zellen und Zell-Linien verloren gehen. C. Elegans Mutanten in denen axonalen Transport oder IFT werden gestört, weil das Nervensystem nicht essentiell für das Überleben der Würmer ist, sind oft nicht tödliche7,9,14. Axonalen Transport und IFT können direkt in Vivo ohne Dissektion beobachtet werden, weil C. Elegans transparent ist und deshalb einfach zu GFP-Tags Marker zu beobachten.

Es gibt mehrere Protokolle, C. Elegans, z. B. die Verwendung eines mikrofluidischen Gerät15, Agarose-Pads mit Anästhesie16oder Microbeads17zu immobilisieren. Die Einbeziehung der Narkose kann der Menschenhandel Ereignisse in Neuronen15hemmen. Ein klarer Nachteil der Mikrofluidik-Gerät Methode ist, dass die Vorbereitung einer mikrofluidischen Gerät nicht immer einfach ist. Immobilisierung von Agarose-Pads und Microbeads ist stattdessen eine bequeme und einfache Möglichkeit, Time Lapse Bildgebung in C. Elegansdurchzuführen. Ich beschreibe hier dieses grundlegende Protokoll zu immobilisieren C. Elegans und visualisieren axonalen Transport und IFT in Vivo in C. Elegans. Im Vergleich zu anderen Methoden, die hier beschriebene Methode erfordert keine spezielle Ausrüstung und ist viel billiger und leichter durchzuführen.

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Protokoll

1. Probenvorbereitung

  1. erzeugen eine transgene C. Elegans Belastung mit transgenen Methoden 18. Alternativ erhalten Sie geeignete Stämme von Caenorhabditis Genetik Center (CGC). Um axonalen Transport von synaptischen Vesikel Vorstufen zu visualisieren, verwenden die transgene Linie wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. IFT, transgene Linie mnIs17 [Osm-6::gfp] 19 erhalten zu beobachten. Diese Stämme sind in diesem Protokoll verwendeten.
    Hinweis: Entweder extrachromosomale Array, genomischen Integration oder sogar GFP Knock-in arbeitet. Um Hintergrund Signale zu reduzieren, verwenden Sie zellspezifische Promotoren, sondern als Pan-neuronale Promotoren.
    Hinweis: Die Wartung von Würmern ist in anderen Protokollen 20 beschrieben. Belastungen wurden mittlere (NGM) Platten (1,7 % (w/V) Agarose, 50 mM NaCl, 0,25 % (w/V) Pepton, 1 mM CaCl 2, 5 mg/mL Cholesterin, 25 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgSO auf Rasen Escherischia coli OP50 Feeder auf Nematoden Wachstum beibehalten. 4 auf 60 mm Durchmesser Kunststoffgeschirr) bei 20 ° c
  2. Grow worms bei 20 ° C auf NGM Platten zu jeder Phase des Lebenszyklus der Würmer.
    Hinweis: Man kann in jedem Stadium axonalen Transport und IFT beobachten. Späten L4 zu jungen Erwachsenen ist eine gute positive Kontrolle, weil mehrere Publikationen, diese Phasen und visualisierte Menschenhandel Veranstaltungen 14 , 21 , 22 verwendet haben , 23.

2. Vorbereitung von 10 % Agarose

Hinweis: viele Hersteller bieten ähnliche Produkte wie Agar Agar Pulver und Agarose. Verwenden Sie Elektrophorese Klasse Agarose (Stärke-gel > 1200 g/cm 2). Billige Agar Pulver nicht funktionieren, weil die resultierende Gel nicht stark genug ist, um Würmer zu immobilisieren.

  1. Mix 0,4 g Agarose in 4 mL destilliertem Wasser (DW) in einer Glasröhre (1,5 cm x 10,5 cm). Setzen Sie einen Deckel auf die Glasröhre um Verdunstung zu vermeiden.
  2. Setzen das Glasrohr auf einem Heizblock 95 ° C für 90 min. Darüber hinaus bereiten Sie ein weiteres Glasrohr (1,5 cm x 10,5 cm) gefüllt mit DW und halten Sie es bei 95 ° c stellen einen Pasteur Pipettieren in der 95 ° C DW ( Abb. 1 A). Viele kleine Bläschen zu sehen, in der Agarose-Röhre und die Lösung trüb werden sollte. Lassen Sie es, bis die Lösung klar wird. Dann mischen Sie durch Pipettieren rauf und runter, bis die Agarose-Lösung homogen wird.
    Hinweis: Mikrowellen können nicht verwendet werden, zur Vorbereitung von 10 % Agarose-Lösung, wenn aus DW und Agarose. Kleine Bläschen, die durch Mikrowellen verursacht verhindern Agarose schmelzen. Jedoch kann wieder mit Hilfe einer Mikrowelle erstarrten 10 % Agarose-Gel leicht geschmolzen werden. Glasröhren mit 10 % Agarose-Gel werden vor der Zeit vorbereitet und bei 4 ° C für mindestens 6 Monate gelagert. Wenn dabei schmelzen die Lager mit Hilfe einer Mikrowelle bei Bedarf und ab Schritt 3 in diesem Protokoll.
    Hinweis: Agarose verliert allmählich die Fähigkeit zu verfestigen, wenn für eine lange Zeit oder nach wiederholten Erstarrung und schmelzen bei 95 ° C inkubiert. In diesem Fall bereiten neue 10 % Agarose.

3. Vorbereitung der Agarose Pad

  1. mit der erwärmten Pasteur Pipettieren vorbereitet im Schritt 2.2, legen Sie 2 Tropfen 10 % Agarose auf einer Folie 76 x 22 mm.
  2. Erstarrt schnell Abdeckung mit einer zweiten 76 x 22 mm 2 Folie vor der Agarose-Tropfen, wie in Abbildung 1 B, und drücken Sie unten auf der zweiten Folie gezeigt, die Agarose-Lösung zu vereinfachen. Die Dicke sollte 0,5-1 mm.
  3. Spülen schnell Pasteurpipette Pipettieren 95 ° c DW rauf und runter, bis die Agarose-Lösung ausgewaschen ist. Andernfalls wird das Pipettieren von Agarosegel verstopft werden. Lassen Sie die Pipette stehen in der 95 ° C DW.
  4. Für 1 min warten. Die Agarose-Pad bildet und wird trüb. Schieben Sie die Folien voneinander entfernt per Hand ( Abbildung 1 C).

4. Montage von Würmern

Hinweis: bereits geringe Mengen an Wurm Bewegung verhindern gute Beobachtung. Levamisol hat traditionell verwendet, um zu verhindern, dass Wurm Bewegung auf die Agarose Pad 24 , 25. Jedoch Levamisole hemmt neuronale Rezeptoren in C. Elegans und deshalb beeinträchtigen Menschenhandel Ereignisse in Neuronen 15. Mit Polystyrol Microbeads beschriebenen Hereis eine gute alternative 17.

  1. Unter dem Stereo-Mikroskop mit einer verschiebbaren Spiegel durchleuchtbaren ausgestattet, übertragen ~ 30 transgenen Würmer mit dem Ausdruck der entsprechenden Markierungen, um eine neue NGM Platte ohne Bakterien mit einem Platindraht holen.
    Hinweis: Eine Platindraht Pick ist aus Platindraht und Pasteur-Pipette (5 Zoll), und die Spitze der Platindraht wurde dem Erdboden gleichgemacht. Die Vorbereitung der Platindraht Picks und Handhabung von Würmern mit diesen sind beschrieben in der Wormbook (http://www.wormbook.org).
  2. Lassen Sie die Platte für 1 min. Bakterien werden automatisch entfernt von den Oberflächen des Würmer wie die Würmer auf NGM Agarose-Gel ohne Bakterien bewegen.
  3. Put a 0.5-1.0 µL Tropfen 2,6 % 100 nm Durchmesser Polystyrol Microbeads im Wasser auf das Agar-Pad ( Abbildung 1 D). Übertragen Sie 10-20 Würmer aus der bakterienfrei NGM-Platte auf die Microbeads. Tropfen und Verbreitung der Würmer mit der Platindraht auswählen, um zu vermeiden, die Überlappung der Wurm stellen ( Abbildung 1 E).
  4. Gelten ein 22 x 40 mm 2 Deckglas ( Abbildung 1 F). Drücken Sie vorsichtig um Luftblasen zu entfernen, aber vermeiden vernichtende Würmer. Die Probe ist nun bereit für die Abbilderstellung.
    Hinweis: Da keine Narkose verabreicht wird, sind Würmer nur durch die Reibungskraft, erzeugt durch die Agar-Pad, Polystyrol Microbeads und Deckglas 17 behoben. Das Vorhandensein von Feeder Bakterien und/oder zuviel Lösung wird die Reibungskraft schwächer machen.
    Hinweis: Verschiedene Größen von Deckgläsern (z.B., 22 x 22 mm 2, 18 x 18 mm 2) arbeiten. Jedoch größere Deckgläsern können verhindern, dass Wasser eintauchen oder Öl aus der Austritt von Flüssigkeit ins Proben während der Beobachtung Objektivlinse.

5. Beobachtung

Hinweis: geeignete bildgebende Parameter (Laserleistung, Gewinn, binning, etc.) werden für jedes Mikroskop und Kamera unterscheiden. Hier dient ein Weitfeld-Mikroskop mit drehenden Scheibe konfokale Scanner und eine digitale CCD-Kamera ausgestattet.

  1. Stellen der Temperaturregler der Bühne auf 20 ° C, oder passen Sie die Raumtemperatur auf 20 ° c
  2. Setzen die Beispielfolie auf den Mikroskoptisch. Verwenden Sie 100 X (numerische Apertur = 1,3 oder besser) Objektivlinse.
  3. Achten Sie auf die jeweiligen Bereiche in Abbildung 2 A (für wyIs251 und axonalen Transport) oder Abbildung 2 B (für mnIs17 und IFT) als Positivkontrollen . Andere Bereiche können analysiert werden, wie gut 22.
  4. Set-Parameter (CCD Gain = 200, Binning = 1 oder 2, Laserleistung bei 488 nm = 1,0-1,3 mW). Zeitraffer Zeiterfassung mit 4 Frames pro Sekunde für bis zu 1 min. Speicherdateien als Tcl/TK-TIFF-Format durchführen.
    Hinweis: Wenn GLP signalisiert verschwinden und es ist schwierig, weiterhin beobachten, GFP::RAB-3 oder OSM-6::GFP für 30 s, die Laserleistung ist zu stark. In diesem Fall reduzieren Sie die Laserleistung. Umgekehrt, wenn keine vesikuläre Bewegung erfasst wird, ist die Laserleistung zu schwach. In diesem Fall erhöhen die Laserleistung.
  5. Beobachten einen anderen Wurm und 5.3 und 5.4 wiederholen. Die Beobachtungen können für bis zu 20 min dauern, aber jeder Wurm sollte nur einmal aufgezeichnet werden, um die Auswirkungen von p zu vermeidenHoto Schaden.
    Hinweis: Würmer sind für mindestens 20 Minuten ohne wesentliche Mängel 7 , 27 , 28 beobachtet worden. Längere Beobachtung möglicherweise aber Haven ' t wurde noch nicht getestet. Ein deutliches Zeichen der neuronalen Tod ist die Änderung der neuronale Morphologie wie Neuriten Schwellung. Wie schwache Signale der GFP in Axone und Dendriten in wyIs251 und mnIs17 ersichtlich ist, kann die Neuriten Morphologie leicht überprüft werden, bei einem Blick auf Axone und Dendriten. Neuronale Morphologie ist in Abbildung 2 gezeigt.
  6. Film-Dateien zu erzeugen.
    1. Offene Multi-TIFF-Datei mit Fidschi-Software. Gehen Sie zu Datei > öffnen und wählen Sie dann die Multi-TIFF-Datei in Schritt 5.4 gespeichert.
      Hinweis: Fidschi kann bei jttps://fiji.sc heruntergeladen werden. Bild J und Plugins können auch verwendet werden, um Kymographs zu erzeugen. Wenn dabei die relevanten Anweisungen für das ausgewählte Plugin.
    2. Klicken Sie auf die " rechteckige Auswahl " ( Abb. 3 A, Pfeil) und wählen Sie den gewünschten Bereich durch Zeichnen eines Rechtecks mit einer Computer-Maus (gelbes Rechteck im Bild 3 A). Gehe zu Bild > Stapel > Tools > Substacks und wählen Sie die Slice-Nummern, die im Film enthalten sind. Entsteht ein Substack.
    3. Das Substack-Fenster durch einen Klick aktivieren und zum Bild > Adjust > Helligkeit/Kontrast. Ein Fenster, um die Helligkeit und den Kontrast anpassen angezeigt wird. Schieben Sie in das Fenster oben bar (mindestens) auf der rechten Seite so dass das Hintergrundsignal verschwindet und die zweite nach oben bar (Maximum) auf der linken Seite so, dass der beweglichen Vesikel und Partikel können man ganz gut über dem Hintergrund.
    4. Zum Bild > Stapel > Zeit Stamper. Wie der Film mit 4 Frames/s in Schritt 5.4 aufgezeichnet ist, ist der zeitliche Abstand 0,25 s. So geben " 0,25 " Intervalls.
    5. Erzeugen eine Filmdatei speichern unter wählen > AVI aus dem Menü "Datei" (Movie 1 und 2).
      Hinweis: Durch die Verwendung geeigneter Plugins, Sie können die Datei speichern als andere Formate wie " mpeg4 " oder " Mov " Dateien.
  7. Erzeugen Kymographs.
    1. Öffnen Sie die ursprüngliche Filmdateien mit Fidschi-Software erneut und wiederholen Sie die Schritte 5.6.2 und 5.6.3 die Helligkeit und den Kontrast anpassen.
    2. Klicken Sie " segmentiert Linie " ( Abbildung 3 B, Pfeil). Mit der Maus eine segmentierte Linie entlang der Zilien oder Axon (gelbe Linie in Abbildung 3 B).
    3. Gehen zu analysieren > Multi Glomeruli > Multi Kymograph ( Abb. 3 C). Breite Fenster "Linie" wird angezeigt ( Abbildung 3 D). Typ " 3 " in der Linienbreite Fenster und klicken Sie auf "OK" ( Abbildung 3 D).
    4. Glomeruli Fenster entsteht. Speichern Sie das Bild in TIFF oder JPEG-Format.

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Ergebnisse

Axonalen Transport in DA9 neuron
Mit der wyIs251 Linie, die Anterograde und retrograde axonale Transport von GFP::RAB-3 kann in den DA9 Motoneuron gleichzeitig aufgezeichnet werden. Die Durchschnittsgeschwindigkeit der Anterograde und retrograde Transport in den proximalen dorsalen Axon des Neurons DA9 ist etwa 1,8 und 2,6 µm/s, jeweils22. Die Anzahl der beweglichen Vesikel geht um 0,03 und 0,018 pro μm Axon pro s. So findet man für ein...

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Diskussion

Einschränkung in Bezug auf vorhandene Methoden
Die hier beschriebene Methode ist optimiert, um schnell Ereignisse wie axonalen Transport und IFT beobachten. Immobilisierung ist somit mehr als längere Inkubationszeit priorisiert. Während wir Menschenhandel Ereignisse für mindestens 20 Minuten ohne bedeutende Störung beobachtet wurden, kann diese Methode nicht immer zu langsam Ereignisse erfordern längere Beobachtungen, wie Axon Dehnung und Zellwanderung beobachten geeignet. Für längere Beobachtungen, d...

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Offenlegungen

Der Autor hat nichts preisgeben.

Danksagungen

Der Autor dankt tief Dr. Asako Sugimoto (Tohoku University) für ihre hilfreiche Diskussion. wyIs251 war ein großzügiges Geschenk von Dr. Kang Shen (Stanford University). mnIs17 lieferte die CGC, das von NIH Büro Infrastruktur Forschungsprogramme (P40 OD010440) gefördert wird. Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI Grant #17 H 05010 und #16 H 06536 und Daiichi Sankyo-Stiftung, Brain Science Foundation und Naito Foundation unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Gleitglas (76  x 26 mm)MatsunamiS1111
Deckglas (22  x 40 mm)MatsunamiC024401
AgaroseWako318-01195
Polystylene Mikrokügelchen 0,1 MikronPolysciences#00876
WärmeblockTAITEC0063288-000CTU-mini
MikroskopOlympusIX-71Weitfeldmikroskop
Spinning-Disk-ScannerYokogawaCSU-X1konfokaler Spinning-Disc-Scanner
Digitale CCD-KameraHamamatsu PhotonicsC10600-10BORCA-R2 degitale CCD-Kamera
Objektiv (x100, NA1.4)OlympusUPLSAPO 100XO
Pasteur-Pipette (5 Zoll)IWAKIIK-PAS-5P
Glasröhre (1,5 cm Durchmesser x 10,5 cm)IWAKI9820TST15-105NP
TV9211: wyIs251Labor von Kang ShenN/A
OTL11: mnIs17Ref. 27, 29N/ASP2101 wurde 6-fach mit Wildtyp rückgekreuzt
StereomikroskopCarl Zeiss435064-9000-000STEMI 508 
SpiegeldurchleuchtungseinheitCarl Zeiss435425-9010-000
Platindraht (0,2 mm)Nilaco Corporationm78483501
60 mm KunststoffschaleFalcon#351007
FidschiN/AN/A
Nematoden-Wachstumsmedium (NGM)   1,7 % (w/v) Agarose, 50 mM NaCl, 0,25 % (w/v) Pepton, 1 mM CaCl2, 5 mg/ml Cholesterin, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 
https://fiji.sc/

Referenzen

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