Methodenartikel

Zika-Virus spezifische diagnostische Epitop Entdeckung

DOI:

10.3791/56784

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12. Dezember 2017

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1Department of Basic Sciences and Craniofacial Development, New York University College of Dentistry, 2Rheonix, Inc., 3Department of Medicine, New York University Langone School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt eine Technik, um Zika Virus spezifische diagnostische Peptide mit einer High-Density-Peptid-Microarray entdecken. Dieses Protokoll kann für andere neu auftretende Infektionskrankheiten readly angepasst werden.

Zusammenfassung

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High-Density-Peptid Microarrays erlauben Screening von mehr als sechs tausend Peptide auf einer einzigen Standard-Mikroskopie-Folie. Diese Methode kann für Arzneimittelforschung, therapeutischen Target-Identifizierung und Entwicklung von Diagnostika. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um spezifische Zika Virus (ZIKV) diagnostische Peptide mit einer High-Density-Peptid-Microarray entdecken. Eine menschliche Serumprobe für ZIKV Infektion mit einer High-Density-Peptid Microarray enthält das gesamte ZIKV Protein übersetzt 3.423 einzigartige 15 linear (aa) Aminosäureresten mit einer 14-aa Rückstände Überlappung inkubiert wurde validiert in zweifacher Ausfertigung gedruckt. Färbung mit verschiedenen Sekundärantikörper innerhalb desselben Arrays, erkannt wir Peptide, die Bindung an Immunglobulin M (IgM) und Immunglobulin G (IgG) Antikörper im Serum vorhanden. Diese Peptide wurden für weitere Validierung Experimente ausgewählt. In diesem Protokoll beschreiben wir die Strategie zu entwerfen, zu verarbeiten und ein High-Density-Peptid-Microarray zu analysieren.

Einleitung

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Zika Virus (ZIKV) Diagnose anhand der klinischen Symptome ist schwierig, weil es Vektoren, geographische Verbreitung und Symptome mit Dengue-Fieber und Chikungunya-Virus-Infektion1teilt. Angesichts des Risikos für unerwünschte Schwangerschaft Ergebnisse bei Frauen während der Schwangerschaft mit ZIKV infiziert, ist es wichtig, zwischen den 3 Viren zu unterscheiden. Obwohl die aktuellen molekularer diagnostischer Tests spezifisch sind, sind sie nur während der relativ kurzen Zeit der akuten Infektion2,3nützlich im Blut oder Speichel. Serologische Tests sind unerlässlich für die Diagnose ....

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Protokoll

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Diese Daten sind ein Teil einer laufenden Forschungsstudie an der New York University College of Dentistry und wurden von der Institutional Review Board der New York University School of Medicine, IRB genehmigt # H10-01894. In dieser Studie verwendete klinischen Proben wurden anonymisierte Proben zuvor verwendet, für die Diagnose und mit Erlaubnis von Wadsworth Center der New York State Department of Health, Albany, NY.

1. Installation der ZIKV High-Density-Peptid Microarray Slide in einem bestimmten Fach Inkubation

  1. Die Glas-Folie an den Rändern mit puderfreien Handschuhen zu behandeln. Die Glas-Folie-Dimensionen sind 75,4 mm 25,0....

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Ergebnisse

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Die erzielten Ergebnisse mit dem beschriebenen Protokoll sind in Abbildung 2 dargestellte und Abbildung 3. Keine Hintergrund-Wechselwirkungen festgestellt wurden, wenn die Microarray mit sekundären Anti-Human IgM (Daten nicht gezeigt) Pre-Färbung. Färbung mit einem Anti-Human IgM führte Konjugat in mehreren Bereichen über dem Hintergrund grün fluoreszieren Intensitäten, unter Angabe der Bindung dieser Peptide mit.......

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Diskussion

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Wir entwarfen ein Protokoll mit Hilfe einer High-Density-Peptid Microarray enthält die gesamte Zika Virus Proteinsequenz (Französisch Polynesischen Stamm). Die Microarray wurde von Druck 3.423 anderen überlappenden lineare Peptide hergestellt. Jedes Peptid war 15 Aminosäuren und durch nur einen Rückstand von seinem nächsten Nachbarn in der Reihenfolge (d.h. 14 Rückstände Überlappung) variiert. Obwohl kürzere Überschneidungen gedruckt werden können, ist Epitop Mapping präziser mit längeren Überschneidungen. Jedes.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Von NIDCRR44 DE024456 wird es durch einen SBIR (Small Business Innovation Research) administrative Ergänzung Grant aktuelle unterstützt. NIDCR HIV-Stipendium, das aus NIDCR Zuschuss U01 DE017855 für die Entwicklung einer bestätigenden Point-of-Care-Diagnostik für HIV entwickelt. Wir erkennen dankbar Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) für ihre technische Hilfe und freundliche Unterstützung. Wir danken auch NYU Langone Medical Center für die LI-COR Odyssey Imaging System.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
PEPperCHIP Custom Peptide MicroarrayPEPperPRINTPPC.001.001Custom Peptide Micarray: Unser Microarray enthält die gesamte Zika-Virus-Proteinsequenz
PEPperCHIP Inkubationstablett 3/1PEPperPRINTPPC.004.001
PEPperCHIP Färbekit (680 nm) (Anti-HA, DyLight-Beschriftung)PEPperPRINTPPC.037.002
PepSLide AnalyzerPEPperPRINTPSA.004.00114 Tage kostenlose Lizenz für Windows
Rockland Blocking-PufferRocklandMB-070
Anti-Human-IgM (mu-Kette) DyLight 800Rockland609-145-007
Anti-Human-IgG Fc DyLight 680Thermo ScientificSA5-10138
LI-COR Odyssey Imaging SystemLI-COR
Orbital-Shaker-GerätIKAMTS 2/4 digitaler Mikrotiterschüttler
Adobe IllustratorAdobe
DeltagraphRedrocks

Referenzen

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  1. Kelser, E. A. Meet dengue's cousin. Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).
  2. Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).
  3. Siqueira, W. L., et al.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

Peptid Microarraydiagnostische PeptideIgM DetektionIgG DetektionHigh Density ArraySerumanalyseAntik rperbindungMicroarray Scanning

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