Experimentelles Protokoll zum Nachweis der mitochondrialen Funktion in Hepatozyten, die Organochlor-Pestiziden ausgesetzt sind

Summary

Das Verständnis des Einflusses von Umweltorganochlor-Pestiziden (OCPs) auf die mitochondriale Funktion in Hepatozyten ist wichtig bei der Erforschung des Mechanismus von OCPs, die Stoffwechselstörungen verursachen. In diesem Beitrag werden detaillierte Methoden zum Nachweis der hepatischen mitochondrialen Funktion beschrieben.

Abstract

Dieses Papier stellt detaillierte Methoden zum Nachweis der hepatischen mitochondrialen Funktion vor, um die Ursache von Stoffwechselstörungen, die durch Organischechlorpestizide (OCPs) in Hepatozyten verursacht werden, besser zu verstehen. HepG2-Zellen wurden 24 h lang bei einer äquivalenten Dosis interner Exposition in der allgemeinen Population einem Hexachlorcyclohexan (-HCH) ausgesetzt. Die Ultrastruktur in Hepatozyten wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) untersucht, um die Schäden von Mitochondrien aufzuzeigen. Die mitochondriale Funktion wurde weiter durch die mitochondriale Fluoreszenzintensität, adenosin5'-Triphosphat (ATP)-Spiegel, die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und das mitochondriale Membranpotential (MMP) in HepG2-Zellen, die mit dem Wert von -HCH inkubiert wurden, untersucht. Die Mitochondrienfluoreszenzintensität nach der Färbung durch mitochondriale grüne Fluoreszenzsonde wurde mit einer Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. Die Luziferin-Luziferase-Reaktion wurde verwendet, um ATP-Spiegel zu bestimmen. Das MMP wurde vom kationischen Farbstoff JC-1 nachgewiesen und unter Strömungszytometrie analysiert. OCR wurde mit einem extrazellulären Flussanalysator gemessen. Zusammenfassend wurden diese Protokolle verwendet, um mitochondriale Funktion in Hepatozyten mit zur Untersuchung von Mitochondrienschäden zu untersuchen.

Introduction

Die Auswirkungen von Organochlor-Pestiziden (OCPs) auf die Gesundheit, z. B. reproduktive Interferenzen, immunologische Toxizität, metabolische Veränderungen wurden zuvor untersucht^1,2,3. Die Methoden, um zellulären Stoffwechsel zu erkennen und herauszufinden, mitochondriale Dysfunktion haben Wissenschaftler in die Lage, die Rolle der mitochondrialen Funktion zu verstehen(d.h., mitochondriale STAT3-Spiegel, Laktat, Pyruvat, Laktat-Zu-Pyruvat-Verhältnis, Coenzym Q10, mitochondriales Protonenleck, Bioenergetik, Biogenese und Dynamik) in Bereichen wie Alterung,....

Protocol

Alle Experimente und die Versuchsprotokolle wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt und von der lokalen Ethikkommission der Medizinischen Universität Nanjing genehmigt.

1. Mitochondriale Ultrastruktur von TEM

1. Sammeln von HepG2-Zellen
   1. Seed HepG2 Zellen in 100 mm Geschirr. Bei 37 °C und 5% CO₂lagern.
   2. Verdauungszellen mit 0,25% EDTA in 1,5 mLEP-Röhre.
   3. Zentrifuge bei 1000 x g für 3 min bei Raumtemperatur (RT). Entsorgen Sie den Überstand.
   4. Sammeln Sie 4-6 x 10⁵ HepG2-Zellen.
2. 1 ml 5% Glutaralde....

Results

Die Mitochondrien-Cristae der HepG2-Zellen, die dem HCH ausgesetzt waren, wurden deutlich beschädigt. Zerstreute Mitochondrien waren leicht bis deutlich erweitert, unregelmäßig geformt, und mitochondriale Grat verschwand mit relativ abnormaler mitochondrialer Architektur (Abbildung 1).

Die durchschnittliche mitochondriale grüne Fluoreszenzintensität, die die Mitochondrien darstellt, verringerte sich.......

Discussion

Entscheidend für den Erfolg des Nachweisprotokolls ist die Verwendung einer Vielzahl experimenteller Methoden, die in der Studie vom Phänotyp bis zum Mechanismus behandelt wurden. In dieser Studie wurden HepG2-Zellen in DMEM mit Penicillin und Streptomycin und 10% fetalem Rinderserum kultiviert. Wenn die Zellen 40-50% Zusammenfluss erreichten, wurden die Zellen (0, 10, 100 ng/mL) zugesetzt und für 24 h inkubiert. Wir verwendeten zunächst TEM, das die ultrastrukturellen Veränderungen in Hepatozyten zeigte, die durch die r.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transmissionselektronenmikroskop	FEI	Tecnai G2 Spirit Bio TWIN	Kontrastreiche, hochauflösende Bildgebung, Niedrigdosis-Beobachtung und Bildgebung, Beobachtung bei niedrigen Temperaturen, Hervorragende analytische Leistung, Automatisierung für Komfort und
Leistung Mito-Tracker Green	Beyotime	C1048	Mito-Tracker Green ist eine mitochondriale grüne Fluoreszenzsonde, die für die mitochondriale Fluoreszenzfärbung von lebenden Zellen verwendet werden kann.
Konfokales Laserscanning-Mikroskop	Zeiss	700B	Das Design ist kompakt, stabil, der Strahlengang ist der kürzeste, hohe Lichtpräzision, kreative Technologie und ausgeklügelte Scantechnologie zusammen, um ein perfektes 3-dimensionales Probenbild zu erzeugen.
Erweitertes ATP-Assay-Kit	Das Beyotime	S0027	Enhanced ATP-Assay-Kit kann zum Nachweis des ATP-Spiegels (Adenosin-5'-triphosphat) in gängigen Lösungen, Zellen oder Geweben verwendet werden. Zell- und Gewebeproben können geteilt werden, um die Probenvorbereitung abzuschließen, die Nachweisempfindlichkeit beträgt bis zu 0,1 nmol / L, die Chemilumineszenz kann 30 Minuten lang aufrechterhalten werden.
Luminometer	Berthold	Centro LB 960	Luminometer ist ein Chemilumineszenzdetektor, der Prüfling selbst kann leicht sein, muss nicht stimuliert werden. Das Luminometer ist das Instrument, das Chemilumineszenz erkennt.
BCA Protein Assay Kit	Beyotime	P0012	Das BCA Protein Assay Kit ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden zum Nachweis von Proteinkonzentrationen.
Multimode-Reader	TECAN	InfiniteM200	Multimode-Reader zur Erkennung der Proteineinwilligung verwendet werden.