Experimentelles Protokoll zum Nachweis der mitochondrialen Funktion in Hepatozyten, die Organochlor-Pestiziden ausgesetzt sind

Summary

Das Verständnis des Einflusses von Umweltorganochlor-Pestiziden (OCPs) auf die mitochondriale Funktion in Hepatozyten ist wichtig bei der Erforschung des Mechanismus von OCPs, die Stoffwechselstörungen verursachen. In diesem Beitrag werden detaillierte Methoden zum Nachweis der hepatischen mitochondrialen Funktion beschrieben.

Abstract

Dieses Papier stellt detaillierte Methoden zum Nachweis der hepatischen mitochondrialen Funktion vor, um die Ursache von Stoffwechselstörungen, die durch Organischechlorpestizide (OCPs) in Hepatozyten verursacht werden, besser zu verstehen. HepG2-Zellen wurden 24 h lang bei einer äquivalenten Dosis interner Exposition in der allgemeinen Population einem Hexachlorcyclohexan (-HCH) ausgesetzt. Die Ultrastruktur in Hepatozyten wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) untersucht, um die Schäden von Mitochondrien aufzuzeigen. Die mitochondriale Funktion wurde weiter durch die mitochondriale Fluoreszenzintensität, adenosin5'-Triphosphat (ATP)-Spiegel, die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und das mitochondriale Membranpotential (MMP) in HepG2-Zellen, die mit dem Wert von -HCH inkubiert wurden, untersucht. Die Mitochondrienfluoreszenzintensität nach der Färbung durch mitochondriale grüne Fluoreszenzsonde wurde mit einer Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. Die Luziferin-Luziferase-Reaktion wurde verwendet, um ATP-Spiegel zu bestimmen. Das MMP wurde vom kationischen Farbstoff JC-1 nachgewiesen und unter Strömungszytometrie analysiert. OCR wurde mit einem extrazellulären Flussanalysator gemessen. Zusammenfassend wurden diese Protokolle verwendet, um mitochondriale Funktion in Hepatozyten mit zur Untersuchung von Mitochondrienschäden zu untersuchen.

Introduction

Die Auswirkungen von Organochlor-Pestiziden (OCPs) auf die Gesundheit, z. B. reproduktive Interferenzen, immunologische Toxizität, metabolische Veränderungen wurden zuvor untersucht^1,2,3. Die Methoden, um zellulären Stoffwechsel zu erkennen und herauszufinden, mitochondriale Dysfunktion haben Wissenschaftler in die Lage, die Rolle der mitochondrialen Funktion zu verstehen(d.h., mitochondriale STAT3-Spiegel, Laktat, Pyruvat, Laktat-Zu-Pyruvat-Verhältnis, Coenzym Q10, mitochondriales Protonenleck, Bioenergetik, Biogenese und Dynamik) in Bereichen wie Alterung, Fettleibigkeit, Diabetes, Herz-Kreislauf-Funktion, Krebs und Sicherheitstoxizität^4,5,6,7. In diesem Beitrag beschreiben wir die Methoden zur Bewertung der durch OCPs verursachten mitochondrialen Dysfunktion.

Wir setzten HepG2-Zellen 24 h in einer Dosis, die der inneren Exposition des Menschen entspricht, einem repräsentativen OCPs (Hexachlorcyclohexan) aus. Erstens wurde TEM angewendet, um die Ultrastruktur von Hepatozyten wie Kernen, Mitochondrien und endoplasmatischem Retikulum⁸zu beobachten. Im Vergleich zu gewöhnlichen Mikroskopen ermöglicht TEM die Untersuchung der 2D- und 3D-Ultrastruktur von Zellen und Zellkomponenten (Zelllinien oder Gewebe), der Morphologie, der chemischen Zusammensetzung sowie der Funktion natürlicher oder künstlicher Materialien, die in der modernen Wissenschaft und Technologie eine zentrale Rolle spielen. Die mitochondriale Funktion wurde weiter durch die mitochondriale Fluoreszenzintensität, adenosin5'-Triphosphat (ATP)-Spiegel, die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und das mitochondriale Membranpotential (MMP) in HepG2-Zellen, die mit dem Wert von -HCH inkubiert wurden, untersucht. Mito-tracker grün ist eine mitochondriengrüne Fluoreszenzsonde, die für lebende Zellmitochondrial-spezifische fluoreszierende Färbung verwendet werden kann. Die Mitochondrien in Hepatozyten wurden durch mito-tracker grüne Lösung und mitochondriale Fluoreszenzintensität, Anzahl und Muster wurden mit einer konfokalen Mikroskopie⁹beobachtet. Mitochondriale grüne Fluoreszenzsonde kann verwendet werden, um lebende Zellen zu färben. Im Vergleich zu Rhodamin 123 oder JC-1 hängt die mitochondriale grüne Fluoreszenzsonde nicht vom mitochondrialen Membranpotenzial für mitochondriale Färbung ab. ATP-Spiegel wurden durch ein Luziferase-Luziferin-Kit bestimmt und durch Proteinkonzentration normalisiert. ATP Assay Kit kann verwendet werden, um ATP-Spiegel in gängigen Lösungen, Zellen oder Geweben zu erkennen. Dieses Kit basiert auf Glögfliegen-Luziferase, die durch Fluorescein katalysiert werden, um Fluoreszenz zu erzeugen, wenn ATP zur Energiebereitstellung benötigt wird. Wenn die Galleife und Fluorescein in einem bestimmten Konzentrationsbereich exzessiv sind, ist die Erzeugung von Fluoreszenz proportional zur ATP-Konzentration. Darüber hinaus wurde dieses Kit speziell entwickelt, um die Chemilumineszenz von ATP zu optimieren. ATP als wichtigste Energiemoleküle spielt eine wichtige Rolle in den verschiedenen physiologischen oder pathologischen Prozessen der Zellen. Veränderungen der ATP-Spiegel können Defekte in der Zellfunktion widerspiegeln, insbesondere die mitochondriale Energieerzeugung. In der Regel unter Apoptose, Nekrose oder in einem toxischen Zustand, zelluläre ATP-Spiegel reduziert ¹⁰. MMPs Assay Kit mit JC-1 ist ein Kit, das JC-1 als Fluoreszenzsonde verwendet, um Zellen, Gewebe oder gereinigte MMPs schnell und empfindlich zu erkennen. Es kann zur Früherkennung von Apoptose verwendet werden. Der kationische Farbstoff JC-1 ist eine fluoreszierende Sonde, die verwendet wird, um das MMP zu detektieren, das unter Durchflusszytometrie analysiert werden kann, die durch Veränderungen des grünen und roten Fluoreszenzverhältnisses angezeigt wird. Wenn das MMP hoch ist, wird JC-1 in der Matrix der Mitochondrien zu einem Polymer (J-Aggregate) aggregiert, das rote Fluoreszenz erzeugt. Wenn das MMP niedrig ist, kann JC-1 nicht akkumulieren und bildet Monomer, das grüne Fluoreszenz¹¹erzeugt. Das Verhältnis von roter und grüner Fluoreszenz kann also das MMP-Niveau widerspiegeln. Die OCR von Zellen ist ein entscheidender Indikator für die normale zelluläre Funktion¹². Es gilt als Parameter für die Forschung mitochondriale Funktion. Das Cell Mito Stress Test Kit bietet eine stabile Methode zur Analyse wichtiger Parameter der mitochondrialen Funktion. Das Kit bietet Qualitätskontrolle und prädiktive Reagenzien sowie eine Standardmethode für die Durchführung von Zellmitochondrialen Stresstests. Es kann verwendet werden, um alle Zelltypen zu erkennen, einschließlich Primärzellen, Zelllinien, suspendierte Zellen, und auch für Inselchen, Nematoden, Hefen und isolierte Mitochondrien.

OCR-Messungen können wertvolle Einblicke in den physiologischen Zustand oder Veränderungen von Zellen geben. Es wurde mit einem extrazellulären Flussanalysator bestimmt, um Atembasislinie, Protonenleck, maximale Atemwege, ATP-Umsatz und Reservekapazität zu erkennen. Kurz gesagt, nach Basismessungen von OCR, OCR wurde nach sequenzieller Zugabe zu Oligomycin (ATP Coupler), FCCP (mitochondrialoxide oxidative Phosphorylierung Entkoppler) und Antimycin A/Roton (ein Inhibitor des Sauerstoffverbrauchs) pro Brunnen nachgewiesen.

In dem Bestreben, die Entwicklung eines spezifischeren Protokolls zum Nachweis der mitochondrialen Funktion in Hepatozyten in vitro zu erleichtern, präsentieren wir hier Experimente von TEM, konfokale Mikroskopie, Luminometer, Durchflusszytometrie und extrazelluläre Flussanalysatoren mit zukünftiger Anwendung bei der Untersuchung von Mitochondrien, die mit negativen Ergebnissen zusammenhängen.

Protocol

Alle Experimente und die Versuchsprotokolle wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt und von der lokalen Ethikkommission der Medizinischen Universität Nanjing genehmigt.

1. Mitochondriale Ultrastruktur von TEM

1. Sammeln von HepG2-Zellen
   1. Seed HepG2 Zellen in 100 mm Geschirr. Bei 37 °C und 5% CO₂lagern.
   2. Verdauungszellen mit 0,25% EDTA in 1,5 mLEP-Röhre.
   3. Zentrifuge bei 1000 x g für 3 min bei Raumtemperatur (RT). Entsorgen Sie den Überstand.
   4. Sammeln Sie 4-6 x 10⁵ HepG2-Zellen.
2. 1 ml 5% Glutaraldehyd (Lösungsmittel: doppeldestilliertes Wasser) mit Pipetten hinzufügen und bei 4°C für 2 h inkubieren.
3. In 4 Wechseln von 1 ml Phosphatpuffer (mit Na₂HPO₄, KH₂PO₄, NaCl und KCl, pH 7,4) hinzufügen und waschen), jeweils 15 min. Phosphatpuffer mit Pipetten aussaugen.
4. 200 m Osmium (Lösungsmittel: doppelt destilliertes Wasser) hinzufügen und bei 4 °C für 2 h bis schwarze Probe inkubieren.
   Achtung: Osmium ist eine hochgiftige und flüchtige Substanz. Es sollte im Drogenschrank sorgfältig betrieben werden.
5. Fügen Sie in 2 Veränderungen von 1 ml Phosphatpuffer, jeweils 5 min. Saugen Sie Phosphatpuffer aus.
6. Stain in 2% Uranylacetatlösung (Lösungsmittel: doppeldestilliertes Wasser und Essigsäure) in 1,5 ml EP-Rohr für 2 h.
7. Dehydrieren und untertauchen durch 50% Aceton, 70% Aceton, 90% Aceton (Lösungsmittel: doppelt destilliertes Wasser), 2 Veränderungen des absoluten Acetons, je 15 min.
8. In 2 Tropfen Aceton (100%)/Einbettungsmittel (1:1) für 1,5 h bei RT eindringen. Epon812 Einbettungsmittel, das Rezept ist wie folgt: A: Epon812, 62 ml und DDSA, 100 ml; B: Epon812, 100 ml und MNA 89 ml. A:B=2:8 (v:v, im Winter), A:B=1:9 (v:v, im Sommer). Einbettung in Einbettformen (weiche Kunststoffplatte mit kariertem Gitter).
9. Nacheinander bei 37 °C für 12 h, 45 °C für 12 h und dann 60 °C für 48 h inkubieren.
10. Vorbereiten und beobachten Sie ultradünne Abschnitte (die größte Fläche darf 0,5 mm x 0,3 mm überschreiten) durch ultradünne Abschnitte Maschine und TEM (2 m und 500 nm).

2. Mitochondriale Fluoreszenzintensitätsdetektion

1. Samen 2x 10⁴ HepG2-Zellen in 6-Well-Platten. Fügen Sie die Datei für 24 h hinzu.
2. Fügen Sie wasserfreies DMSO hinzu, um eine Endkonzentration von 1 mM mitochondriale grüne Fluoreszenzsonde zu formulieren.
3. 1 ml mitochondriale grüne fluoreszierende Sondenlösung (Endkonzentration: 200 nM) zu jedem Brunnen von 6-Well-Platten geben, bei 37 °C für 45 min inkubieren.
4. Entfernen Sie die mitochondriale grüne Fluoreszenzsondenlösung und fügen Sie vor der Bildgebung ein frisch zubereitetes Zellkulturmedium (DMEM) bei 37 °C hinzu.
5. Beobachten Sie die mitochondriale grüne Fluoreszenz durch ein Fluoreszenzmikroskop (10x). Die maximale Anregungswellenlänge bei der Detektion beträgt 490 nm und die maximale Emissionswellenlänge beträgt 516 nm.

3. Assay der zellulären ATP-Spiegel

1. Seed HepG2-Zellen in 6-Well-Platten. Fügen Sie die Datei für 24 h hinzu.
2. Fügen Sie 200 L Lysepuffer aus dem luziferase-luzifferin ATP Assay Kit zu jedem Brunnen von 6-Well-Platten. Zentrifuge bei 12.000 x g für 5 min bei 4 °C, den Überstand mit Pipetten in neue Schläuche einsammeln.
3. Verdünnen Sie das ATP-Detektionsreagenz mit der ATP-Verdünnung im Verhältnis 1:5 als ATP-Erkennungspuffer.
4. Vorbereiten der Standardkurvenbestimmung: Verdünnen Sie die 0,5 mM ATP-Standardlösung auf 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 m durch ATP-Lysepuffer.
5. Fügen Sie 100 L ATP-Erkennungspuffer in eine 96-Well-Platte für 5 min bei RT, und fügen Sie 100 L Überstand der Zelle, durch ein Luminometer (Chemilumineszenzdetektor) zu erkennen. Berechnen Sie die ATP-Konzentration (nmol/L) über die Standardkurve.
6. Erkennen Sie die Proteinkonzentration durch ein BCA Protein Assay Kit mit Multimode-Reader.
   1. Vorbereitung der Standardkurvenbestimmung: Verdünnen Sie die 5 mg/ml Proteinstandardlösung auf 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 und 0,5 mg/ml durch doppelt destilliertes Wasser.
   2. Fügen Sie 1 L Desobtant der Zelle in eine 96-Well-Platte und fügen Sie 19 l doppelt destilliertes Wasser hinzu.
   3. Fügen Sie für jeden Brunnen 200 L BCA-Erkennungslösungen hinzu. Bei 37 °C für 30 min inkubieren. Erkennen Sie den OD-Wert (optische Dichte) durch einen Multimode-Reader mit 562 nm. Berechnen Sie die Proteinkonzentration (mg/ml) über die Standardkurve.
7. Korrigieren Sie den ATP-Gehalt pro mg-Proteinkonzentration (Einheit: ATP-Konzentration/Proteinkonzentration, nmol/mg).

4. Mitochondriale Membranpotenzial (MMP) Bewertung durch JC-1

1. Sammeln Sie HepG2-Zellen, die in 6-Well-Platten gesät sind. Verdauungszellen mit 0,25% EDTA in 1,5 ml EP-Rohr, Zentrifuge bei 1000 x g für 3 min, verwerfen den Überstand und sammeln Zellen.
2. 50 L JC-1 (200X) zu 8 ml destilliertem Wasser in den Wirbel geben und mischen. Fügen Sie als JC-1-Erkennungslösung 2 ml JC-1 (5X) Färbepuffer hinzu.
3. Inkubieren Sie Zellen mit einer Mischung aus 0,5 ml Zellkulturmedium und 0,5 ml JC-1-Detektionslösung für 20 min bei 37 °C.
4. Zentrifuge bei 600 x g für 3 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand.
5. In 2 Veränderungen von 1 ml JC-1 (1X) Färbepuffer abspülen, Zentrifuge bei 600 x g für 3 min bei 4 °C. Und verwerfen Sie den Überstand.
6. Suspend Zellen in 0,5 ml JC-1 (1X) Färbepuffer, analysieren über Durchflusszytometrie, um grüne und rote Fluoreszenz zu erkennen. Wenn das JC-1-Polymer erkannt wird, stellen Sie das Anregungslicht auf 490 nm und das Emissionslicht auf 530 nm ein. Wenn das JC-1-Polymer erkannt wird, stellen Sie das Anregungslicht auf 525 nm und das Emissionslicht auf 590 nm ein.

5. Messungen des Sauerstoffverbrauchs (OCR)

1. Saat-HepG2-Zellen in Zellkultur-Mikroplatten von 96-Well mit einer Dichte von 4500 Zellen/100 l pro Brunnen. Stellen Sie sicher, dass die Zellen nach 24 h mit jedem Gut bedeckt sind.
2. Fügen Sie das entsprechende Volumen der vorbereiteten Reagenzien in den entsprechenden Injektionsanschluss, nach vorheriger Literatur¹³. Port A: 25 L 1 M Oligomycin (ATP Coupler); Anschluss B: 25 l 0,75 m FCCP (Electronic Throttle Control, ETC Accelerator); Port C: 25 l 0,5 des Antimycins A/Roton (mitochondrialer Inhibitor A und mitochondrialer Inhibitor B).
3. Kartusche in einem 37 °C-Inkubator ohne CO₂ lagern, bis sie einsatzbereit ist.
4. Machen Sie einen mittleren Wechsel der Zellplatte, indem Sie das laufmittlere Medium aus jedem Brunnen entfernen und das neue DMEM ergänzen. Das Endvolumen für jeden Bohrwert beträgt 180 l.
5. Bewahren Sie die Zellplatte in einem 37 °C-Inkubator ohne_CO2 1 h vor dem Test auf.
6. Nehmen Sie OCR automatisch per Software auf.
   1. Öffnen Sie die OCR-Software.
   2. Wählen Sie Cell Mito Stress Test Kit im Dropdown-Menü Apps aus.
   3. Klicken Sie auf die Schaltfläche App starten.
   4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Stresstest ausführen. Der Bildschirm "Zellenstresstest-Setup" wird angezeigt.
   5. Gehen Sie wie folgt vor:
      1. Geben Sie die Anzahl der Zellen, die pro Bohrung gesät werden, in das Feld Zellsaat - ein.
      2. Geben Sie die durchschnittliche OCR in das Feld Durchschnittliche Basal-OCR ein.
      3. Geben Sie die endgültige Arbeitskonzentration für jedes Reagenz ein und injizieren Sie die Reagenzien.
         HINWEIS: Der durchschnittliche Basal-OCR-Wert für die Zelle sollte vor dem Ausführen des Optimierungstestes bei der Optimierung der Zellsaatkonzentration erkannt worden sein.
      4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter. Der Gruppeninfo-Bildschirm wird angezeigt.
      5. Weisen Sie den nicht zugewiesenen Brunnen eine Gruppe zu, indem Sie eine Farbe auswählen und einen Namen geben und dann auf die entsprechenden Brunnen klicken.
         HINWEIS: Die verschiedenen Gruppen werden vor dem Ausführen des Cell Mito Stress Tests als verschiedene Behandlungen definiert. Alle Brunnen von Mikroplatten erhalten die gleichen Reagenzinjektionen, wenn der Stresstest durchgeführt wird.
      6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter. Der Bildschirm "Stresstest-Injektionslayout" wird angezeigt.
      7. Klicken Sie auf Start. Der Stresstest wird jetzt auf dem Analyzer ausgeführt. Wenn der Lauf beendet ist, folgen Sie dem Punkt s in der Software, entfernen und entsorgen Sie die Patrone und die Zellplatte.

Results

Die Mitochondrien-Cristae der HepG2-Zellen, die dem HCH ausgesetzt waren, wurden deutlich beschädigt. Zerstreute Mitochondrien waren leicht bis deutlich erweitert, unregelmäßig geformt, und mitochondriale Grat verschwand mit relativ abnormaler mitochondrialer Architektur (Abbildung 1).

Die durchschnittliche mitochondriale grüne Fluoreszenzintensität, die die Mitochondrien darstellt, verringerte sich...

Discussion

Entscheidend für den Erfolg des Nachweisprotokolls ist die Verwendung einer Vielzahl experimenteller Methoden, die in der Studie vom Phänotyp bis zum Mechanismus behandelt wurden. In dieser Studie wurden HepG2-Zellen in DMEM mit Penicillin und Streptomycin und 10% fetalem Rinderserum kultiviert. Wenn die Zellen 40-50% Zusammenfluss erreichten, wurden die Zellen (0, 10, 100 ng/mL) zugesetzt und für 24 h inkubiert. Wir verwendeten zunächst TEM, das die ultrastrukturellen Veränderungen in Hepatozyten zeigte, die durch die r...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transmissionselektronenmikroskop	FEI	Tecnai G2 Spirit Bio TWIN	Kontrastreiche, hochauflösende Bildgebung, Niedrigdosis-Beobachtung und Bildgebung, Beobachtung bei niedrigen Temperaturen, Hervorragende analytische Leistung, Automatisierung für Komfort und
Leistung Mito-Tracker Green	Beyotime	C1048	Mito-Tracker Green ist eine mitochondriale grüne Fluoreszenzsonde, die für die mitochondriale Fluoreszenzfärbung von lebenden Zellen verwendet werden kann.
Konfokales Laserscanning-Mikroskop	Zeiss	700B	Das Design ist kompakt, stabil, der Strahlengang ist der kürzeste, hohe Lichtpräzision, kreative Technologie und ausgeklügelte Scantechnologie zusammen, um ein perfektes 3-dimensionales Probenbild zu erzeugen.
Erweitertes ATP-Assay-Kit	Das Beyotime	S0027	Enhanced ATP-Assay-Kit kann zum Nachweis des ATP-Spiegels (Adenosin-5'-triphosphat) in gängigen Lösungen, Zellen oder Geweben verwendet werden. Zell- und Gewebeproben können geteilt werden, um die Probenvorbereitung abzuschließen, die Nachweisempfindlichkeit beträgt bis zu 0,1 nmol / L, die Chemilumineszenz kann 30 Minuten lang aufrechterhalten werden.
Luminometer	Berthold	Centro LB 960	Luminometer ist ein Chemilumineszenzdetektor, der Prüfling selbst kann leicht sein, muss nicht stimuliert werden. Das Luminometer ist das Instrument, das Chemilumineszenz erkennt.
BCA Protein Assay Kit	Beyotime	P0012	Das BCA Protein Assay Kit ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden zum Nachweis von Proteinkonzentrationen.
Multimode-Reader	TECAN	InfiniteM200	Multimode-Reader zur Erkennung der Proteineinwilligung verwendet werden.