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Quantitative Messung der γ-Sekretase-vermittelten Amyloid-Precursor-Protein und Notch Spaltung in zellbasierten Luciferase Reporter Assay Plattformen

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DOI:

10.3791/56795

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25. Januar 2018

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1Laboratory of Molecular Neurobiology, Institute of Cellular and Organismic Biology, Academia Sinica

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir haben erfolgreich zwei Substrat-spezifische γ-Sekretase Assays generiert. Beiden zellbasierte Assays, die hier vorgestellten sollen γ-Sekretase enzymatischen Aktivitäten über den Ausgang des Firefly Luciferase Reporter zu quantifizieren.

Zusammenfassung

Wir haben ein paar zellbasierte Reporter-gen Assays zur Messung quantitativ γ-Sekretase Spaltung von unterschiedlichen Substraten entwickelt. Dieses Manuskript beschreibt Verfahren, die verwendet werden, um die γ-Sekretase-vermittelte Spaltung des APP-C99 oder Kerbe, mit einem Gal4 Projektträger-gesteuerte Firefly Luciferase Reporter System zu überwachen. Diese Tests wurden festgelegten stabil Co transfecting HEK293 Zellen mit Gal4-driven Luciferase Reporter-gen und entweder das Gal4/VP16-Tags C-terminale Fragment App (APP-C99; CG-Zellen), oder die Gal4/VP16-Tags Kerbe-ΔE (NΔE; NG-Zellen). Parallele Nutzung dieser Reporter-Assays, wir haben gezeigt, dass ein ErbB2-Inhibitor, CL-387.785, bevorzugt γ-Sekretase Spaltung des APP-C99 in CG Zellen, aber nicht NΔE in NG Zellen unterdrücken können. Die differenzierten Antworten, ausgestellt durch die CG und NG Zellen, wenn Sie mit CL-387.785, behandelt eine bevorzugte charakteristisch für γ-Sekretase Modulatoren, dar, die diese Antworten stehen in krassem Gegensatz zu der Pan-Hemmung der γ-Sekretase induziert durch DAPT. Unsere Studien bieten direkte Beweise dass γ-Sekretase Tätigkeiten auf verschiedenen Substraten in einem zellulären Kontext unterschieden werden können. Diese neue Assays kann daher nützliche Werkzeuge in der Drogeentdeckung für verbesserte AD-Therapien.

Einleitung

Oligomere Formen von Amyloid-β (Aβ) sind vermutlich die Hauptursache für Neurodegeneration in den Gehirnen von Patienten mit Alzheimer-Krankheit (AD)1. Aβ-Peptide werden durch die schrittweise Spaltung des Amyloid-Precursor-Protein (APP), zuerst durch β-Sekretase und dann durch γ-Sekretase2produziert. In den letzten zehn Jahren haben therapeutische Ansätze zur Behandlung der AD zur Verhinderung der Aβ Produktion3konzentriert. Die meisten Studien konzentrierten sich auf entweder die Vermehrung der α-Sekretase Aktivität, die γ-Sekretase Spaltung des APP schließt und dadurch verringern die Produktion von Aβ oder die Hemmung der β-und/oder γ-Sekretase Aktivitäten4. Leider sind nichtselektiven Hemmung β oder γ-Secretases führt zu unvermeidbaren Nebenwirkungen, die durch Störung der Tätigkeit der anderen physiologischen Substraten von β und γ-Sekretase5,6. Neuere Studien haben im Hinblick auf γ-Sekretase-Inhibitoren die Entdeckung einer Reihe von chemischen und genetischen Modulatoren berichtet, die Aβ-Produktion beim ausüben vernachlässigbarer Auswirkungen auf die wesentlichen γ-Sekretase-vermittelten Verarbeitung von Notch7 regulieren können ,8,9,10,11,12, jedoch erfolgreiche Therapie noch nicht entwickelt worden. So sind weitere systematische Bildschirme gerechtfertigt, um neuartige chemische und genetische Modifikatoren zu entdecken, die selektiv γ-Sekretase-vermittelten APP Verarbeitung modulieren kann.

Γ-Sekretase ist bekannt, mehr als 90 verschiedene Membran verankerte Proteine zu Spalten. Unter diesen Substraten ist Kerbe, deren Tätigkeit für Zelle Schicksal Entschlossenheit und Differenzierung während der Entwicklung13entscheidend. Selektiv modulierende γ-Sekretase-katalysierte APP Verarbeitung ohne wird Kerbe zu beeinträchtigen Verarbeitung wesentlich zur Minimierung Kerbe-bezogene Nebenwirkungen von γ-Sekretase-Inhibitoren, und diese Selektivität wird angenommen, dass ein primärer Faktor ist, dass die biologische Wirksamkeit von potenziellen γ-Sekretase Modulatoren für die chronische Behandlung von AD zu diktieren. Es wurden eine Reihe von Arylsulfonamide-Derivaten, wie GSI-953 (Begacestat) und BMS-708163 (Avagacestat), die gefunden wurden, potent und selektive Hemmung der γ-Sekretase14,15auszustellen. Eine frühere Studie hat gezeigt, dass die differenzielle Hemmung der γ-Sekretase Spaltung der APP und Kerbe mit einer quantitativen ELISA-basierten Test in Kombination mit in Vivo Validierung mithilfe von Zebrafisch16beobachtet werden kann. Darüber hinaus wurden zellbasierte Assays Paradigmen eingerichtet, an die potentielle Substrat Selektivität der γ-Sekretase in Richtung APP und Kerbe17,18. Unter Verwendung von Protokollen zu den beschriebenen ähnlich hierin, wir haben vor kurzem entdeckt eine neuartige Klasse von (D)-Leucinamides, die γ-Sekretase Spaltung des APP mit Notch-schonende Selektivität19potent modulieren. Diese Sammlung von Studien bilden zusammen ein Proof-of-Concept unterstützt die Vorstellung, die die Substrat Selektivität/Verfügbarkeit der γ-Sekretase chemische Modulation und experimentelle Verifikation unterworfen werden können. Dieser Assay-Plattformen setzen jedoch häufig auf relativ niedrigen Durchsatz auslesen und arbeitsintensive Ansätze, die industriellen Standards für Drug Discovery-Programme nicht erfüllen könnte.

Wir haben vor kurzem zellbasierte Luciferase Reporter-gen Assays generiert, die quantitativ, die katalytische Aktivität der γ-Sekretase gegenüber zwei unterschiedliche Substrate, die 99-amino Acid C-terminale Fragment der APP (APP-C99) und der extrazellulären bestimmen Domain gelöscht Kerbe Peptid (NΔE). APP-C99 und NΔE haben weithin als direkte Substrate der γ-Sekretase in verschiedenen Tests eingesetzt. Homogen und konsistent Luciferase Reporter-gen Assays für die γ-Sekretase Spaltung des APP-C99 oder NΔE generieren, erzielten wir ein HEK abgeleitet stabile Zelllinie (CG), die konstitutiv eine Gal4 Projektträger-gesteuerte Firefly Luciferase Reporter (ausdrückt Gal4-Luc) und Gal4/VP16-Tags APP-C99 Schmelzverfahren Protein (C99-GV). Darüber hinaus erzielten wir ein weiteres HEK abgeleitet stabile Zelllinie (NG), die konstitutiv Gal4-Luc und Gal4/VP16-markierten NΔE (NΔE-GV) ausdrückt. Mit dieser neuartigen Substrat-spezifische γ-Sekretase-Assays, bieten wir jetzt eine Methode zu quantifizieren und die katalytische Aktivität der γ-Sekretase auf unterschiedlichen Substraten (APP-C99 in CG-Zellen) oder NΔE in NG Zellen zu unterscheiden. Darüber hinaus wurden die Substrat-spezifische γ-Sekretase-Assays entwickelt, um High-Content-Screening Plattformen förderlich sein. Diese neu erzeugten γ-Sekretase-Assays könnte den Weg für die Entdeckung des neuartigen γ-Sekretase Modulatoren ebnen, die kognitive Funktion zu verbessern könnte, durch die Unterdrückung von Aβ-Produktion ohne unerwünschte Kerbe Hemmung für die Behandlung der nächsten Generation zu entlocken der AD.

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Protokoll

1. Messung der Luciferase Reporter Signale, die γ-Sekretase Spaltung des APP-C99 oder NΔE entsprechen

Hinweis: Lesen Sie bitte den vorherigen Veröffentlichungen für detaillierte Beschreibungen der Generation von CG und NG Zellen20,21.

  1. Seed NG oder CG Zellen (20, 000 Zellen/Brunnen) auf 96-Well-Mikrotiterplatten zu einem Endvolumen von 200 μl/Well im Wachstumsmedium, der Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) zuzüglich 10 % fötalen Rinderserum (FBS), 5 μg/mL Blasticidin 250 μg/mL Antibiotikum (z.B. zusammensetzt, Zeocin), und 200 μg/mL Hygromycin B.
    1. Anzahl Zellen mit einem Hemocytometer.
    2. Die Mikrotiterplatten auf eine befeuchtete CO2 Inkubator übertragen und über Nacht bei 37 ° C inkubieren.
  2. Jedes gut entnehmen Sie 100 μL des Kulturmediums.
  3. Hinzufügen von 100 μl/Well des Wachstums mittlere mit 2 μg/mL Tetracyclin mit entweder 0,2 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO), 2 μM CL-387.785, 2 μM N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-Butylester (DAPT), oder eine andere relevante ErbB1/ErbB2-Inhibitoren.
  4. Inkubieren Sie behandelte CG oder NG Zellen in Mikrotiterplatten bei 37 ° C für 24 h.
  5. Entfernen Sie 150 μl/Well Wachstumsmedium von Mikrotiterplatten.
  6. Fügen Sie 50 μL/Well Luciferase Assay Reagenz (siehe Tabelle der Materialien).
  7. Die Mikrotiterplatten Lumineszenz Mikrotestplatte Leser zu übertragen.
    1. Pflegen Sie die Mikrotiterplatten bei Raumtemperatur für 5 min mit sanften Agitation.
  8. Bestimmen der Firefly Luciferase (FL)-emittierten Lumineszenz mit einem vordefinierten Programm im Lumineszenz Mikrotestplatte Leser gespeichert.
    1. Öffnen Sie die Instrument-Steuerungs-Software (siehe Tabelle der Materialien für Instrument Details).
    2. Wählen Sie aus dem Menü "Werkzeug" "Luminometry".
      1. Wählen Sie unter "Einstellungen" "Ohne Filter" für Emission Filter, Tick 'Normal' für Emission Blende, geben Sie '1' für zählen Zeit und klicken Sie auf "OK" zum Einrichten der Lumineszenz-Lesung.
    3. Auf der Registerkarte "Gerätesteuerung" führen Sie einen Bildlauf durch die Liste der aktiven Protokolle, und wählen Sie das zuvor gespeicherte Protokoll für das Lesen von Lumineszenz.
    4. Auf der Registerkarte "Live-Anzeige" definieren Sie die Waage aus dem Pull-Down-Liste, und wählen Sie "Logarithmus" oder "Linear" für den Typ.
    5. Wählen Sie auf der Registerkarte "Temperatur" 'Off' für Platte Heizung.
    6. Klicken Sie auf "Start", um die Lumineszenz lesen durchzuführen.
    7. Bei Bedarf exportieren Sie Ergebnisse in einem Spreadsheet-Format mit dem "Explorer" in die Software eingebettet.

2. Quantifizierung der γ-Sekretase Aktivität

  1. Definieren Sie ein CG emittierten Lumineszenz-Signal oder NG Zellen mit 0,1 % DMSO im Wachstumsmedium mit 1 μg/mL Tetracyclin als 100 % relative γ-Sekretase Aktivität allein behandelt.
    1. Schätzen Sie Hintergrund Lumineszenz von CG oder NG Zellen durch die Behandlung der Zellen mit Wachstumsmedium, die keine Tetracyclin enthält.
  2. Normalisieren Luciferase Signale von CG oder NG Zellen, die mit 1 μg/mL Tetracyclin-haltigem Wachstumsmedium kultiviert werden und entweder 1 μM CL-387.785 oder 1 μM von DAPT mit dem Luciferase-Signal ausgesendet von DMSO behandelt CG oder NG Zellen (100 % relative γ-Sekretase Tätigkeit als 2.1 definiert).

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Ergebnisse

Hemmung der ErbB2 von CL-387.785 kann die Verarbeitung von APP-C99 von differentiell fördern Γ -Sekretase ohne Kerbe Spaltung
Um eine zellbasierte Assays zu etablieren, die die proteolytische Spaltung eines bestimmten γ-Sekretase-Substrats quantitativ messen kann, erzielten wir die HEK293 abgeleitet CG-Zell-Linie durch stabile Co Transfektion von einem Tetracyclin-induzierbaren C unheilbar Gal4/VP16-Tags APP-C99 und eine Gal4 Projekttr...

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Diskussion

Die vielversprechenden Ergebnisse aus Phase 1 b-Studie von Aducanumab Immuntherapie für AD haben die kritische Rolle von Aβ in der Pathogenese der AD22 fest etabliert und legen nahe, dass Anti-Aβ Ansätze noch eine tragfähige Strategie für die Entwicklung von Anti-AD Drogen sind. Hier beschreiben wir zellbasierte Assays für die Quantifizierung der γ-Sekretase-katalysierte Proteolyse von APP-C99 und NΔE mit Firefly Luciferase Reporter Systemen. APP-C99 und NΔE sind die zwei am meisten gut untersucht...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren danken den Core Facility der Institute der zellulären und Organismische Biologie, Academia Sinica, für technischen Support. Diese Studie wurde unterstützt durch das Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan (die meisten 103-2320-B-001-016-MY3, Y.-F. L.), das Programm für Translationale Innovation der biopharmazeutischen Entwicklung – Technologie unterstützt Plattform Achse Schema (NP7, Y. v.l.), und Academia Sinica (, Y.-v.l.).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
VictorLight Lumineszenzplatten-LesegerätPerkinElmer2030-0010
Klasse II, Typ 2 Biologische SicherheitswerkbankThermo Scientific1300 Serie A2
CL-387,785EMD Calbiochem233100-1MG
DAPTMerck565770
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher12100046Hauptbestandteil des Wachstumsmediums
Fötales Rinderserum (FBS)Thermo Fisher16000044
BlasticidinThermo FisherA1113903
ZeocinThermo FisherR25005
Hygromycin BGibco10687010
HämozytomerSigma-AldrichBR717805 Aldrich
96-Well-MikroplatteNunc156545
TetracyclinSigmaT7660
Dimethylsulfoxid (DMSO)SigmaD2650
Steady-Glo Luciferase Assay ReagenzPromegaE2510
Befeuchteter CO2 InkubatorRevcoUltima II
T-REx293 ZelllinieInvitrogenR71007
Wallac 1420 Software Version 3.0PerkinElmerInstrumentensteuerungssoftware des Lumineszenz-Mikroplatten-Readers

Referenzen

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