Summary
Onlar insanlar kullanmak için kabul edilebilir önce kardiyak rejeneratif tıp roman tedavi stratejileri kapsamlı ve detaylı çalışmalar büyük preklinik hayvan modellerinde gerektirir. Burada, biz perkütan kontrast Ekokardiyografi güdümlü intramyocardial enjeksiyon tekniği Tavşanlarda, roman böyle tedavilerin etkinliğini test hipotez için değerli olan göstermek.
Abstract
Hücre ve gen tedavisi heyecan verici ve kalp yetmezliği ile kardiyak rejenerasyon ayarında amacıyla umut verici stratejileri düşük ejeksiyon fraksiyonu (HFrEF). Onlar kullanım için kabul ve insanlarda uygulanan önce geniş preklinik çalışmaları büyük hayvan modellerinde güvenlik, etkinlik ve bir kez Miyokardiyum teslim kaderi injectate (örneğin, kök hücre) değerlendirmek için gerekir. Küçük kemirgen modelleri (maliyet etkinliği, amenability genetik manipülasyon içinörneğin); avantaj sunar Ancak, bu modeller içerdiği sınırlamaları göz önüne alındığında, bu bulguların nadiren kliniğe çevirmek. Diğer taraftan, büyük hayvan tavşan gibi modellerinde avantajları (örneğin, insanlar ve diğer büyük hayvanlar ile karşılaştırıldığında benzer kardiyak Elektrofizyoloji), ederken iyi bir maliyet-etkin denge koruyarak. Burada, minimal invaziv, güvenli, iyi tolere ve injectates hücreleri de dahil olmak üzere, hedeflenen teslimat çok etkili bir perkütan kontrast Ekokardiyografi güdümlü intramyocardial enjeksiyon (ımı) teknik gerçekleştirme göstermek, bir tavşan modeli Miyokardiyum içinde birkaç adresleri girmiş. Bu tekniğin uygulanması için yaygın olarak kullanılan klinik Ekokardiyografi sistemin avantajı da aldık. Burada açıklanan protokol pratikte konulduktan sonra bir araştırmacı temel ultrason bilgisi olan bu çok yönlü ve minimal invaziv teknik deney, Hipotez testleri amaçlı, rutin kullanım için performans yetkili olacak tavşan modelindeki kardiyak rejeneratif therapeutics yeteneklerini. Tavşan anaesthetizing sonra yetkinlik elde sonra tüm prosedürü 25 dk içinde gerçekleştirilebilir.
Introduction
Hücre ve gen terapileri heyecan verici ve hiç HFrEF yaralı Miyokardiyum Yenileyici/onarmak için stratejiler geliştirmek. Bir kaç çalışmalar hücre teslim, ımı üstünlük intrakoroner veya intravenöz yol1,2 üzerinde tutarlı bir şekilde göstermiştir farklı yolların etkinliği (örneğin, hücre tutma oranı) karşılaştırıldığında var , 3 , 4 , 5. böylece, kök hücre tedavisi yaralı Miyokardiyum translasyonel modelleri üzerinde çalışmalar büyük bir kısmı injectate bir açık göğüs yordamı '6,7 doğrudan görünümü altında gerçekleştirilen ımı üzerinden teslim şaşırtıcı değildir . Ancak, bu yaklaşım peri-usul mortalite (genellikle altında bildirilen)8risk taşıdığını yordam invaziv yapısı dahil olmak üzere bazı sınırlamaları vardır. Buna ek olarak, doğrudan görünümü altında bir ımı ventrikül boşluğuna içine yanlışlıkla enjeksiyon için olasılığı ortadan kaldırmaz. Klinik pratikte bir ımı açık göğüs cerrahisi sırasında olabilir uygun bir yöntem'tedavi hücre dır, örneğin, sırasında koroner arter bypass greft cerrahisi (CABG); Ancak, bu yaklaşım içinde küresel kardiyomiyopati (örneğin, HFrEF Antrasiklin kaynaklı kardiyomiyopati (AICM) ikincil) iskemik olmayan menşe hücre teslimat için uygun olmayabilir.
Hiç şüphe yok ki bu iskemik kalp hastalığı (IHD) olduğunu HFrEF en sık nedeni olduğunu (~ % 66)9,10; ancak, Sigara iskemik kardiyomiyopati, AICM, dahil olmak üzere hala hasta HFrEF (% 33)9 ile önemli bir bölümünü etkiler . Nitekim, klinik Onkoloji son gelişmeler kanser ABD tek başına11, 10 milyondan fazla ölüm tahminler Avrupa'daki kanser hastaları12 geliştirilmiş yaşama doğru genel bir eğilim ile tutarlı benzer bir sayının ile sonuçlandı ,13. Böylece, kök hücre nakli olmayan iskemik kardiyomiyopati, hem de kök hücre teslimat etkili ve minimal invaziv bir rotanın trialing için son derece önemlidir gibi yeni tedaviler faydaları keşfetmek, verilen hastaların sayısının artması rastlantısal antikanser ilaçlar için ikinci tarafından etkilenen.
Not, Hipotez testleri kullanarak kök hücre tedavisi yaralı Miyokardiyum sık onarım/yeniden amaçlayan çalışmalar küçük kemirgen (örneğin, fare ve sıçanlar) kullanımını gerektirir. Bu modeller genellikle genellikle bazı içerdiği ilişkili sınırlamaları (örneğin, yankı)14olan doğrusal dizi dönüştürücüler ile donatılmış miyokard fonksiyon değerlendirilmesi için pahalı yüksek frekans ultrason sistemleri gerektirir. Ancak, tavşanlar, büyük preklinik modeli temsil gibi diğer modeller HFrEF kök hücre tedavilerin Hipotez testleri için bazı avantajları var. Böylece, sıçanlar ve fareler aksine, tavşan bir Ca+ 2 taşıma sistemi ve insan ve (diğer büyük hayvanlarörneğin, köpek ve domuz)15,16,17 benzer hücresel Elektrofizyoloji korumak ,18,19. Diğer bir avantajı, kardiyak ultrason görüntüleme nispeten ucuz kullanarak ve yaygın olarak kullanılan klinik Ekokardiyografi sistemleri gibi nispeten yüksek frekans faz dizi güç çeviriciler, örneğin, 12 MHz ile donatılmış için onların amenability olduğunu Bu sık kullanılan yenidoğan ve pediatrik Kardiyoloji. Bu sistemlerin en modern teknoloji ile mükemmel Ekokardiyografik görüntülemede izin ve harmonik20düşsel üstünlük yararlanmak. Ayrıca, potansiyel kardiyak rejeneratif terapileri (örneğin, kök hücre tedavisi), onların Emanet, etkinlik, cardiomyogenic potansiyel yanı sıra bir kez injectate kaderi değerlendirilmesi geniş Hipotez testleri teslim içine Miyokardiyum, zorunlu önce insan kullanım için kabul edilebilir ve onlar tavşan17,19gibi büyük preklinik hayvan modelleri kullanılmasını gerektirir. Burada, kök hücre nakli tabanlı tedavisi olmayan iskemik kardiyomiyopati20 için amaçlayan bir klinik Ekokardiyografi sistemi kullanarak perkütan kontrast-Ekokardiyografi destekli ımı ile hücre teslimat için minimal invaziv tekniği tarif . Ayrıca, injectate tavşan kalbinde bir ultrason kontrast Ajan ve in situ izleyici olarak çini mürekkebi (ını, Çin mürekkep olarak da bilinir) faydaları açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan deneyleri etik University of Murcia, İspanya, araştırma Komitesi tarafından onaylanmış ve Avrupa Komisyonu yönergesi 2010/63/AB uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Açıklanan adımları çalışmalarının planının bir parçası olduğunu ve yalnızca bu kağıt için beraberindeki video çekimi amacıyla gerçekleştirilen değil standart çalışma protokolleri altında yapıldı.
1. hücre ve memeli ifade vektör hazırlanması
Not: Burada, biz kısa bir süre için bir protokolü hazırlama ve transfection hücre satır (insan embriyonik böbrek 293 (HEK-293)); tarif Ancak, uygun hücreye belirli protokolleri faiz hücre türü için en iyi duruma getirilmiş (örneğin, kök hücre) olmalıdır.
- Korumak yüksek glikoz Dulbecco hücrelerde HEK-293'ın modifiye takıma % 10 fetal buzağı serum (FCS), % 1 sodyum pyruvate, 2 mM glutamin, % 1 penisilin/streptomisin ve oksijen bir atmosferde % 5 içeren 37 ° C'de inkübe kartal orta (DMEM) CO2 . Bir kez bir oranı 1:3 split alt Konfluent hücrelerdir.
- Yıkama bir kez steril fosfat ile serum fizyolojik (PBS) arabelleğe alınmış sonra medya, aspirating tarafından hücreleri bölme başlatmak, aşırı PBS kaldırmak ve sonra 2.5 mL tripsin-Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) (5 dk, 37 ° C) x 0,5 ile kuluçkaya.
- DMEM medya (yukarıda açıklandığı gibi takıma) bir birim eklemek reaksiyonu durdurmak ve sonra hücreleri yavaş yavaş ve nazikçe yukarı ve aşağı ile elektronik bir pipet alıyorum tarafından ayırmak için.
- Ardından, hücre süspansiyon (örneğin, 15-50 mL konik santrifüj tüpü) uygun bir kaba aktarın. Bir salıncak kova (100 x g) santrifüj kapasitesi, süpernatant atmak ve Pelet steril PBS ile iki kez yıkayın.
- Taze DMEM medya ve tohum bir uygun hücre yoğunluğu (örneğin, 1 x 106 hücrelerde bir 75 cm2 şişe), pelet taze kültür şişeler veya yerel laboratuvar uygulamaları göre büyük yemekler resuspend.
- Varolan ortam yerine taze medya ile 2 günde.
Not: İfade vektör pIRES1hyg türetilmiş ve üreticinin yönergelerine göre yukarıda açıklanan21kullanılır. p(EGFP) IRES1hyg EGFP cDNA gibi bir BamHI + NotI pEGFP-N1 BamHI ekler + NotI pIRES1hyg21sindirilmiş subcloning tarafından oluşturuldu.
- Varolan ortam yerine taze medya ile 2 günde.
- 1 gün önce transfection, tohum HEK-293 0.5 x 12 veya 24 iyi doku kültürü plakaları 105 hücreleri/cm2 yoğunluğu, hücreleri.
- Transfection günü, DNA-lipid transfection reaktif kompleksleri ayrı 1.5 mL microcentrifuge tüpler (1 tüp/de) hazırlayın.
- Başlatmak indirimli serum orta 250 µL her tüpün içine ekleyerek ve 4 µg DNA ekleyin (karışımı yavaşça).
- Daha sonra 250 µL 10 µL lipid transfection reaktif önceden hazırlanmış bir karışımı ve düşük serum orta, 250 µL her tüpün ekler (tekrar yavaşça karıştırın).
- Son olarak, DNA lipid transfection reaktif kompleksleri için 4 h, hücrelerle HEK-293 kuluçka tarafından transfections ile devam (yukarıdaki adım 1.1) açıklandığı gibi takıma DMEM orta yerine ve başka bir 48 h. gerçekleştir ilaç seçimi istikrarlı kuluçkaya transfectants ile 100 µg/mL hygromycin d.
- HEK-293 hücreleri (yukarıdaki adım 1.2) açıklandığı gibi tripsin ile bağlantısını kesin. Steril PBS hücrelerde yıkadıktan sonra 5 x 106/mL son hücre konsantrasyonu elde etmek için bir uygun araç içinde (örneğin, % 10 v/v ını PBS), resuspend.
2. tavşan hazırlanması
Not: Tavşan ve dönüştürücü ımı için konumlandırma morfoloji ve hayvan kalp fonksiyonu değerlendirmek için en uygun değildir. Böylece, deneysel tasarım tarafından tanımlanan bir tam Ekokardiyografik inceleme20 ımı (aşağıya bakın) önce ve sonraki zaman noktalarda gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Bu bir enjeksiyon almak ve ayrıca etkileri ımı kalp işlevindeki değerlendirmek temel anatomik ve fonksiyonel özellikleri kalbin hayvan olarak değerlendirmek amacı olacak.
- Kardiyovasküler görüntüleme için kör bir moda ve Amerikan Koleji veteriner iç hastalıkları ve Amerikan Derneği Ekokardiyografi/Avrupa Birliği Ekokardiyografi Komitesi yönergeleri izleyerek bu sınavın gerçekleştirmek 22 , 23 , 24.
- Aynı anda 1-kurşun Elektrokardiyogram (EKG) izleme bütün Ekokardiyografik çalışma boyunca elde etmek.
- Ketamin ile tavşan anestezi 10 mg/kg, medetomidine 200 µg/kg ile kas içi (sohbet) enjeksiyon kombine.
- Anestezi düzeyi 10-20 dk sonra Yönetim anestezi takip doğrulayın.
- Saç kesme makinesi kullanarak göğüs saç yaygın kaldırın (örneğin, alt xiphoid bölgesine boyun altında) (şekil 1A).
- 1-2 cm2 iç yüzüne doğru forelimb (mediocubital bölgesi) ve her iki arka bacaklarda (mediotibial bölgesi) ek bölgeler tıraş (şekil 1B).
- Kalp ritmi (şekil 1 c) işlemi sırasında zaman uyumlu olarak izlemek için bacaklarda traş bölgeler üzerindeki yapışkanlı ECG elektrotlar yer.
- Hayvan termal battaniye, dekübitus sırtüstü pozisyonda tabloya (şekil 1 c) bağlı cerrahi bant kullanarak uzanmış bacaklarda yerleştirin.
- Kulaklar geriye doğru tavşan ve bu prosedür boyunca hayvan Toraks doğru konumlandırma korumak için yardımcı olur bu yana, onun forelimbs düşük bir pozisyonda baş/arka arkasında fleksiyondayken emin olun.
- Hayvan kendiliğinden yüz maskesi tüm prosedürü (% 100, 2-3 L/dakika) boyunca tarafından oksijen yönetme ederken nefes sağlar.
Şekil 1. Tavşan hazırlanması için ımı. (A)klip saç Toraks; (B) küçük saç bacaklarda; (C) elektrotlar iliştirin ve termal battaniye üzerinde uzanmış bacaklar ile tavşan getirin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
3. perkütan kontrast Ekokardiyografi güdümlü ımı teknikte tavşan
- Temiz ve dezenfekte klorheksidin tabanlı bir çözümü ile Toraks cilt.
- Tüm prosedürü boyunca bir aseptik teknik göre geçerli en iyi yöntem kullanın.
- Mümkün olduğunda ve eğer makul uygulanabilir, dahil, ancak bunlarla sınırlı olmamak, önlük, eldiven, cerrahi yara perdeler, steril malzeme tablo gibi steril bir ultrason için giyinme gibi steril malzeme kullanımı tamamen steril bir yordamı gerçekleştirmek dönüştürücü kapak ve steril ultrason jeli. Bu minimumda patojenler ımı alma hayvan tanıtmaktan riski azaltacak ve klinik ortamda (örneğin, kardiyak ponksiyon sırasında) standart bir uygulamadır.
Not: Her zaman hayvan araştırma yerel kurum için ilgili yerel ve ulusal düzenlemelere ve ülke uygulama doğrultusunda devam etmek için önerilir.
- Ultrason iletim jel göğüs ve/veya dönüştürücü ve deneyci'nın boynuna dönüştürücü kablosu ile geçerlidir, bir kez anatomi görselleştirmek için ve için ımı planlamak için yararlıdır hayvan kalbi hızlı penceresi tarama gerçekleştirin.
- Dönüştürücü el ile 4th-6inci interkostal boşluk, 2-3 cm uzakta bir açı of insidansı doğru parasternal satırıyla yerleştirmekte ~ 90 ° ile ilgili torasik duvarın (şekil 2A) sağ tarafında.
- Dönüştürücü interkostal boşluk yanı sıra hastanın ve değiştirilmiş kısa eksen görünümü papiler kaslar düzeyinde en iyi duruma getirmek için dorsoventral açı göreli konumunu ayarlamak. Bu görünümde sağ ventrikül (RV), sol ventrikül (LV), interventricular septum (serum), posterior duvar (PW), hem de anterolateral (AL) ve posteromedial (PM) meme basinin Papiller kaslar (2B rakam) tanımlayın.
- Geniş bir görüş alanı (örneğin, düğme, arama) sistemindeki uygun denetimi kullanarak derinlik önemli ölçüde artırarak var.
- Bu görünüm, hem de uygun endocardial ve epicardial kontür farklılaşma simetrik bir görüntü elde etmek için özellikle dikkat ve gerekiyorsa (örneğin, kazanç) görüntü optimizasyon denetimler arasında ayarlayın.
- En iyi Ekokardiyografik görünümü (şekil 2B) alındığında, ımı (aşağıya bakın) ikinci bir işleç gerçekleştirir iken yordamı, geri kalan tüm bu pozisyonu koruyun.
- Dönüştürücü tutarak iken, her zaman ileri, böylece sonraki adımda (şekil 2A, C) iğne ile onun hizalama izin bakmalıdır dönüştürücü yönlendirme işareti gizlemek kaçının.
- 24-G iğne 1 mL şırınga bağlı bir dönüştürücü ile ilgili olarak simetrik bir yansıtma pozisyonda sol hemithorax cilt yakın iğne yerleştirin. Sonra el ile hizalamak dönüştürücü yönlendirme işareti bir açıyla iğneyle ~ 90° (şekil 2C) ve yavaş yavaş deri yoluyla ve göğüs boşluğu içine iğne ilerlemek.
Not: Bu pozisyon ve yönlendirme perkütan iğne ekleme (2D rakam, E), ultrason demetinin bir düzlemde iğne görselleştirme kolaylaştırır böylece gerçek zamanlı izleme izin ve gerektiğinde, düzeltilmesi İğneyi Miyokardiyum (Şekil 2 G, H) hedef bölgenin göreli konumu. - Hedef konumda ucu ile yavaş yavaş injectate teslim (ilâ enjeksiyon site başına 0.25 mL) 10-30 s (yavaş yavaş ve nazikçe iğneyi enjeksiyon sırasında Miyokardiyum kapsamını artırmak için geri çeker tedavi ederkenşekil 2E), içinde.
- INI kullanmak % 10 (v/v) PBS içinde tekniği ve in situ izleyici olarak standardizasyon Miyokardiyum içerisindeki tüm dört ımı sitelerin başarılı hedefleme onaylamak olarak yetkinlik, de elde ederken brüt patoloji ve histopatoloji (bkz: tarafından seyreltilmiş Temsilcisi sonuçları). Yetkinlik elde sonra ını uygun ticari ultrason kontrast Aracısı tarafından istenirse yerine.
Not: Teslimat % 10 (v/v) ını PBS içinde olan veya olmayan hücreleri transmural hyperechogenicity (Yani, yankı parlak görünüm) Miyokardiyum sonuçlarında içine enjeksiyon (şekil 2E, F) hedef sitede seyreltilmiş. İğne epicardium ile ilk kişiden bile sık sık gözlenen geçici yavaşlama veya ivme ile Prematüre Ventriküler kasılma (izoleörneğin, couplets ve üçüz) ilişkili nabız gibi sırasında ve/veya kısa bir süre sonra ımı. Ancak, hiçbir hayati aritmiler geliştirilmiştir ve akut yan etkiler nadiren gözlenen ımı enjeksiyon yeri kadar 0.25 mL (1,25 x 106 hücreler) injectate kullanarak (bkz: Temsilcisi sonuçları ve tartışma).
- INI kullanmak % 10 (v/v) PBS içinde tekniği ve in situ izleyici olarak standardizasyon Miyokardiyum içerisindeki tüm dört ımı sitelerin başarılı hedefleme onaylamak olarak yetkinlik, de elde ederken brüt patoloji ve histopatoloji (bkz: tarafından seyreltilmiş Temsilcisi sonuçları). Yetkinlik elde sonra ını uygun ticari ultrason kontrast Aracısı tarafından istenirse yerine.
- İnce değişiklikleri her (üç sol ventrikül duvar (LVFW) ve IVs birinde ücretsiz) dört hedef ımı siteler için 0.25 mL enjeksiyonlari tamamlamak için gereken iğneyi açı of insidansı gerçekleştirin.
- Perkütan kontrast Ekokardiyografi güdümlü ımı yordamı tamamladıktan sonra kalp ritmi (örneğin, seri ECG izleme ve/veya 24 saat Holter ECG yoluyla) değerlendirmek ve yokluğu doğrulamak için seri halinde pencere Ekokardiyografik taramalar komplikasyonlar, hayvan tam anestezi ve sadece sonra transfer bir ışık-siklet odasına kurtarılır kadar.
- Burada, 24 saat Holter ECG kalp ritmi 24 h için ımı ını ile etkilerini izlemek için kullanın. Bunun için biz bir grup normal fenotip (Normal grup) ile 6 tavşan ve doksorubisin (bir Kardiyotoksik Antrasiklin ilaç kanser; tedavisinde yaygın olarak kullanılan, intravenöz yönetimini alınan 6 tavşan bir grup göre DOX grubu) adlı bir doz 2 mg/kg/hafta 8 hafta ve daha sonra her iki birlik için ımı ile ını aldı.
Resim 2 . Perkütan kontrast Ekokardiyografi güdümlü intramyocardial enjeksiyon in tavşan. Dönüştürücü bir açıyla doğru hemithorax içinde(a)yerleşimini ~ 90 °. (B) temsilcisi görünümünün resmi bir parasternal kısa eksen (PSSX) kalbin tavşan Papiller kaslar düzeyde. (C) hizalama iğne bir açıyla ~ 90 ° dönüştürücü yönlendirme işareti göre. Kalp (iğne ultrason ışın düzlemde kolayca görselleştirildiği Not) PSSX görünümünde hedef sitede iğne (D) konumu. (E ve F) hyperechogenicity intramyocardial enjeksiyon üzerine hedef sitede gösteri çini mürekkebi (ok uçları vurgulamak transmural hyperechogenicity) ile. (G) LV odası iğneyi yanlışlıkla konumunu (ok uçları vurgulamak İğne mili). (H) Repositioning LV ücretsiz duvara iğne (ok uçları vurgulamak İğne mili). RV sağ ventrikül; = LV sol ventrikül; = Serum interventricular septum; = PW = posterior duvar; AL anterolateral Papiller kas; = PM posteromedial Papiller kas =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
4. mesaj ımı analizleri
- Histopatolojik analiz kalp doku örnekleri tavşan gerçekleştirin.
- Doku 24 h için % 10 formaldehit, aşağıdaki gibi etanol konsantrasyonları artan su kaybı ardından fix:
• 1 x % 70 (60 dk)
• 1 x %95 ethanol/5% metanol (60 dk)
• 1 x %100 (60 dk)
• 1 x %100 (90 dakika)
• 1 x %100 (120 dk)
Not: Yukarıdaki incubations oda sıcaklığında (RT) yapılmaktadır. Sonra iki kez % 100 Ksilen (1 h, RT) ile yerine ve nihayet iki adım (60 dk, 58 ° C)25parafin gömülecek. - 4-5 µm doku bölümleri microtome25ile gerçekleştirin. Bölümler slaytlarda bağlayın.
- Hematoksilen-Eozin ve Masson'ın trichrome yöntemleri25,26,27ile boyama gerçekleştirmek.
- Doku 24 h için % 10 formaldehit, aşağıdaki gibi etanol konsantrasyonları artan su kaybı ardından fix:
- Transplante kalpler gelen doku bölümünde EGFP(+) HEK-293 hücreleri (avidin-biotin karmaşık (ABC) yöntemini kullanarakörneğin,), kısaca algılamaya immünhistokimya gerçekleştirmek:
- 4-5 µm kalınlığında kalp bölümlerde % 100 Ksilen (10 min, RT,) de-balmumu. Etanol konsantrasyon Çözümleri (2 x %100 (2 dk); 2 x %95 (2 dk); % 70 (2 dk) 1 x; % 50 (2 dk) 1 x; %30 (2 dk) 1 x; 1 x ddH2O (2 dk)) RT. azaltılarak yıkayarak doku suyla temasa
- Endojen peroksidaz inhibisyon seyreltilmiş metanol (kadar 5 mL % 30 hisse senedi çözeltisi H2O2ve ekleme metanol ile hazırlanmış, toplam hacmi 50 mL için) () içinde % 3 H2O2 100 µL ile bölümlerini kapsayan tarafından gerçekleştirmek «««kuluçkaya) 30 dk, RT ve o zaman Tris tamponlu tuz (TBS; pH 7,6) ile daldırma tarafından yıkama.
- %0,1 100 µL ile bölümlerini kapsayan tarafından enzimatik tedavi yolu ile antijen maskesini gerçekleştirmek (0,01 g 10 mL TBS seyreltilmiş Pronase ile hazırlanmış) Pronase (12 dk, RT kuluçkaya), sonra TBS (5 dk, RT) ile yıkayın.
- Çözüm (TBS % 10 normal keçi serum) engelleme kuluçkaya başına 100 µL kullanarak (30 dk, RT) slayt ve TBS (5 dk, RT) ile yıkayın.
- Tavuk Anti-yeşil floresan protein (GFP) ile (1 h, 30 ° C) birincil antikor (TBS 1:500) olarak kuluçkaya ve TBS (5 dk, RT) ile yıkayın.
- Tavukla ikincil antikor biotinylated keçi-anti-IgG (TBS 1:250) (1 h, 30 ° C) kuluçkaya ve TBS (5 dk, RT) ile yıkayın.
- Avidin-biotin Kompleks (20 dk, 30 ° C) kuluçkaya ve 3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (RT, 5-10 dk) kullanarak etiketleyin.
- Son olarak, tarafından etanol konsantrasyonları (1 x %30 (2 dk); % 50 (2 dk) 1 x; % 70 (2 dk) 1 x; 2 x %95 (2 dk); 2 x %100 (2 dk)) RT, Hematoksilen-Eozin yöntemi25kullanarak counterstain bölümlerde artan çamaşır kurutmak ve kapak slaytlar bağlayabilirsiniz. Pozitif, negatif yanı sıra izotip denetimleri içerir.
Not: yukarıda açıklanan kısa protokol genel immünhistokimya kullanım için tasarlanmamıştır; optimizasyon doku faiz ve koşullar için gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Perkütan kontrast Ekokardiyografi güdümlü ımı ını ile:
Yukarıda açıklanan iletişim kuralını kullanarak ve sonra iğne ucu en iyi konumlandırma Ekokardiyografi ve yerleştirme başlatıldı tarafından doğrulandı, transmural hyperechogenicity ını teslim sırasında gözlendi (% 10 PBS, v/v) (şekil 2E) , ımı (şekil 2F) hedef bölgesine de olarak kısa bir süre sonra. IMI hemen ötenazi tarafından izledi ve kalp kaldırıldı, ını mevduat kolayca görülebilir (şekil 3A) kalp dış inceleme üzerine idi. Ayrıca, kalp doku kesitler, örneğin, kısa eksen bölüm düzeyinde Papiller kas (şekil 3B), böylece başarılı ve etkili teslimini gösteren enjeksiyon yerinde ını boya transmural yatakları ortaya Bu tekniği kullanarak Miyokardiyum içine injectate. Belirtmek gerekirse transmural hyperechogenicity ını, transmural yataklarında ex vivo örnekler (şekil 3A, B) ile iyi korelasyon ımı (şekil 2E, F) sırasında vivo içinde görülmektedir. Bu açıkça ını ımı ayarında çift özellikleri vardır gösterilmiştir: vivo ultrason kontrast ajanı gibi bir ex situ vivoin izleyici olarak. Bu özelliklerin ikisi de ını özellikle eğitim sırasında bu teknik yetkinlik edinimi için çok yönlü ve ucuz ultrason kontrast Ajan olun. Böylece, ını echogenic özelliklerini yardımcı ımı örneğinizlemek için yapmak için gerçek zamanlı görüntüleme yetenekleri, ultrason, verilen başarılı ımı yanlışlıkla Intra-odası veya Perikardiyal alanı enjeksiyon karşı ve, gerektiğinde, belirlemek düzeltmeler iğne (Şekil 2 g, H) gerçek zamanlı olarak izleyebilirsiniz. Öte yandan, ını in situ izleme yeteneklerini değerli injectate hedef Miyokardiyum ex vivo örnekleri bulmak için.
Perkütan kontrast ımı ını ve EGFP(+) HEK-293 hücrelerle Ekokardiyografi güdümlü:
IMI önce başarılı transfection EGFP(+) HEK-293 hücre vitro kültür koşullarında (şekil 3 c) floresan mikroskopi tarafından teyit edildi. Miyokardiyum içine EGFP(+) HEK-293 hücre teslim başarılı kalp doku bölümleri nerede ını mevduat gözlendi immünhistokimya analizi ile gösterilmiştir. Böylece, avidin-biotin karmaşık yöntem kullanarak (bkz. Adım 4.2), bol EGFP(+) HEK-293 hücreleri ını mevduat (şekil 3D) ile serpiştirilmiş Miyokardiyum içinde tespit edildi. INI mevduat hala 24 saat sonra ımı miyokard doku örneklerinde ını EGFP(+) HEK-293 hücreleri (şekil 3E) ile birlikte veya INI yalnız (şekil 3F) alınan tavşan üzerinden tespit edildi. Not, bir akut enflamatuar yanıt örneklerinde EGFP(+) HEK-293 hücreleri (3E rakam), böylece akut hücresel ret öne alma hayvanlardan baskın Nötrofilik infiltrat ile bu zamanda noktada gözlendi. Öte yandan, makrofajlar ını yalnız (şekil 3F) alma hayvanlarda tespit edildi.
Şekil 3 . Situ makroskopik ve histopatolojik değerlendirme ve izleme injectate. (A)gösteri ımı (ok uçları ekleme siteleri Vurgula) ını ile takip çıkarılan bir kalp dış muayene injectate varlığı. (B) gösteri ımı ını enine bir bölümü olan papiler kaslar düzeyde kalp ile takip injectate transmural dağılımı (mavi ok uçları vurgulamak transmural ını mevduat; beyaz ok görünür bir depozito vurgulamaktadır INI IVs adlı). (C) Autofluorescence vitro Floresans mikroskobu kullanılarak EGFP(+) HEK-293 hücre. (D-F) Eklenen siteler histopatolojik analizi. EGFP(+) hücreleri gözle görülür ını mevduat içinde Miyokardiyum 0 h (D) ile serpiştirilmiş olan ve 24 h (E) posta IMI (mavi ok uçları EGFP(+) hücreleri vurgulayın; Kırmızı oklar nötrofil varlığı vurgulayın). INI mevduat serpiştirilmiş ımı ını yalnız ile takip Miyokardiyum 24 h (F) içinde (mavi oklar vurgulamak makrofajlar varlığı). RV sağ ventrikül; = LV sol ventrikül; = Serum interventricular septum; = IMI Intramyocardial enjeksiyon; = INI çini mürekkebi =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
60 perkütan kontrast Ekokardiyografi güdümlü ımı yordamlar bugüne kadar gerçekleştirilen, biz inanıyoruz dikkatli dikkat detay ve iyi hayvan işleme ve bakım prosedürü genellikle iyi tolere edilir ve akut komplikasyonlar çok nadirdir ve genellikle hafif. IMI, en sık gözlem sırasında geçmesi ve sonra kısa bir süre geçici hızlanma veya kalp hızının yavaşlama işlemdir izole Prematüre Ventriküler kompleksleri (PVC) (şekil 4A) ile ilişkili genel olarak, hayvanlarda. Böylece, 24 saat Holter ECG ını ımı ile tek başına alınan hayvanların izleme ortaya tespit en sık aritmi (Bölüm 24 saat içinde toplam sayısı) olduğunu izole PVC, düz-se bile daha yüksek bir sayı bölüm olan hayvanlarda tespit edildi daha önce DOX ile 8 hafta (şekil 5A) tedavi. PVC couplets ve üçüz gibi görünüyor üçüz önemli ölçüde daha az olmasına rağmen daha az sıklıkla (şekil 4B, C ve şekil 5B, C), sık sık DOX-tedavi daha işlenmemiş Normal tavşanların (şekil 5C). Öte yandan, sürekli olmayan Ventriküler Taşikardi (NSVT) daha sık Normal hayvanlarda gözlendi (şekil 4 d ve şekil 5 d). Önemli ölçüde, ortalama kalp hızı ile ını yalnız (şekil 5E) ımı aldıktan sonra DOX ve Normal grupları arasında farklı değil iken, normal R-R aralığı (SDNN), standart sapması önemli ölçüde düşürüldü (< 100 ms) DOX grup (içinde) Şekil 5F). SDNN non-lineer kalp sağlık durumu ölçüsüdür, ve bu nedenle bu sonuç DOX Grup küresel değişiklikler kardiyak fizyolojik durumunu gösterir.
Şekil 4. Ventriküler Aritmiler gözlenen Tavşanlarda ımı ını ile alınan 24 saat Holter izleme sırasında. Gösterilen ekran Holter EKG tachograms elde edilen görüntüleri çevrimdışı Çözümleme sırasında ekranda ve aritmiler izleme 24 h sırasında bulunan en yaygın türlerinden temsilcisi örnekler göstermektedir. (A) izole PVC. (B) PVC Couplets içinde. (C) PVC üçüz içinde. (D) NSVT. PVC Prematüre Ventriküler kasılma; = NSVT ventriküler taşikardi olmayan sürekli =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 . İçinde tavşanlar ımı ile ını takiben 24 saat Holter ECG izleyerek tespit aritmik olaylar. İzole PVC(a)PVC couplets (B), üçüz, (C) PVC içinde toplam sayısı ve NSVT (D), doksorubisin tedavi ve tedavi edilmezse tavşanların (Normal + IMI) (3 mg/kg/hafta 6 hafta boyunca) tavşan (DOX + IMI), ımı ını ile sonra. Kalp hızı (E) demek ve SDNN (F), tavşanların Normal + IMI ve DOX + IMI IMI ını ile sonra. Verileri ortalama ± SEM ifade edilen * p < 0,05; gösterir ve # gösterir p < 0,01, karşılaştırma Normal + ımı DOX + ımı karşı gruplar tarafından t-test. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tavşan (bir büyük ölçekli preklinik hayvan modeli)17,18, Miyokardiyum içine kök hücrelerin tesliminde kullanımı yararlanan ederken kullanılabilecek bir minimal invaziv tekniği geliştirmek için birincil hedefi oldu bir nispeten ucuz görüntüleme sistemi birçok klinik kullanıma hazır ve araştırma merkezleri. Burada, biz, bir klinik Ekokardiyografi sistemi kullanarak göstermek ve ını, in situ izleme yetenekleri ve echogenic özellikleri, başarılı perkütan kontrast Ekokardiyografi güdümlü ile yaygın olarak kullanılan bir ajan tarafından destekli ımı çok etkilidir injectate kalp tavşan hedef bölgeleri için teslim. Bildiğimiz gibi bu bir perkütan kontrast Ekokardiyografi güdümlü ımı ve hücre teslim tavşan18,19gibi büyük bir hayvan modelinde ilk açıklaması bulunur. INI daha önce çalışmalarda injectate dokularda7,28içinde situ yerelleştirme için kullanılmıştır, bu bizim bilgi, bu Ajan çift özelliklerini ilk açıklamalar bir in vivo olarak iken Ultrason kontrast Ajan ve injectate ex vivove in situ izleyici olarak. Gerçekten de, karmaşık karışımları kontrast ajanlar ve in situ maddeler daha önce izleme Miyokardiyum29injectates teslim amaçlı fare çalışmalarda tarif edilmiştir. Ancak, ını ve in situ izleme yeteneklerini echogenic özelliklerini göz önüne alındığında, bu madde yetki alma sırasında bu tekniği ile eğitim gören iken çok yararlı olacaktır.
Her iki InI de içeren injectate teslimini onayı EGFP(+) HEK-293 hücreler olarak immünhistokimya kullanarak bu teknik preklinik araştırma kök hücre tedavisi amaçlı uygulanabilirliği gösterir. Bir akut enflamatuar yanıt baskın Nötrofilik infiltrat ile akut hücresel ret (24 saat içinde) bir yanıt xenogeneic hücrelere düşündüren bir ımı, ını birlikte EGFP(+) HEK-293 ile sonuçlandı. Bu yanıtı muhtemelen immün hayvan şaşırtıcı değil. Öte yandan, bir ımı ını yalnız ile aynı zamanda bir akut enflamatuar yanıt (24 saat içinde) bir baskın makrofaj infiltrat sergilenen tedavi miyokard doku, elde edildi. Bu bir açık göğüs yordamı4,30,31,32,33doğrudan görünümü altında ımı takip önceki çalışmalarda akut iltihap gözlem paralel olarak tanımlanır. Akut iltihabı da enjeksiyon Miyokardiyum34,35ve36sıçan gastroknemius kas içine bile normal salin veya PBS çözümler üzerine görülmüştür ve bu nedenle bu yanıt olmuştur doğrudan doku yaralanması yerine injectate başınaatfedilen. 30 , 31 , 32 , 34 , 35 , 36 Nitekim, uluslararası toplum için kardiyovasküler translasyonel araştırma inflamasyon ımı ortamında ortak olay kabul eder ama ya da değil olup hiçbir fikir birliği yoktur bu süreçte azaltmak için önlemler Peri-prosedür sırada yararlı (örneğin, intravenöz (IV) kortikosteroidler)37. Bu çalışmada iltihabı da doku hasarı yönlendirmek için atfedilen rağmen sonuçları de yabanci bir cisim de makrofajlar bir dizi sağlanan bu süreçte bir rol oynaması gerektiğini gibi ını ını (şekil 3F) phagocytizing görünüyor öneririz. Bu akut iltihabı kalp içinde ımı için ikincil fonksiyonel etkilerini ayrıntılı bir analiz veya olsun veya olmasın bunlar üzerinden yönetim kortikosteroidler gibi profilaktik ilaçların iyileştirmiştir bu yazının kapsamı dışındadır. Yine de, perkütan kontrast Ekokardiyografi güdümlü ımı Miyokardiyum dört hedef bölgelere kadar 0.25 mL (1,25 x 106 hücreler) ımı site, başına injectate hacmi ile çok iyi tavşan tolere.
Tarih ve yetkinlik elde edildi sonra gerçekleştirilen 60'tan fazla yordamlarda yordam için ikincil ölüm çok düşüktü. Örneğin, ölüm yok adım 3.9 (Normal ve DOX gruplar)'ımı sonra açıklanan iki tabur oluştu. Gerçekten de, 67 ımı yordamlar bir devam eden araştırma programı kapsamında gerçekleştirilen sonra bugüne kadar biz sadece doğrudan ilgili yordamı (% 2,9 mortalite) iki ölenler oldu. Diğer klinik nörolojik belirtiler, akut serebral iskemi böylece gerektiren bir cardioembolic olay için ikincil ile tutarlı geliştirilen iken bunlardan birinin içinde post mortem muayene içinde bir hemopericardium varlığı gösterilmiştir bir insana ilişkin son nokta. Bu ölüm oranı (% 2,9) önemli ölçüde Lu vd tarafından bildirilen daha düşüktür (% 11)8 ve Mu et al. (% 27)38, Tavşanlarda bir açık göğüs yordamdaki doğrudan görünümü altında ımı aldı. Böylece, güvenli olması için geçerli çalışma odasında açıklanan yordam göz önünde bulundurun ve biz kök hücre tabanlı terapi AICM bir tavşan modeli umut verici sonuçlar39,40ile değerlendirmek için devam eden çalışmalarda bu tekniği kullanıyor.
Orada birkaç kritik noktaları perkütan için başarılı bir kontrast Ekokardiyografi güdümlü ımı. Öncelikle, parasternal kısa eksen görünümü papiler kaslar düzeyinde net bir endocardial ve epicardial kontür ile elde edilir emin olun. Daha sonra iğne ucu bu göğüs boşluğu ve yanlışlıkla Perikardiyal boşluk veya LV odası içine engelleyecek Miyokardiyum girdiğinde her zaman görüş alanı içinde olduğundan emin olun. Sonra bu yerel travma (örneğin, yırtılma) olasılığını arttırabilir bu yapılar ve ilişkili risk bu yana pasajlar göğüs boşluğu ve kalp zarını ve Miyokardiyum, içine sayısı minimumda tutun emin olun hemopericardium. Bunun için iğne göğüs boşluğunda (ve visseral kalp zarını (örneğin, yan duvar) girişte aynı noktada bazı hedef siteleri için) muhafaza ederken dikkatli bir şekilde iğneyi açı of insidansı ince değişiklikleri gerçekleştirmek. Son olarak, her zaman göğüs boşluğuna böylece kaçınarak künt iğne eğim Miyokardiyum girme ve önemli hasara neden olan cilt açık ve kolay bir geçitle bir iğne kullanın.
Burada, açıklanan yordamı sadece Miyokardiyum içinde birkaç hedef siteleri için injectate güvenilir ve başarılı teslim sağlar, ancak gerçek zamanlı olarak böylece yanlışlıkla intrachamber teslim (önleme, aynı zamanda iğne yörünge düzeltme izin verir Şekil 2 g, H). Kapalı iken göğüs ımı yordamlar tarif edilmiştir daha önce fareler, bu küçük hayvan modeli için doğal bazı sınırlamaları vardır. Bu sınırlamaları terapiye mükellef Miyokardiyum hedef bölgeleri ve düşük birim/hedef sitesi29,41enjekte edilebilir hücre sayısı sayısını içerir. Buna ek olarak, doğru injectate teslimini kez başarı oranı % 60-7042, yakın bir endişe ve bu nedenle daha az yaygın olarak kullanılan yüksek frekans ultrason sistemlerinin kullanımı genellikle gerekli29,41, 42. Bu sistemler aynı zamanda içerdiği görüntüleme sınırlamaları olan doğrusal dizi güç çeviriciler ile donatılmıştır (örneğin, yankı olduğunu sık sık bir artifakı)14. Başka bir fare ve sıçanlar, gibi küçük kemirgen modelleri kısıtlamasıdır Ca+ 2 taşıma sistemi ve bu insan ve köpek, domuz ve tavşan gibi büyük ölçekli hayvan modeller farklı hücresel Elektrofizyoloji kendi içsel farklılıklar 15,16,43. Bu sınırlamalar kez tercüme bu modellerinde bulgular klinik büyük bir hayvan modeli önceden onay olmadan içine zorlukları oluşturun.
Dikkatli hayvan peri-usul dönemde izleme laboratuvar hayvanlarının bakımı için çağdaş esaslarına göre zorunludur. Burada gösterildiği gibi bu seri ekokardiografi pencere taramaları ECG tracings, tarafından en az yapılabilir ve hayvanın anesteziden uyanık olana. Kalp ritmi ımı akut etkisi ayrıca 24 saat Holter ECG tarafından izlenebilir ve bizim standart bir uygulama. Belirtmek gerekirse en sık aritmiler izole edildi hangi doğada göreceli olarak iyi huylu ve doksorubisin ımı ını ile önce ile tedavi hayvanlarda daha yaygın olan PVC, (bkz: şekil 4A ve şekil 5A). Nispeten daha az sıklıkla diğer aritmi içerir: PVC couplets; PVC üçüz içinde; yanı sıra NSVT (bkz: şekil 4B-D ve şekil 5B-D). Ancak, hiçbir hayat tehdit edici aritmiler sürekli ventriküler taşikardi gibi tespit edildi. Not, Ayrıca bazı Kardiyotoksik tezahürlerini DOX grubunda Holter izleme, kalp hızı değişkenliği (HRV) SDNN gibi zaman frekans etki alanı değişkenler kullanarak EKG tarafından algılanan bulduk. Böylece, bir düşük SDNN (şekil 5E, F), non-lineer ölçüsüdür kalp sağlık durumu, Normal gruba göre DOX grubunda gözlendi. Bu azaltılmış HRV, ilk rapor azaltılmış bir SDNN tarafından gösterildiği gibi bir tavşan bağlamında HFrEF44 olan hastalarda kardiyak ölüm bir güçlü bağımsız tahmin SDNN azaltılmış gözlem doğrultusunda AICM modeldir ,45,46. SDNN içinde değişiklikler DOX grubunda ımı yordamına ile ilgili değildir muhtemelen; Yine de, bu bulgular Tavşanlarda doksorubisin, hem de ımı, almazsınız normal hayvan alma onayı gereklidir. HFrEF içinde azaltılmış SDNN da olabilir olup olmadığı ve geliştirilmiş göre kök hücre tedavisi, yararına bir vekil ölçüsü olarak değerlendirilecek, bu nedenle kullanılan ve gelecekteki araştırma odak noktası olacaktır.
Kalbine hücre, teslimat birkaç yolları, şarapla, intrakoroner ve intramyocardial teslim de dahil olmak üzere araştırılmalıdır; Ancak, burada, kullanılan gibi intramyocardial yol sürekli olarak göstermiştir hücre tutma oranları1,2,3,4,5,37en iyi düzeyde. Biz değil değerlendirmek hücre tutma oranı burada anlatılan çalışmalarda kullanılan metodoloji sağlam ve bu vivo içinde veya ex vivo, bu çalışmanın bir sınırlama olan quantitate özgüdür değil gibi. Bunun yerine, biz EGFP(+) HEK-293 hücreleri olan fenotipik özellikleri kolayca Miyokardiyum bu hücrenin varlığı ayırımcılık için bize izin verdi böylece başarılı intramyocardial teslim gösteren kullanılır. Ancak, temel amacı sayede içine bir büyük ölçekli preklinik ve modelini olmayan iskemik kardiyomiyopati Miyokardiyum ımı ve hücre teslimat gerçekleştirebilen bir minimal invaziv teknik geliştirmekti. Perkütan tarafından ilk kez kontrast için Ekokardiyografi güdümlü ımı, Şekil 2 ve şekil 3' de gösterildiği gibi bu başarılı oldu. Daha fazla çalışmaları hücre tutma oranı yanı sıra kök hücrelerin yararlı etkileri burada açıklanan yordamı kullanarak Miyokardiyum teslim herhangi bir potansiyeli değerlendirmek için gerekli olan; Bu çalışmalar halen devam etmektedir. Biz son zamanlarda fonksiyonel etkileri39,40açısından umut verici sonuçlar tebliğ.
IMI için bir açık göğüs yordamda, Ekokardiyografi güdümlü bir perkütan kontrast bu çalışmada, ımı büyük preklinik modelinde açıklanan önemli ölçüde daha az invaziv doğası ile Hızlı Kalkınma aşağıdaki yordamı hayvan ve olarak karşılaştırılır Yukarıda belirtildiği gibi aynı zamanda düşük mortalite oranı8,38var. Ayrıca preklinik modelleri ve birkaç küçük klinik test edilmiş kateter tabanlı ımı ımı başka bir yaklaşımdır (bir reklam için bkz: Sheng vd.) 47. bu yaklaşımı ile bir kateter LV boşluğuna gelişmiş ve hedef sitelerde endokard içinde konumlandırılmış. Bu hedef siteleri de kontrast kardiyak manyetik rezonans görüntüleme (CMR)48, kullanarak örneğin, prosedür öncesinde veya sırasında yordamın e.g., elektromekanik endocardial eşleştirilmesiyle (EEM), tanımlanan açıkça üzeresiniz enjeksiyon49önceki uygulanabilir Miyokardiyum ayırt etmek. Bu ikinci yaklaşımı daha az invazif göğüs ımı açık bir avantaj olan doğrudan görünüm altında açmak için karşılaştırılır. IHD insanlarda bir düzensiz dağılımı olduğundan, Ayrıca, EEM IHD ayarında özellikle önemli olan tedavi özellikle Miyokardiyum uygun siteleri için doğrudan yardımcı olur. Ancak, tüm ımı yaklaşımlar ortak bir özelliği olan Ventriküler Aritmiler, indüksiyon büyük bir dezavantaj olduğunu. Diğer dezavantajları EEM yoğun eğitim ve ilişkili bir kardiyak perforasyon riski gerektiren son derece zorlu bir tekniktir sağlayan uzun yordam süreyi belirtin. Buna ek olarak, perkütan kontrast Ekokardiyografi güdümlü bu çalışmada, ımı olarak açıklanan teknik olarak daha az kateter tabanlı ımı daha talep, yetkinlik elde sonra o güvenli bir şekilde 25 dk içinde anestezi sonra gerçekleştirilebilir var... Benzer şekilde, iğne yalnızca kısa bir bölümünü Miyokardiyum gelişmiş beri orada 's kardiyak perforasyon, daha düşük bir risk kardiyak yırtılma hala mümkündür.
Sonuç olarak, bu çalışmada tavşan16,43gibi büyük bir hayvan modelinde açıklanan perkütan kontrast Ekokardiyografi güdümlü ımı güvenli, iyi tolere ve injectate içine teslim etkili tekniktir kalp. Bu nedenle, olmayan iskemik kardiyomiyopati (örneğin, AICM), kardiyak rejeneratif therapeutics etkilerinden preklinik Hipotez testleri için umut verici bir strateji oluşturan dahil ancak bununla sınırlı olmamak üzere, kök hücre tabanlı terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Sheila Monfort, Brenda Martínez, Carlos Micó, Alberto Muñoz ve Manuel Molina EGFP(+) HEK-293 hücreler sağlamak için veri ve Carlos Bueno toplanması sırasında sağlanan mükemmel destek için teşekkür ederiz. Bu eser kısmen tarafından desteklenmiştir: Fundación Séneca, Agencia de Ciencia y Tecnología, Región de Murcia, İspanya (JT) (izni numarası: 11935/PI/09); Red de Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Redes, VI PN de ben + D + ben 2008-2011 (vermek yok. RD12/0019/0001) (JMM), ortak finanse yapısal fon ile Avrupa Birliği'nin (FEDER,) (JMM); ve okuma Üniversitesi, Amerika Birleşik Devletleri (AG, GB) (Merkez fon). Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HD11 XE Ultrasound System | Philips | 10670267 | Echocardiography system. |
| S12-4 | Philips | B01YgG | 4-12 MHz phase array transducer |
| Ultrasound Transmision Gel (Aquasone) | Parket laboratories Inc | N 01-08 | |
| Vasovet 24G | Braun | REF 381212 | over-the-needle catheter |
| Omnifix-F 1 ml syringe | Braun | 9161406V | |
| Imalgene (Ketamine) | Merial | RN 9767 | Veterinary prescription is necessary |
| Domtor (Medetomidine) | Esteve | CN 570686.3 | Veterinary prescription is necessary |
| Heating Pad | |||
| Faber-Castel TG1 | Faber-Castel | 16 33 99 | India (China) Ink |
| Holter Syneflash | Ela medical | SF0003044S | 24 h Holter ECG system. |
| Electrodes Blue Sensor® | Ambu (NUMED) | VLC-00-S | Holter ECG electrodes. |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2155 | |
| Microscope | Olimpus | CO11 | |
| ABC Vector Elite | Vector Laboratories | PK-6200 | Avidin Biotin Complex Kit. |
| Chicken anti-GFP antibody | Invitrogen | A10262 | Primary antibody. |
| Biotinylated goat-anti-chicken IgG Antibody | Vector Laboratories | BA-9010 | Secondary Antibody. |
| 3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | DAKO (Agilent) | S3000 | |
| Fluorescence Microscope | Carl Zeiss MicroImaging |
Zeiss AX10 Axioskop | |
| Holter ECG | Elamedical | Syneflash SF0003044S | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Fisher Scientific | 11965084 | |
| 10% fetal calf serum (FCS) | Fisher Scientific | 11573397 | |
| 0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent) | Fisher Scientific | 11668019 | |
| Reduced serum medium (Opti-MEM) | Fisher Scientific | 31985070 | |
| Hygromycin B | Calbiochem (MERCK) | 400051 | |
| Xylene (histological) | Fisher Scientific | X3S-4 | |
| Hydrogen Peroxide Solution (H2O2) | Sigma | H1009 | |
| Pronase | Fisher Scientific | 53-702-250KU |
References
- Hou, D., et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation. 112, I150-I156 (2005).
- Freyman, T., et al. A quantitative, randomized study evaluating three methods of mesenchymal stem cell delivery following myocardial infarction. Eur Heart J. 27, 1114-1122 (2006).
- Perin, E. C., et al. Comparison of intracoronary and transendocardial delivery of allogeneic mesenchymal cells in a canine model of acute myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 44, 486-495 (2008).
- Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4, 177-181 (2011).
- Li, S. H., et al. Tracking cardiac engraftment and distribution of implanted bone marrow cells: Comparing intra-aortic, intravenous, and intramyocardial delivery. J Thorac Cardiovasc Surg. 137, e1221 1225-1233 (2009).
- Shiba, Y., et al. Human ES-cell-derived cardiomyocytes electrically couple and suppress arrhythmias in injured hearts. Nature. 489, 322-325 (2012).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
- Lu, C., et al. Autologous bone marrow cell transplantation improves left ventricular function in rabbit hearts with cardiomyopathy via myocardial regeneration-unrelated mechanisms. Heart vessels. 21, 180-187 (2006).
- McMurray, J. J., et al. ESC guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure 2012: The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Acute and Chronic Heart Failure 2012 of the European Society of Cardiology. Developed in collaboration with the Heart Failure Association (HFA) of the ESC . Eur J Heart Fail. 14, 803-869 (2012).
- Sueta, C. A. The life cycle of the heart failure patient. Curr Cardiol Rev. 11, 2-3 (2015).
- Carver, J. R., et al. American Society of Clinical Oncology clinical evidence review on the ongoing care of adult cancer survivors: cardiac and pulmonary late effects. J Clin Oncol. 25, 3991-4008 (2007).
- Verdecchia, A., et al. Recent cancer survival in Europe: a 2000-02 period analysis of EUROCARE-4 data. Lancet Oncol. 8, 784-796 (2007).
- De Angelis, R., et al. Cancer survival in Europe 1999-2007 by country and age: results of EUROCARE--5-a population-based study. Lancet Oncol. 15, 23-34 (2014).
- Abu-Zidan, F. M., Hefny, A. F., Corr, P.
- Del, M. F., Mynett, J. R., Sugden, P. H., Poole-Wilson, P. A., Harding, S. E. Subcellular mechanism of the species difference in the contractile response of ventricular myocytes to endothelin-1. Cardioscience. 4, 185-191 (1993).
- Pogwizd, S. M., Bers, D. M. Rabbit models of heart disease. Drug Discov Today Dis Mod. 5, 185-193 (2008).
- Gandolfi, F., et al. Large animal models for cardiac stem cell therapies. Theriogenology. 75, 1416-1425 (2011).
- Harding, J., Roberts, R. M., Mirochnitchenko, O. Large animal models for stem cell therapy. Stem Cell Res Ther. 4, 23 (2013).
- Chong, J. J., Murry, C. E. Cardiac regeneration using pluripotent stem cells--progression to large animal models. Stem Cell Res. 13, 654-665 (2014).
- Talavera, J., et al. An Upgrade on the Rabbit Model of Anthracycline-Induced Cardiomyopathy: Shorter Protocol, Reduced Mortality, and Higher Incidence of Overt Dilated Cardiomyopathy. BioMed Res Int. 2015, 465342 (2015).
- Bueno, C., et al. Human adult periodontal ligament-derived cells integrate and differentiate after implantation into the adult mammalian brain. Cell Transplant. 22, 2017-2028 (2013).
- Sahn, D. J., DeMaria, A., Kisslo, J., Weyman, A. Recommendations regarding quantitation in M-mode echocardiography: results of a survey of echocardiographic measurements. Circulation. 58, 1072-1083 (1978).
- Thomas, W. P., et al. Recommendations for standards in transthoracic two-dimensional echocardiography in the dog and cat. Echocardiography Committee of the Specialty of Cardiology, American College of Veterinary Internal Medicine. J Vet Intern Med. 7, 247-252 (1993).
- Lang, R. M., et al. Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 16, 233-270 (2015).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods Mol Biol. 1180, 31-43 (2014).
- Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70, 12-19 (2014).
- Cohen, A. H. Masson's trichrome stain in the evaluation of renal biopsies. An appraisal. Am J Clin Pathol. 65, 631-643 (1976).
- Corti, R., et al. Real time magnetic resonance guided endomyocardial local delivery. Heart. 91, 348-353 (2005).
- Springer, M. L., et al. Closed-chest cell injections into mouse myocardium guided by high-resolution echocardiography. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 289, H1307-H1314 (2005).
- Aoki, M., et al. Efficient in vivo gene transfer into the heart in the rat myocardial infarction model using the HVJ (Hemagglutinating Virus of Japan)--liposome method. J Mol Cell Cardiol. 29, 949-959 (1997).
- Guzman, R. J., Lemarchand, P., Crystal, R. G., Epstein, S. E., Finkel, T. Efficient gene transfer into myocardium by direct injection of adenovirus vectors. Circ Res. 73, 1202-1207 (1993).
- Magovern, C. J., et al. Direct in vivo gene transfer to canine myocardium using a replication-deficient adenovirus vector. Ann Thorac Surg. 62, 425-433 (1996).
- Suzuki, K., et al. Role of interleukin-1beta in acute inflammation and graft death after cell transplantation to the heart. Circulation. 110, II219-II224 (2004).
- Fukushima, S., et al. Direct intramyocardial but not intracoronary injection of bone marrow cells induces ventricular arrhythmias in a rat chronic ischemic heart failure model. Circulation. 115, 2254-2261 (2007).
- Miller, L. W., Taylor, D. A., Willerson, J. T. Stem Cell and Gene Therapy for Cardiovascular Disease. , Academic Press. 13-23 (2016).
- Fargas, A., Roma, J., Gratacos, M., Roig, M. Distribution and effects of a single intramuscular injection of India ink in mice. Ann Anat. 185, 183-187 (2003).
- Dib, N., et al. Recommendations for successful training on methods of delivery of biologics for cardiac regeneration: a report of the International Society for Cardiovascular Translational Research. JACC Cardiovasc Interv. 3, 265-275 (2010).
- Mu, Y., Cao, G., Zeng, Q., Li, Y. Transplantation of induced bone marrow mesenchymal stem cells improves the cardiac function of rabbits with dilated cardiomyopathy via upregulation of vascular endothelial growth factor and its receptors. Exp Biol Med (Maywood). 236, 1100-1107 (2011).
- Giraldo, A., et al. Percutaneous intramyocardial injection of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells improves ventricular function and survival in non-ischaemic cardiomyopathy in rabbits. Eur Heart J. 36, 149 (2015).
- Giraldo, A., et al. Allogeneic amniotic membrane-derived mesenchymal stem cell therapy is cardioprotective, restores myocardial function, and improves survival in a model of anthracycline-induced cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 19, 594 (2017).
- Prendiville, T. W., et al. Ultrasound-guided transthoracic intramyocardial injection in mice. J Vis Exp. , e51566 (2014).
- Laakmann, S., et al. Minimally invasive closed-chest ultrasound-guided substance delivery into the pericardial space in mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 386, 227-238 (2013).
- Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovasc Res. 39, 60-76 (1998).
- Ponikowski, P., et al. Depressed heart rate variability as an independent predictor of death in chronic congestive heart failure secondary to ischemic or idiopathic dilated cardiomyopathy. Am J Cardiol. 79, 1645-1650 (1997).
- Nolan, J., et al. Prospective study of heart rate variability and mortality in chronic heart failure: results of the United Kingdom heart failure evaluation and assessment of risk trial (UK-heart). Circulation. 98, 1510-1516 (1998).
- Galinier, M., et al. Depressed low frequency power of heart rate variability as an independent predictor of sudden death in chronic heart failure. Eur Heart J. 21, 475-482 (2000).
- Sheng, C. C., Zhou, L., Hao, J. Current stem cell delivery methods for myocardial repair. BioMed Res Int. 2013, 547902 (2013).
- Kim, R. J., et al. The use of contrast-enhanced magnetic resonance imaging to identify reversible myocardial dysfunction. N Engl J Med. 343, 1445-1453 (2000).
- Perin, E. C., et al. Transendocardial, autologous bone marrow cell transplantation for severe, chronic ischemic heart failure. Circulation. 107, 2294-2302 (2003).
