Immobilisierung von Caenorhabditis Elegans analysieren intrazellulären Transport in Neuronen

Zusammenfassung

Caenorhabditis elegans (C. Elegans) ist ein gutes Modell, axonalen und intrazellulären Transport zu studieren. Hier beschreibe ich ein Protokoll zur in-Vivo -Erfassung und Analyse der axonalen und intraflagellar Transport in C. Elegans.

Zusammenfassung

Axonalen Transport und intraflagellar Transport (IFT) sind wesentlich für Axon und Zilien Morphogenese und Funktion. Kinesin-Superfamilie Proteine und Dynien sind molekulare Motoren, die Anterograde und retrograder Transport bzw. regulieren. Diese Motoren verwenden Mikrotubuli Netzwerke als Schienen. Caenorhabditis elegans (C. Elegans) ist eine leistungsstarke Modellorganismus axonalen Transport und IFT in Vivozu studieren. Ich beschreibe hier ein Protokoll zur axonalen Transport und IFT in lebenden beobachten C. Elegans. Beförderten Güter kann durch die Kennzeichnung Ladung Proteine mit fluoreszierenden Proteinen wie grün fluoreszierendes Protein (GFP) visualisiert werden. C. Elegans ist transparent und GFP-Tags Ladung Proteine in bestimmten Zellen unter zellspezifische Promotoren ausgedrückt werden können. Lebende Würmer können durch Microbeads auf 10 % Agarose-Gel fixiert werden, ohne zu töten oder betäuben die Würmer. Unter diesen Bedingungen kann Fracht Bewegung direkt in die Axone und Zilien des Lebens beobachtet werden C. Elegans ohne Dissektion. Diese Methode kann angewendet werden, um die Beobachtung Fracht-Moleküls in alle Zellen durch Ändern der Zielproteine und/oder die Zellen, die, denen Sie in ausgedrückt werden. Grundlegendsten wie molekulare Motoren und Adapter-Proteine, die axonalen Transport und IFT beteiligt sind sind in C. Eleganskonserviert. Im Vergleich zu anderen Modellorganismen, werden Mutanten erhalten und leichter in C. Elegansgepflegt. Kombination dieser Methode mit verschiedenen C. Elegans Mutanten kann die molekularen Mechanismen der axonalen Transport und IFT klären.

Einleitung

Live Cell Imaging ist ein wesentliches Instrument für die Analyse von intrazellulären Transport. In neuronale Zellbiologie sind Analysen des axonalen Transports mit live Cell Imaging unerlässlich für das Verständnis der neuronalen Funktion und Morphogenese¹. Mängel im axonalen Transport unterliegen verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen². Kinesin-Superfamilie Proteine und Dynien durchführen bzw. axonalen Transport Anterogradely und Doppelthebel,^1,2.

Zilien sind ein weiteres zellulären Fach, in dem die Mikrotubuli Netzwerk und Me....

Protokoll

1. Probenvorbereitung

1. erzeugen eine transgene C. Elegans Belastung mit transgenen Methoden ¹⁸. Alternativ erhalten Sie geeignete Stämme von Caenorhabditis Genetik Center (CGC). Um axonalen Transport von synaptischen Vesikel Vorstufen zu visualisieren, verwenden die transgene Linie wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] ⁷. IFT, transgene Linie mnIs17 [Osm-6::gfp] ¹⁹ erhalten zu beobachten. Diese Stämme sind in diesem Protokoll verwendeten.
   Hinweis: Entweder extrachromosomale Array, genomischen Integration oder sogar GFP Knock-in arbe....

Ergebnisse

Axonalen Transport in DA9 neuron
Mit der wyIs251 Linie, die Anterograde und retrograde axonale Transport von GFP::RAB-3 kann in den DA9 Motoneuron gleichzeitig aufgezeichnet werden. Die Durchschnittsgeschwindigkeit der Anterograde und retrograde Transport in den proximalen dorsalen Axon des Neurons DA9 ist etwa 1,8 und 2,6 µm/s, jeweils²². Die Anzahl der beweglichen Vesikel geht um 0,03 und 0,018 pro μm Axon pro s. So findet man für ein.......

Diskussion

Einschränkung in Bezug auf vorhandene Methoden
Die hier beschriebene Methode ist optimiert, um schnell Ereignisse wie axonalen Transport und IFT beobachten. Immobilisierung ist somit mehr als längere Inkubationszeit priorisiert. Während wir Menschenhandel Ereignisse für mindestens 20 Minuten ohne bedeutende Störung beobachtet wurden, kann diese Methode nicht immer zu langsam Ereignisse erfordern längere Beobachtungen, wie Axon Dehnung und Zellwanderung beobachten geeignet. Für längere Beobachtungen, d.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Gleitglas (76  x 26 mm)	Matsunami	S1111
Deckglas (22  x 40 mm)	Matsunami	C024401
Agarose	Wako	318-01195
Polystylene Mikrokügelchen 0,1 Mikron	Polysciences	#00876
Wärmeblock	TAITEC	0063288-000	CTU-mini
Mikroskop	Olympus	IX-71	Weitfeldmikroskop
Spinning-Disk-Scanner	Yokogawa	CSU-X1	konfokaler Spinning-Disc-Scanner
Digitale CCD-Kamera	Hamamatsu Photonics	C10600-10B	ORCA-R2 degitale CCD-Kamera
Objektiv (x100, NA1.4)	Olympus	UPLSAPO 100XO
Pasteur-Pipette (5 Zoll)	IWAKI	IK-PAS-5P
Glasröhre (1,5 cm Durchmesser x 10,5 cm)	IWAKI	9820TST15-105NP
TV9211: wyIs251	Labor von Kang Shen	N/A
OTL11: mnIs17	Ref. 27, 29	N/A	SP2101 wurde 6-fach mit Wildtyp rückgekreuzt
Stereomikroskop	Carl Zeiss	435064-9000-000	STEMI 508
Spiegeldurchleuchtungseinheit	Carl Zeiss	435425-9010-000
Platindraht (0,2 mm)	Nilaco Corporation	m78483501
60 mm Kunststoffschale	Falcon	#351007
Fidschi	N/A	N/A
Nematoden-Wachstumsmedium (NGM)			1,7 % (w/v) Agarose, 50 mM NaCl, 0,25 % (w/v) Pepton, 1 mM CaCl2, 5 mg/ml Cholesterin, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4

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