Chromatin verteilt die Vorbereitungen für die Analyse der Maus Eizelle Progression von Prophase, Metaphase II

Zusammenfassung

Oogenese bei Säugetieren ist bekanntermaßen anfällig für Fehler, vor allem auf Chromosom Missegregation. Dieses Manuskript beschreibt Chromatin verteilt Präparationsmethoden für Maus Prophase, Metaphase I und II inszeniert Eizellen. Diese grundlegenden Techniken ermöglichen die Untersuchung der Chromatin-gebundene Proteine und Chromosom Morphologie in Säugetieren Oogenese.

Zusammenfassung

Chromatin verbreitete Techniken haben am meisten benutzt, die dynamische Lokalisierung verschiedener Proteine während der Gametogenese, insbesondere für die Spermatogenese zu beurteilen. Diese Techniken ermöglichen für die Visualisierung von Protein- und DNA-Lokalisierung Muster bei meiotische Veranstaltungen wie homologe Chromosom Paarung, Synapsis und DNA zu reparieren. Während einige Protokolle in der Literatur beschrieben wurden, sind allgemeine Chromatin verbreitete Techniken mit Säugetieren Prophase Eizellen begrenzt und schwierig aufgrund des Zeitpunkts der Meiose Initiation in fetalen Ovarien. Im Vergleich dazu können Jugendliche männliche Mäuse mit höheren Erträgen ohne Mikrodissektion Prophase Spermatozyten abgeholt werden. Es ist jedoch schwierig, eine reine synchronisierte Population von Zellen in bestimmten Phasen aufgrund der Heterogenität der meiotischen und Post-meiotische Keim-Zell-Populationen in den Jugendlichen und Erwachsenen Hoden zu erhalten. Für die späteren Phasen der Meiose ist es vorteilhaft, die Eizellen durchläuft Meiose I (MI) oder Meiose II (MII), weil Gruppen von reifen Eizellen können von Erwachsenen weiblichen Mäusen gesammelt und wieder Meiose in Kultur angeregt zu beurteilen. Hier Methoden für meiotische Chromatin verteilt Vorbereitungen mit Eizellen seziert von fötale, neonatale und Erwachsenen Eierstöcke sind beschrieben mit dem dazugehörigen video-Demonstrationen. Chromosom Missegregation Veranstaltungen in Säugetieren Eizellen sind häufig, besonders während MI. Diese Techniken können verwendet werden, zu bewerten und zu charakterisieren, die Auswirkungen der verschiedenen Mutationen oder Umwelteinflüsse während der verschiedenen Stadien der Oogenese. Da gibt es deutliche Unterschiede zwischen Oogenese und Spermatogenese, sind die Techniken beschrieben wurden, innerhalb von unschätzbarem Wert für unser Verständnis von Säugetieren Oogenese und sexuell dimorphen Eigenschaften des Chromosoms und Protein Dynamik während der Meiose zu erhöhen .

Einleitung

Während der Spermatogenese werden große halbsynchrone Wellen der meiotischen Keimzellen in den Hoden zu Beginn der Pubertät und im gesamten Erwachsenenalter¹schnell und kontinuierlich aufgefüllt. Im Gegensatz zu den Männchen wird Meiose bei den Weibchen nur während der fetalen Entwicklung eingeleitet. Nach der Geburt, Eizellen bleiben verhaftet in einem längeren Dictyate Stadium der Prophase I mit einer intakten Germinal Vesicle (GV; Kernhülle) bis zur Pubertät. Zu Beginn der Pubertät eine Teilmenge der Eizellen werden zyklisch ausgewählt, um Wachstum und Reifung, Kennzeichnung der Einleitung der meiotischen Wiederaufnahme zu unterziehen. Meiotische Wiederaufnahme in ausgewachsene Eizellen manifestiert sich durch das Verschwinden der GV in einem Prozeß bekannt als Germinal Vesicle Aufschlüsselung (GVBD). Die Eizelle wird dann Chromosom Kondensation und Segregation, gefolgt von Polkörperchen Extrusion. Eizellen werden bei der Progression zu MII verhaftet und stimuliert die zweite und letzte meiotische Teilung nur nach der Befruchtung abgeschlossen.

Weibliche Fruchtbarkeit hängt stark von dem Erfolg der meiotischen Prophase ich fortschreiten. Der Schlüssel hierzu ist eine physische Verbindung zwischen Homologen Chromosomen bekannt als Chiasmata, die durch Reparatur der induzierten DNA-Doppelstrang Brüchen (DSB) über Crossover Rekombination²vermittelt wird. Dieser Vorgang erfolgt im Rahmen der dynamischen eiweißreichen leski bekannt als des synaptonemalen Komplexes (SC), die zwischen Homologen Chromosomen zur Erleichterung ihrer Synapsis³bildet. Der SC ist ein Reißverschluss dreigliedrige Struktur, die besteht aus zwei parallelen seitlichen Elementen verbunden durch Zentralregion Proteine, die homologe zusammen in der gesamten laufenden DNA-Reparatur hält. Vor der Synapsis bilden Vorstufen von den seitlichen Elementen, genannt axiale Elemente zwischen Schwester Chromatiden. Synaptonemalen Komplex Proteine wie SYCP2 und SYCP3 bilden axiale Elemente, die zu den Achsen der Schwester Chromatids Zusammenhalt während der frühen Prophase colocalize. Diese später dienen als Bindungsstellen für die transversale Filament-Protein, SYCP1, das zentrale Element Montage und Synapsis zwischen ausgerichteten homologe⁴erleichtert. Maus Eizellen ist komplette Synapsis durch die Anwesenheit von 20 komplett entnehmen Sie bitte, dass überlappende SYCP3 und SYCP1 Strecken, die visualisiert werden können, mithilfe von Chromatin Zubereitungen verbreiten. SYNAPSIS ist bei Eintritt in die Pachytene Unterphase abgeschlossen wobei Reife Frequenzweichen, die in Form Chiasmata zwischen homologen bestimmt sind mit MutL Homolog (MLH1/3) Dimere Förderung ihre präzise Verarbeitung^5,6 verziert sind ^{, 7}. Bauunterhaltung der Chromosomen (SMC) komplexe, einschließlich Cohesin, condensin und die SMC5/6-Komplex, sind wichtig für die Regulierung des Chromosoms Dynamik und Struktur im gesamten Meiose^{8,9, 10,11,12}. Gemeinsam sorgen diese Ereignisse korrekte Bi-Ausrichtung der Homologen Chromosomen an den gegnerischen Spindel Polen nach Demontage des SC.

Die meiotische Zellzyklus ist ein leistungsfähiges Modell, die Rollen der verschiedenen Proteine im Genom Wartung aufgrund der programmierten Induktion und anschließende Reparatur der DNA DSB zu untersuchen. Säugetier-Meiose ist darüber hinaus auch eine relevante Modell für die Untersuchung von epigenetischen Modifikationen und Prägung¹³. Jedoch ist es technisch schwierig, bewerten diese Ereignisse während weibliche Meiose stattfindet in fetalen und neonatalen Eierstöcke bei Säugetieren (Abbildung 1). In 5 Subverteiler teilbar Prophase: Leptonema, Zygonema, Pachynema, Diplonema und Dictyate. Hier beschreiben wir, wie zu isolieren und zu unterscheiden zwischen fetalen und neonatalen Eierstöcke und Hoden (Abbildung 2). Adaptiert von zuvor beschriebenen Methoden, diese Handschrift auch beschreibt ein Protokoll (Schritt 1) mit video-Demonstration für die Vorbereitung der weiblichen meiotischen Prophase ich Chromatin breitet sich^14,15,16,17 . Verbindung mit Immunolabelling, wie beschrieben in Schritte 6 und 7, dieses Protokoll ermöglicht detaillierte mikroskopische Analyse der Prophase ich Ereignisse in Eizellen.

Oogenese ist fehleranfällig und Chromosom Missegregation Ereignisse während der ersten meiotischen Teilung stellen die häufigste Quelle der genetischen Krankheit Nachkommen^18,19. In diesem Manuskript (Protokoll (Schritt 2) beschreiben wir ein Protokoll, in dem grundiert Eierstöcke von Erwachsenen weiblichen Mäusen Reife GV inszeniert Eizellen entnommen sind. Unterstützende Bedingungen werden ausgewachsene Eizellen luteinisierendes Hormon-unabhängigen Wiederaufnahme der Meiose nach Isolation und Kultur²⁰unterzogen. Nach meiotische Wiederaufnahme Eizellen durch Meiose ich Fortschritt, dann in Metaphase II zu verhaften. Eizellen bleiben in Metaphase II, verhaftet, wenn befruchtet. In den Schritten 2 – 5 passen wir uns zuvor aufgezeichneten Protokolle mit video-Demonstration zu beschreiben, wie zu sammeln, Kultur und Chromatin verteilt Vorbereitungen²¹MI und MII Eizellen vorbereiten. Dieser Chromatin Verbreitung Technik ermöglicht eine klare Immunolabelling der Proteine Chromosomen zugeordnet. Darüber hinaus dieses Protokoll kann auch zur Unterscheidung zwischen bivalenten und einwertigen Chromosomen und lösen weitere einzelne Schwester Chromatiden Bewertung der Eizelle Diploidie zu erleichtern. Daher kann dieses Protokoll neben enthüllt Lokalisierung Muster der meiotischen Proteine, auch als ein unschätzbares Werkzeug für die Aufklärung der Ursachen von Chromosom Missegregation während MI und MII dienen.

Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Johns Hopkins University genehmigt. Experimente wurden an Wildtyp C57BL/6J Mäusen durchgeführt.

1. Ernte fetale oder neonatale Eierstöcke und Vorbereitung der Prophase Chromatin breitet sich

1. Embryonen im 14,5 – 19,5 Tage Post-Coitum (Dpc) extrahieren Opfern Sie die trächtige Weibchen durch zervikale Dislokation oder CO₂ Erstickung nach IACUC Richtlinien.
   Hinweis: Überspringen Sie Schritt 1.3 für postnatale Tag 1 – 5 Eierstöcke. Abbildung 1 enthält eine Zusammenfassung der meiotischen Prophase Bühnen in verschiedenen Altersstufen der embryonalen und postnatale bereichert.
2. Öffnen Sie die Abdominopelvic Hohlraum mit sterile Schere, so dass eine v-förmige Öffnung. Aus der mütterlichen Gebärmutter Horn zu sezieren Sie, trennen Sie die Embryonen aus der Plazenta und transferieren Sie die Embryonen in 35 mm Petrischalen mit 3 mL vorgewärmten 1 x Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS) bei 37 ° C.
   Hinweis: Ein Fliptop-Inkubator bei 37 ° C einstellen kann verwendet werden, um Temperatur zu halten. Darüber hinaus kann eine Temperatur geregelt-Glas-Bühne auch, Temperatur während der Eierstock Manipulation verwendet werden.
3. Mit 3,5-Zoll-Chirurgische Scheren Embryonen oder Welpen über Enthauptung nach IACUC Richtlinien zu opfern. Legen Sie enthauptet Embryonen oder Welpen in vorgewärmten PBS vor weiteren Dissektion.
4. Sezieren eines Embryos oder Welpen gleichzeitig in einer separaten 35 mm Petrischale mit 3 mL vorgewärmten PBS bei 37 ° C. Fahren Sie durch Schnitt entlang der ventralen Mittellinie von der hinteren Hälfte des Embryos, entlang der vorderen Hälfte unter die Vorderbeine und direkt oberhalb der hinteren Gliedmaßen und Rute wie in Abbildung 2A-Bbeschrieben.
5. Öffnen Sie den Bauch mit 3,5-Zoll-chirurgische Schere. Mit feinen Spitzen Pinzette zu verdrängen oder entfernen Sie die Leber und Schleifen des Darms, die Eierstöcke in einer neuen 35 mm Petrischale mit 3 mL vorgewärmten PBS bei 37 ° C aussetzen (siehe Guide in Abbildung 2 b). Die Eierstöcke befinden sich direkt unterhalb und hinter der Niere in Richtung der hinteren Wand der Bauchhöhle (Abb. 2 b–C). Ein Leitfaden für die Unterscheidung zwischen männlichen und weiblichen Keimdrüsen wird in Abb. 2Dbereitgestellt.
   Hinweis: Für optimale Bedingungen schnell zu sezieren, die Eierstöcke nach trächtige Weibchen geopfert wird.
6. Entfernen Sie beide Eierstöcke von jedem weiblichen Fetus mit einer feinen Spitze Pinzetten unter einer Dissektion Umfang und in einer Uhrgläser oder separate Brunnen von Multi-Well Platte mit 0,5 bis 1,0 mL vorgewärmten PBS und pflegen bei 37 ° C.
7. Legen Sie jedes Paar der Eierstöcke in 0,5 mL Hypo-Extraktionspuffer (17 mM Trinatrium Citrat Dihydrat, 50 mM Saccharose, 5 mM EDTA, 0,5 mM DVB-t, 30 mM Tris-HCl, Proteasehemmer, pH 8,2) in einem sauberen Uhrglas oder ein kleiner Brunnen von einem 9-Well-Platte, und achten Sie auf die Eierstöcke Comp Tauchen vollständig. Inkubieren Sie mindestens 15 min lang, aber nicht mehr als 30 min.
   Hinweis: Hypo-Extraktionspuffer frisch machen und innerhalb von 2 h von DVB-t-Zusatz verwenden.
8. Während der Inkubation mit einem hydrophobe Barriere Pap-Stift zeichnen Sie zwei 22 x 22 mm² Quadrate auf ein sauberes Glas 25 x 75 mm², 1 mm dicken Mikroskop-Objektträger, wie in Abbildung 3Agezeigt.
   Hinweis: Folien können rechtzeitig vorbereitet werden.
9. Pipette 45 – 50 µL 100 mM Saccharose in eine saubere Folie und ein paar Eierstöcke bis zum Tropfen zu übertragen.
10. Mit den Spitzen enden von zwei 27 G Nadeln, necken Sie die Eierstöcke auseinander um Zellen in die Saccharoselösung zu lösen. Mit der Pinzette große Stücke von Eierstock entfernen und sorgfältig pipette Saccharoselösung um Zellen zu verteilen.
11. Platz 40 µL Fixativ Lösung (1 % Paraformaldehyd (PFA), 0,2 % Waschmittel (siehe Tabelle der Materialien), pH 9.2) in jedes Quadrat der vorbereitete Folie. Mit einem 200 µl Pipettenspitze Fixativ Lösung gleichmäßig über die Oberfläche der Folie.
12. Pipette 20 µL des Saccharose-Mix auf jedes Quadrat von der Folie, die das Fixiermittel enthalten.
    Hinweis: Dies entspricht mit ein paar Eierstöcke pro Folie.
13. Inkubieren Sie die Folien in einer geschlossenen feuchten Kammer über Nacht bei Raumtemperatur.
    Hinweis: Die Übernachtung Inkubation reichen um (12-15 Stunden) bei Raumtemperatur.
14. Öffnen Sie den Deckel und lassen Sie die Folien vollständig an der Luft trocknen.
15. Objektträger in einem Coplin Glas mit 50 mL 0,4 % Netzmittel-PBS-Lösung waschen (siehe Tabelle der Materialien) für 2 min an der Luft trocknen, und fahren Sie mit Immunolabelling-Protokoll (Schritt 6).
    Hinweis: Es kann möglich sein, die Folien bei-80 ° C für die spätere Verwendung zu speichern, aber dies variiert je nach Protein des Interesses. Gehen Sie für ein optimales Ergebnis sofort auf das Immunolabelling-Protokoll (Schritt 6).

2. Metaphase ich Eizellenentnahme

1. Um die Anzahl der antrale Follikel von jeder Maus isoliert zu maximieren, intraperitoneal injizieren Sie geschlechtsreif Jungfrau weibliche Mäuse mit 5 IU trächtige Stute Serum Gonadotropin (PMSG, auch bekannt als equine Chorion-Gonadotropin (EKG)).
   Hinweis: Für optimale Eizelle Ertrag sollte Mäuse 1 bis 3 Monate alt, sein wie die Anzahl der Eizellen geerntet mit zunehmendem Alter abnimmt. Zur Vorbereitung der PMSG lösen Sie Flasche 5.000 IU in 100 mL sterilen PBS (5 U/0.1 mL) Store in Einweg-Aliquote von 600 µL bei-20 ° C auf.
2. Bereiten Sie nach 44 – 48 h Kollektion Medium, minimale wesentliche Mittel alpha (MEMα) Mittel ergänzt mit 5 % fetalen bovine Serum (FBS) und 3 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA; MEMΑ/BSA/FBS). Sterilisieren Sie Medien durch einen 0,2 µm-Poren-Filter. Dekantieren Sie 2,5 mL MEMα/BSA/FBS in eine Glasschale per Mausklick Mittel- und warm auf 37 ° C in einem 5 % CO₂ Inkubator.
   Hinweis: Andere Sammlung und Kulturmedien, die im Handel erhältlichen (M2 und M16) sind auch allgemein verwendet.
   Achtung: Wir empfehlen entfernen Kultur Gerichte aus dem 5 % CO₂ Inkubator, eine zu einem Zeitpunkt für begrenzte Dauer Umgebungsluft Belichtung während der Manipulation Schritte zu minimieren.
3. Die Mäuse durch zervikale Dislokation oder CO₂ Erstickung nach IACUC Richtlinien zu opfern.
4. Öffnen Sie die Abdominopelvic Hohlraum mit steriler Schere, wodurch eine große v-förmige Öffnung. Mit Pinzette, verdrängen Sie Darm in Richtung des Kopfes von der Maus. Suchen Sie jedes uterine Horn; die Eierstöcke sind proximal zu den Brustkorb präsentieren. Halten Sie die Eileiter mit feinen Zangen und schneiden Sie das Fett Superior der Eierstöcke mit Dissektion Schere (Abbildung 4). Weiterhin halten die Eileiter und den Eierstock aus der Bursa und in Sammlung Schale mit MEMα/BSA/FBS Medium mit einem anderen Satz von feinen Pinzetten freisetzen.
   Hinweis: Wie in Schritt 1 ist es unerlässlich, die Eierstöcke bei 37 ° C zu halten und zu pflegen um 5 % CO₂. Ein Fliptop-Inkubator bis zu 5 % CO₂ Mix angeschlossen kann verwendet werden, um optimale Wartung der Temperatur- und CO₂ -Konzentration zu ermöglichen. Darüber hinaus sollte eine Temperatur geregelt-Glas-Bühne auch, Temperatur während der Eizelle Manipulation verwendet werden.
5. Mit einer 1 mL Spritze mit einem 27-Gauge-Nadel (oder ähnlicher Größe), Cumulus Eizelle komplexe lösen, indem manuell Durchbohrung der großen antrale Follikel.
6. Sammeln Sie während der Beobachtung durch ein Mikroskop Dissektion, GV inszeniert Eizellen mit einer Mund-betrieben Glaspipette oder Kapillare oder einer handbetriebenen Mikrometer-Spritze (Abbildung 5). Sammeln Sie nur Eizellen, die freigegeben werden von antrale Follikel. GV Eizellen haben einen Durchmesser von ca. 90 µm. GV Eizellen können 2-3 Schichten von Granulosa Zellen umgeben sein, und haben einen Durchmesser von rund 200 µm.
7. Kultur der Eizellen in einem sauberen Uhrglas oder ein 9-Well-Platte mit MEMα/BSA/FBS Medium für 6 h, Metaphase zu erreichen ich bei 37 ° C in einem 5 % CO₂ Inkubator.
8. Fahren Sie mit Schritt 4 fort.

3. Metaphase II (MII) Eizellenentnahme

1. Zur Maximierung der Oozyten isoliert von jeder Maus Spritzen Sie intraperitoneal geschlechtsreif Jungfrau weibliche Mäuse mit 5 IU der PMSG. Nach 44 – 48 h intraperitoneale Injektion mit 5 IU humanes Choriongonadotropin (hCG).
   Hinweis: Für optimale Eizelle Ertrag sollte Mäuse 1 bis 3 Monate alt, sein wie die Anzahl der Eizellen geerntet mit zunehmendem Alter abnimmt. Um hCG vorzubereiten, lösen eine Flasche 10.000 U in 200 mL PBS (5 U/0.1 mL). Speichern Sie in Einweg-Aliquote von 600 µL bei-20 ° C.
2. Bereiten Sie nach 12 bis 14 Uhr MEMα/BSA/FBS Kollektion Medium, wie oben in Schritt 2.2 beschrieben.
3. Die Mäuse durch zervikale Dislokation oder CO₂ Erstickung nach IACUC Richtlinien zu opfern.
4. Öffnen Sie die Abdominopelvic Hohlraum mit steriler Schere, wodurch eine große v-förmige Öffnung. Mit Pinzette, verdrängen Sie Darm in Richtung des Kopfes von der Maus. Suchen Sie jedes uterine Horn, die Eierstöcke sind proximal zu den Brustkorb präsentieren. Halten Sie die Eileiter mit feinen Zangen und schneiden Sie das Fett Superior der Eierstöcke mit Dissektion Schere (Abbildung 4). Dann entfernen Sie den Eierstock und Eileiter und legen in Sammlung Schale mit MEMα/BSA/FBS Medium.
   Hinweis: Wie in den Schritten 1 und 2 ist es unerlässlich, die Eierstöcke bei 37 ° C zu halten und zu pflegen um 5 % CO₂. Ein Fliptop-Inkubator bis zu 5 % CO₂ Mix angeschlossen kann verwendet werden, um optimale Wartung der Temperatur- und CO₂ -Konzentration zu ermöglichen. Darüber hinaus sollte eine Temperatur geregelt-Glas-Bühne auch, Temperatur während der Eizelle Manipulation verwendet werden.
5. Mit Hilfe einer 1 mL Spritze mit einem 27 G (oder ähnlicher Größe) oder scharfe Pinzette, reißen ein Loch in der Ampulle des Eileiters, die MII Eizellen freizugeben.
   Hinweis: Seien Sie vorsichtig, nicht zu beschädigen die Eizellen in der Ampulle. Der Ampulle erscheint geschwollen und durchscheinend, derart, dass die Eizellen sichtbar (Abbildung 4 sind).
6. Ernten Sie MII Eizellen aus der Ampulle des Eileiters in eine neue Schale mit Sammlung Medium mit einer Mund-betrieben Glaspipette oder Kapillare oder einer handbetriebenen Mikrometer-Spritze (Abbildung 5).
7. Fahren Sie mit Schritt 4 fort.

(4) Eizelle Entblößung und Zona Pellucida entfernen

1. Bereiten Sie 300 IU/mL von Hyaluronidase in MEMα Medium ergänzt mit 3 mg/mL BSA zu Eizellen der umgebenden Kumuluszellen (2,5 mL/Maus) in ein Uhrglas und halten bei 37 ° C, 5 % CO₂zu entblößen.
   Hinweis: Hyaluronidase Wirksamkeit sinkt stark nach 1 h der Vorbereitung. Für MII Eizellen ist Hyaluronidase Behandlung nicht erforderlich.
2. Setzen Sie Eizelle-Cumulus Zelle komplexe bis 300 IU/mL von Hyaluronidase in MEMα/BSA 3 min um Eizellen der umgebenden Kumuluszellen entblößen aus.
   Achtung: Überschreiten Sie 3 min Exposition gegenüber Hyaluronidase, nicht, da es die Eizellen schädigen.
3. Waschen Sie die Eizellen, transfer Eizellen zu einem frischen erwärmt MEMα/BSA mittlere Schüssel. Mit einem kleinen Mund betriebene Glaspipette oder Kapillare (etwas größer als der Durchmesser der Eizelle, die etwa 90 µm), pipette die komplexe oben und unten, um die Kumuluszellen vollständig zu lösen. Lassen Sie die Eizellen in den Inkubator zu erholen, während der Vorbereitung für den nächsten Schritt.
4. Warmen sauren Tyrode-Lösung, MEMα/BSA und Waymouths Medien auf 37 ° C (500 µL/Maus). Platz 300 µL in jede Vertiefung der kleine 9-Brunnen Glasplatten.
5. Entfernen Sie die Zona Pellucida (ZP) übertragen Sie 5 – 10 Eizellen in Tyrode Lösung. Setzen Sie die Eizellen für nur 30-45 s, um die Lösung.
   Hinweis: Zu wenig Kontakt mit der Lösung wird nicht die ZP vollständig entfernen, die die Eizellen platzen und Chromosomen Ausbreitung verhindert. Zu viel Belastung beschädigt und die Eizelle zu töten. ZP auflösen unter die Dissektion Mikroskop beobachten kann helfen bei der Optimierung der Belichtungszeit.
   Achtung: Mit frischen Tyrode-Lösung ist kritisch, da seine Funktion mit dem Alter abnimmt. Verwenden Sie einen frischen Brunnen Tyrode Lösung für jede Gruppe von Eizellen behandelt, um gleichmäßige Verdauung der ZP zu gewährleisten.
6. Sofort nach dem ZP entfernen waschen Sie die Eizellen durch die Übertragung in erwärmten MEMα/BSA/FBS Medium. Wiederholen Sie dies waschen.
   Hinweis: Achten Sie bei der Übertragung von Eizellen leicht zusammenkleben und auf die Glaspipette oder Kapillare folgenden entfernen von der ZP. Vornässen der Glaspipette oder Kapillare in Waymouths Mediums werden Eizellen zusammenkleben minimieren.
7. Und die Eizellen wieder für 30 Minuten in Waymouth Medium bei 37 ° C in einem 5 % CO₂ Inkubator.
8. Fahren Sie mit Schritt 5 fort.

5. MI und MII Eizelle Chromatin Spreads

1. Zeichnen Sie mit einem PAP-Stift, ein 11 x 44 mm² Rechteck auf der Glas-Folie, wie in Abbildung 6Agezeigt.
2. Beschichten die Folie mit einer dünnen Schicht Fixativ (1 % Paraformaldehyd, 0,2 % Triton X 100 H₂O, pH 9.2) durch Pipettieren 100 µL Fixativ auf der Folie und die Folie hin und her schaukeln. Tippen Sie auf die Folie um loszuwerden überschüssige Fixiermittel.
3. Zwischen 5 bis 10 Eizellen mit einer kleinen Mund Pipette Nadel mit als wenig Medien wie möglich holen Sie ab und ziehen Sie die Nadel in einer Linie über die Fixiermittel-beschichtete Folie während der Hinterlegung der Eizellen von 1 cm oberhalb der Folie in die Fixativ Lösung. Führen Sie diesen Schritt mit einer Dissektion Mikroskop um sicherzustellen, dass die Eizellen hinterlegt worden sind und dass sie platzen, haben.
   Hinweis: Die Eizellen sollte sofort auf der Folie platzen. Die Höhe, bei der die Eizellen sind, hinterlegt Auswirkungen der Grad des Chromatins zu verbreiten. Repräsentative Ergebnisse in Abbildung 6 für weitere Details zu sehen.
4. Inkubieren Sie Folien bei Raumtemperatur in einer geschlossenen Kammer befeuchtete über Nacht erlauben das Chromatin zu halten.
5. Die Folien vollständig an der Luft trocknen lassen und abspülen Folien in einem Coplin Glas mit 50 mL 0,4 % Netzmittel-H₂O, pH 8.0.
6. Fahren Sie mit Schritt 6 fort.

(6) Immunolabelling

1. Bereiten Sie die Antikörper-Verdünnungspuffer (ADB) in Tabelle 1beschrieben.
2. Bereiten Sie zwei Coplin Gläser mit 50 mL Waschlösung Puffer (WB) (10 % ADB in PBS verdünnt) und einem Coplin JAR-Datei mit 50 mL WB und 0,05 % Reinigungslösung (z.B.50 mL WB 250 µL 10 % Waschmittel hinzufügen).
3. Waschen Sie die Folien, die in Abschnitt 1 und 5 dieses Protokolls für 10 min in einem Coplin JAR-Datei mit 50 mL WB vorbereitet wurden.
   Achtung: Nicht lassen Sie die Folien, die zu jedem Zeitpunkt während der Immunolabelling trocknen.
4. Waschen Sie die Objektträger für 10 min in der Coplin Glas mit 50 mL WB und 0,05 % Lauge. Waschen Sie die Folien in den verbleibenden Coplin JAR-Datei mit 50 mL WB-Lösung für 10 min.
5. Tippen Sie auf überschüssige Flüssigkeit und Cover Folie mit 100 µL der ausgewählten Primärantikörper in ADB verdünnt. Bei 4 ° C über Nacht in einer geschlossenen feuchten Kammer inkubieren.
   Hinweis: Inkubation kann verkürzt werden, um 2 bis 3 Stunden bei 37 ° C. Verwenden Sie kleinere Mengen von Antikörpern (z.B. 50 µL) durch die Folie mit einem Deckglas oder Parafilm abdecken.
6. Spülen Sie Folien in einem Coplin Glas mit 50 mL 0,2 % Netzmittel-PBS-Lösung, pH 8.0.
7. Wiederholen Sie die Schritte 6,2 bis 6,5.
8. Tippen Sie auf überschüssige Flüssigkeit und Cover Folie mit 100 µL der ausgewählten Sekundärantikörper in ADB verdünnt. Inkubieren Sie Folien 1 bis 2 Stunden bei 37 ° C in einer geschlossenen feuchten Kammer.
9. Waschen Sie Objektträger 2 Mal für 10 min in Coplin Gläser mit 50 mL 0,2 % Netzmittel-PBS-Lösung, pH 8.0.
10. Waschen Sie Objektträger 2 Mal für 5 min in Coplin Gläser mit 50 mL 0,2 % Netzmittel-H₂O Lösung, pH 8.0.

7. Montage Folien

1. Für Prophase Chromatin Spreads vorbereitet in Schritt 2, hinzufügen 100 µL Eindeckmedium mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, 1.5µg / mL). Für MI und MII Chromatin breitet sich bereit in Schritt 5, fügen 50 µL Eindeckmedium mit DAPI (1.5µg / mL). Tupfen Sie entfernt überschüssige Flüssigkeit.
2. Ein 22 x 60 mm-Deckglas darauf legen und mit klaren Nagellack versiegeln. Speichern Sie in einer Folie Box bei 4 ° C oder-20 ° C bis zur Bewertung per Fluoreszenz-Mikroskopie.
   Hinweis: Tippen Sie leicht auf Deckglas, um überschüssige Eindeckmedium vor der Versiegelung mit Nagellack zu entfernen.

Ergebnisse

Wir haben zwei Techniken zur Visualisierung und Bewertung meiotische Chromosomen in Eizellen beschrieben. Die erste Technik ist gesorgt, in Richtung Prophase Fortschreiten in embryonalen und neonatale Eierstöcke beurteilen. Prophase Chromatin Ausbreitung Vorbereitungen sind unglaublich wertvoll für zahlreiche dynamische Prozesse während der Meiose, einschließlich Chromosom Paarung, Synapsis visualisieren und desynapsis, homologe Rekombination und epigenetische Chromosom Umbau. Hier zeigte...

Diskussion

Chromatin Ausbreitung Vorbereitungen erlauben Forschern, weiblichen Säugetieren Meiose und die dynamische Lokalisierung von Proteinen, chronologisch zu studieren. Die embryonalen und neonatale Chromatin-Spreads ermöglichen genaue Analyse von Veranstaltungen das ganze meiotischen Prophase. Metaphase I und Metaphase II Chromatin Spreads können verwendet werden, um einzelne Schwester unterscheiden Chromatiden von Schwestern und gepaarten Homologen Chromosomen gepaart sowie Diploidie zu beurteilen. Im Vergleich dazu, kann da...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10X Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4	Qualität Biologisch	119-069-161
60 mm x 15 mm Petrischalen	Denville	T1106
35mm x 12mm Petrischalen	Denville	T1103
Feine Pinzette	VWR	300-050
Mikrodissektionsschere	Ted Pella	1340
Präparieren  Schere, scharfe Spitze, 41/2"	VWR	82027-578
Uhrenglas quadratisch 1 5/8	Carolina Biological Supply Company	742300	Autoklav vor jedem Gebrauch
Saccharose	Sigma	S8501
Trinatriumcitrat Dihydrat	Sigma	S1804
EDTA	Sigma	E6758
Trizma Base	Sigma	T1503
1,4-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	646563	Unmittelbar vor Gebrauch zu hypotonischem Puffer hinzufügen
50x Proteasehemmer	Roche	11873580001	vor Gebrauch zu hypotonischem Puffer hinzufügen
Turberkulin-Spritze mit Nadel (1cc, 27 G x 1/2 Zoll)	Becton, Dickinson (BD)	309623
Gold Seal Ultra Frost Glasobjektträger (25X75mm, 1mm dick)	Thermo	3063-002
Super PAP Pen, groß (Flüssigblocker)	Elektronenmikroskopie Sciences (EMS)	71310
16% Paraformaldehyd wässrig	Elektronenmikroskopie Sciences (EMS)	15710
Triton X-100	Sigma	T8787	Reinigungsmittel im Manuskript
Immunflecken-Feuchtigkeitskammer	Evergreen	240-9020-Z10
Coplin Gläser	Fisher	08-815
Photo-flo 200	Electron Microscopy Sciences (EMS)	74257	Netzmittel im Manuskript
Trächtige Stute Serum Gonadotropin (PMSG)	Sigma	G4877	Aliquots bei -20C Humanes
Choriongonadotropin (HCG)	Sigma	C0434	Aliquote bei -20C
lagern PYREX Spotplatten mit neun konkaven Kavitäten	Fisher	13-748B	Autoklav vor jedem Gebrauch
Glaskapillare	Fisher	22260943	Zur Herstellung von Eizellentnahmenadeln
Marke Parafilm M	Sigma	BR701501	Zur Herstellung von Eizellentnahmenadeln
Latex-Gummischlauch (3,2 mm Innendurchmesser x 6,4 mm Außendurchmesser)	Fisher	14-178-5B	Zur Herstellung von Eizellentnahmenadeln
Latex-Gummischlauch (6,4 mm Innendurchmesser x 11,1 mm Außendurchmesser)	Fisher	14-178-5D	Zur Herstellung von Eizell-Entnahmenadeln
Flexibler Silikonkautschuk-Nasenstück, Mundstück aus Hartplastik und 15 Zoll Latexschlauch	Sigma	A5177-5EA	Zur Herstellung von Eizell-Entnahmenadeln
Mitutoyo Mikrometerkopf	Mituoyo	150-208	Zur Herstellung von Eizell-Entnahmenadeln
Spritze 5 mL	BD Biosciences	309646	Für die Herstellung von Eizellentnahmenadeln
Spritzenvorsatzfilter 0,45 μ m filter	Corning	431220	Für die Herstellung von Eizellentnahmenadeln
Glass Pasteur Pipette 5 3/4"	Fisher	13-678-6A	Für die Herstellung von Eizellentnahmenadeln
83 x 0,5 mm Pipettenspitze	Denville	P3080	Für die Herstellung von Eizellentnahmenadeln
α-MEM	Invitrogen	11415049
Waymouth's media	Life Technologies
fötales Rinderserum	Fisher	A3160602
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma	A3311	Für Eizellkulturmedien
500 ml Filtereinheiten 0,22 μm	Denville	F5227
Hyaluronidase	Sigma	H3506
Tyrode' s Lösung	Sigma	T1788	Aliquots bei -20C aufbewahren
Pferdeserum	Sigma	H-1270	Für ADB/Waschpuffer
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma	A1470	Für ADB/Waschpuffer
VECTASHIELD Antifading-Eindeckmedium mit DAPI	Vector Labs	H-1200
Objektträger für Mikroskope (22mmx60mm)	Fisher	12-544-G
Klarlack	Amazon	N/A
Name	Unternehmen	<>Katalognummer<	strong>Kommentare
Mikroskope
SteREO Discovery.V8	Zeiss	495015-0001-000
Observer Z1	Zeiss
Name	<>Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Primärantikörper
Maus Anti-MLH1	Life Technologies	MA5-15431	Verdünnungsfaktor - 1:100
Kaninchen Anti-SYCP1	Life Technologies	PA1-16763	Verdünnungsfaktor - 1:1000
Ziege Anti-SCP3	Santa Cruz	sc-20845	Verdünnungsfaktor - 1:50
Humanes Anti-Zentromer-Protein	Antikörper Incorporated	15-235	Verdünnungsfaktor - 1:100
Kaninchen Anti-TOPOII	Abcam	ab109524	Verdünnungsfaktor - 1:100
Maus Anti-Histon H4 (Dimethyl K20, Trimethyl K20)	Abcam	ab78517	Verdünnungsfaktor - 1:500
Kaninchen Anti-Rec8	Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Karen Schindler	N/A	Verdünnungsfaktor - 1:10.000
Name	Company	Katalognummer<	strong>Comments
>Sekundäre Antikörper
Esel Anti-Ziege IgG (H+L) Alexa Fluor 568 Konjugat	Thermo-Fisher Scientific	A-11057	Verdünnungsfaktor - 1:500
Esel Anti-Maus IgG (H+L) Alexa Fluor 488 Konjugat	Thermo-Fisher Scientific	A-21202	Verdünnungsfaktor - 1:500
Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) Alexa Fluor 647 Konjugat	Thermo-Fisher Scientific	A-31573	Verdünnungsfaktor - 1:500
Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) Alexa Fluor 568-Konjugat	Thermo-Fisher Scientific	A-11004	Verdünnungsfaktor - 1:500
Ziegen-Anti-Human-IgG (H+L) Kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488	Thermo-Fisher Scientific	A-11013	Verdünnungsfaktor - 1:500
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Alexa Fluor 568 Konjugat	Thermo-Fisher Scientific	A-11011	Verdünnungsfaktor - 1:500