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Methodenartikel

Bewertung von Stammzelltherapien in einem bilateralen Patellasehne Verletzungen Modell bei Ratten

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DOI:

10.3791/56810

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30. März 2018

 ,  ,  ,  , 
1College of Veterinary Medicine, Western University of Health Sciences, 2Applied Medical, 3College of Veterinary Medicine, Iowa State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Papier beschreibt die Vorbereitung und Auswertung der Nabelschnur Matrix-mesenchymale Stammzellen Sphäroide mit einem bilateralen Patellasehne defekt-Modell in eine Ratte. Dieses Modell wurde wurde mit einer akzeptablen Morbidität verbunden festgestellt, dass die Unterschiede zwischen unbehandelten und behandelten sehnen erkennen und zwischen den beiden Behandlungen getestet.

Zusammenfassung

Regenerativer Medizin bietet neuartige Alternativen zu Bedingungen, die traditionelle Behandlungen herausfordern. Die Prävalenz und die Morbidität der Sehnenerkrankung Arten, kombiniert mit den begrenzten heilenden Eigenschaften dieses Gewebes, aufgefordert, die Suche nach Zelltherapien und trieb die Entwicklung der experimentellen Modellen, deren Wirksamkeit zu studieren. Nabelschnur Matrix mesenchymaler Stammzellen (UCM-MSC) sind ansprechende Kandidaten, weil sie sind reichlich vorhanden, leicht zu sammeln, zu umgehen, die ethische Bedenken und das Risiko von Teratom Bildung noch primitiven embryonalen Stammzellen mehr ähneln als Erwachsenen Gewebe abgeleitet MSCs. signifikante Interesse konzentriert sich auf Chitosan als Strategie, um die Eigenschaften des MSCs durch Sphäroid Bildung zu verbessern. Dieses Papier Details Techniken UCM-MSCs isolieren Sphäroide auf Chitosan Film vorzubereiten und analysieren die Wirkung der Sphäroid Bildung auf Surface Marker Ausdruck. Erstellung eines bilateralen Patellasehne Verletzungen Modells bei Ratten wird folglich für in Vivo Implantation der UCM-MSC Sphäroide auf Chitosan Film gebildet beschrieben. Ohne Komplikationen beobachtet wurde in der Studie in Bezug auf Morbidität, steigenden Effekte oder Gewebe Infektion zu betonen. Funktionale Gesamtpunktzahl der betriebenen Ratten nach 7 Tagen war niedriger als die von normalen Ratten, aber innerhalb von 28 Tagen nach der Operation zur Normalität zurückgekehrt. Histologischen Resultate von Heilung des Gewebes bestätigte das Vorhandensein eines Gerinnsels in behandelten Mängel 7 Tage ausgewertet aufgrund fehlender Fremdkörperreaktion und mit 28 Tagen Heilung voran. Dieses bilaterale Patella Sehne defekt Modell war steuert interindividuelle Variation durch Erstellung einer internen Kontrolle in jede Ratte mit akzeptablen Morbidität verbunden und erlaubt die Erkennung von Unterschieden zwischen unbehandelten Sehnen und Behandlungen.

Einleitung

Sehnenverletzung ist eines der häufigsten Ursachen für erhebliche Schmerzen und Muskel-Atrophie Arten1. In der Veterinärmedizin sind Sehnen und Bänder Verletzungen von besonderem Interesse bei Pferden, wie 82 % aller Verletzungen im Rennpferde des Muskel-Skelett-Systems einbeziehen, und 46 % der Befragten Einfluss auf Sehnen und Bänder2,3. Bildung von Narbengewebe beeinflusst die biomechanischen Eigenschaften des geheilten Sehnen und erklärt die bewachte Prognose für Rückkehr zur sportlichen Nutzung nach Flexor Sehnenverletzungen; Re-Verletzung tritt innerhalb von 2 Jahren in bis zu 67 % der Pferde4konservativ behandelt. Regenerativer Medizin bietet neuartige Alternativen zu eine Bedingung, die traditionelle Behandlungen herausfordert. Autologe Stammzell-Therapie hat einige ermutigende Ergebnisse5,6 aber ist begrenzt durch die Morbidität verbunden mit Gewebe Sammlung, verzögerte Verwaltung aufgrund der Verarbeitung/Neuprogrammierung der Zellen und der Einfluss von der Gesundheitszustand des Patienten (z.B. Alter) auf die Eigenschaften der Stammzellen Zellen7,8. Diese Einschränkungen bieten eine Begründung für die Untersuchung von allogenen Stammzellen als handelsübliche Alternative. Fetale Adnexe-abgeleitete Zellen sind ansprechende Kandidaten, weil sie die ethische Bedenken und das Risiko von Teratom Bildung verbunden mit embryonalen Stammzellen umgehen. Gehört der fetalen Adnexe Nabelschnur Matrix (UCM), auch benannt Wharton Gelee, reichlich vorhanden und leicht zu sammeln.

Unabhängig von der Zelle Quelle unbedingt verbessern Stemness eine Zellbank für allogene regenerative Medizin zu etablieren. In funktioneller Hinsicht kann Stemness definiert werden als das Potenzial für die Differenzierung der Selbsterneuerung und Multi-Linie9. Nachweis der Stemness stützt sich auf die Proliferation und Differenzierung Assays, zusammen mit Ausdruck des Gens Marker Oct4, Sox2, und Nanog9. Eine Strategie zur Verbesserung der Stemness beruht auf der Verwendung von Biomaterialien als nichtig Füllstoffe und Verbesserung der Proliferation und Differenzierung der UCM-MSCs Träger dienen. Dieser Ansatz verhindert Bedenken in Bezug auf Manipulation der transcriptional Faktoren Reife Zellen in induzierte pluripotente Zellen umzuprogrammieren. Unter Biomaterialien als mögliche Träger Stammzellen zu gewinnen ist Chitosan attraktiv für seine Biokompatibilität und Abbaubarkeit10. Diese natürlichen Aminopolysaccharide bildet alkalischen Deacetylation von Chitin, das zweithäufigste natürliches Polysaccharid in erster Linie als eine Subproduct der Schalentiere10erhalten. Wir haben zuvor untersucht Wechselwirkungen zwischen MSCs und Chitosan Gerüste und beobachtet die Bildung von Sphäroide11,12,13,14,15, 16. berichteten wir auch über die Überlegenheit des werden auf Chitosan Matrizen12,13,14,15,16,17, 18. In jüngerer Zeit, zwei unabhängige Studien beschrieben Sphäroide Bildung von Fettgewebe und Plazenta-Gewebe abgeleitet MSCs auf einem Chitosan Film19,20kultiviert. Diese Formation der Sphäroide nicht nur verbesserte Stemness, sondern verbessert auch die Aufbewahrung von Stammzellen nach in-Vivo Implantation20.

Die Prävalenz und die Morbidität der Sehnenerkrankung Arten haben die Entwicklung der experimentellen Modellen zu studieren die Pathophysiologie der Sehnenpathologien und testen neue Therapien wie Stammzellinjektionen aufgefordert. Bei Pferden ist Kollagenase-induzierten Sehnenentzündungen ein gemeinsames Modell mit MSCs in Sehne Reparatur21Wirksamkeit zu demonstrieren. Die Relevanz dieses Ansatzes ist begrenzt, da Injektionen akute entzündliche Veränderungen verursachen, während klinischen Sehnenpathologien führen in der Regel aus chronische Überforderung22,23. Darüber hinaus chemische Induktion der Sehne Krankheit induziert eine heilende Reaktion und repliziert nicht beeinträchtigten Heilungsprozess im klinischen Fällen22,23. Exzision eines Segments der oberflächlichen Beugesehne Sehne wurde als chirurgische Modell von Tendinitis bei Pferden24beschrieben. In jüngerer Zeit, war ein minimal-invasive Ansatz verwendet, um die traumatischen Schäden an den zentralen Kern der oberflächlichen Beugesehne Sehne25einzuschränken. Chirurgische Modelle simuliert nicht die Müdigkeit-Mechanismus, der zu natürlichen Sehne Krankheit führen, und neigen dazu, Reproduzierbarkeit in das Ausmaß des Schadens25erstellt. Unabhängig von dem Modell, die Morbidität und Kosten im Zusammenhang mit equine Modelle der Sehne sind Krankheiten zusätzliche Einschränkungen, die ein Interesse an Nager-Modelle als ein erster Schritt für in Vivo Evaluation neuartiger Therapien zu rechtfertigen.

Einer der Hauptvorteile der experimentellen Modellen bei Nagetieren besteht aus die Kosten und die Fähigkeit, interindividuelle Variabilität zu kontrollieren. Nagetiere können in Bezug auf verschiedene physiologische Faktoren aufgrund ihrer rasanten Wachstumsraten standardisiert werden und relativ kurzen Lebensspanne und Abweichungen zu begrenzen und somit Verringerung der Zahl der Tiere erforderlich, Unterschiede zu erkennen. Strategien zur Sehne Krankheiten bei Nagetieren induzieren haben chemische Induktion, sondern auch über chirurgische Einrichtung teilweise Sehne Defekte21verlassen. Chirurgische Modelle können natürliche Sehnenpathologien besser als chemische Modelle simulieren, sondern zu höheren Morbidität und Totalausfall der beschädigten Sehne führen können. In dieser Hinsicht scheinen Ratten bessere Kandidaten als Mäuse für diese Modelle, da ihre Größe größere Defekte, wodurch Bewertung der Heilung des Gewebes ermöglicht. Sprague-Dawley Ratten wurden in experimentellen Studien der Sehnenpathologien in vier großen Sehne Gruppen verwendet: Rotatorenmanschette, Flexor, Achilles und Patella sehnen26. Unter diesen sind die Modelle mit der Patellasehne aufgrund der Größe dieser Sehne und die Leichtigkeit des Zugriffs auf es27besonders reizvoll. Die Patellasehne misst die Quadrizeps tibiale Tuber. Innerhalb dieser Beinstrecker-Mechanismus ist die Patella eine sesamoid Knochen, der leitet der Aktion des Quadrizeps und umreißt das proximale Ausmaß der Patellasehne. Das Vorhandensein von knöchernen Ankern an den proximalen und distalen Ausdehnungen der der Patellasehne erleichtert biomechanische Tests. Modelle mit der Patellasehne in der Regel verlassen sich auf einseitige operative Mängel mit einer kontralateralen intakte Sehne dient als ein Steuerelement28,29. Die häufigsten Patellasehne defekt-Modell umfasst den zentralen Teil der Patellasehne von der distalen Spitze der Patella, die Einfügung der tibiale Tuber (1 mm in der Breite) besteuert, während der kontralateralen Patellasehne intakt bleibt. Maßnahmen der Ergebnisse enthalten Histologie, zerstörungsfreie biomechanische Tests oder biomechanische Tests zu scheitern, Ultraschall-Bildgebung, ex Vivo Fluoreszenz-Bildgebung, grobe Beobachtung und Funktionstests28,30 ,31. Einseitige Modelle erlauben keine Vergleich einer vorgeschlagenen Behandlung mit konservativen Management einer ähnlichen Verletzung innerhalb der selben Tier. Vergleich zwischen mehreren Behandlungen erfordert ebenso eigene Tiere. Eine bilaterale Modell würde interindividuelle Unterschiede beseitigen und reduzieren Sie die Anzahl der Tiere, die für eine Studie32erforderlich. Jedoch bilaterale Verletzungen können Morbidität erhöhen und bilaterale Lahmheit Behandlung Bewertung behindern könnte. Einige Studien berichten kurz die Verwendung von bilateralen Patellasehne Mängel in Ratten sondern konzentrieren sich auf die Auswirkungen der Behandlungen statt Peri-operativen Management und Morbidität der das Modell33,34.

Langfristiges Ziel dieser Studie ist zur Entwicklung einer Strategie zur Verbesserung der Stemness und in Vivo Überleben der UCM-MSCs bestimmt zur allogenen Transplantation. Um dieses Ziel zu erreichen, haben wir vor kurzem verbesserten Stemness der UCM-MSCs durch Bildung der Sphäroide auf Chitosan Film- und Inkubation unter hypoxischen Umwelt35berichtet. Diese in-vitro- Eigenschaften waren verbunden mit verbesserten biomechanischen Eigenschaften der Patellasehne Mängel behandelt mit konditionierten UCM-MSCs. basierend auf diesen Ergebnissen, die bilateralen Patellasehne defekt Rattenmodell scheint geeignet, um Kandidaten zu testen Behandlungen für Sehne Verletzungen36. Der Zweck der Studie berichtet hier ist die ausführliche Protokolle für Isolierung und Charakterisierung von UCM-MSCs, Vorbereitung eines biologischen Liefersysteme für Stammzellen, Entstehung und Behandlung von bilateralen Patella Sehne Defekte und Post-operative Erholung und Bewertung der Gewebe, die Heilung innerhalb der Mängel.

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Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Western University of Health Sciences genehmigt.

1. Isolierung und Ausbau der MSCs von Equine Nabelschnur Matrix

  1. Erhalten Sie die Plazenta von einem Erwachsenen Mare (schwanger), nach dem Abfohlen beobachtet und aseptisch isolieren Sie die Nabelschnur aus der Plazenta. Halten Sie die Nabelschnur in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 1 % Penicillin-Streptomycin (P/S) bei 4 ° C während der Übertragung bis zur Verarbeitung.
  2. Waschen Sie die Nabelschnur zweimal mit Raumtemperatur PBS mit 1 % P/S in einem 50 mL-Tube. Abschnitt der Nabelschnur in 2 Zoll langen Fragmente auf 150 mm Teller und waschen in Raumtemperatur PBS mit 1 % P/S in einem 50 mL Röhrchen zwei oder dreimal, bis die meisten der Blut ausgespült wird.
  3. Schneiden Sie die Nabelschnur längs um Schiffe verfügbar zu machen. Schiffe, darunter ein Viruswenig Stiel von der Schnur mit Zange und Schere 2 Arterien und eine Vene zu entfernen. Nabelschnur Matrix (Wharton Gelee), die die gallertartigen Matrix umgebenden Gefäße, auf einen Teller 150 mm durch Kratzen mit einem Skalpell zu sammeln und das Gelee in feine Stücke hacken.
  4. Ort Wharton Gelee aus 2 – 3 Nabelschnur Fragmente (ca. 12 – 15 g) in einen 50-mL-Tube mit 15 mL 0,1 % (w/V) Kollagenase Typ-IA-Lösung mit PBS-Puffer. Inkubation bei 37 ° C mit sanft schütteln für ca. 3-4 h bis aufgelöst.
  5. Zentrifugieren Sie verdaute Gewebe bei 300 X g für 15 min und aspirieren Sie überstand. Aufschwemmen verdaute Gewebe in 15 mL Raumtemperatur PBS mit 1 % P/S, durch Pipettieren mischen, Zentrifugieren bei 150 X g für 5 min und aspirieren überstand (waschen). Wiederholen Sie die Reinigung zweimal mehr.
  6. Aufschwemmen gewaschen Zellen in 15 mL Raumtemperatur PBS mit 1 % P/S, mischen, indem Sie pipettieren, Belastung durch mit 100 µm-Zelle-Sieb, Zentrifuge bei 150 X g für 5 min und aspirieren überstand.
  7. Bereiten Sie Kulturmedium (CM) durch Mischen niedrige Glukose Dulbecco geändert Eagle Medium (LG-DMEM) mit fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % P/S. sterilisieren das Medium durch Filtration.
  8. Aufschwemmen Sie angespannte Zellen in 10 mL von CM auf 37 ° C vorgewärmt, durch Pipettieren mischen Sie, in eine 25 cm2 Gewebekultur Kolben übertragen Sie und 5 % CO2 bei 90 % Luftfeuchtigkeit und 37,0 ° c inkubieren Änderung CM alle 3 Tage, bis die Kultur 70 – 80 % Zusammenfluss erreicht, wenn die Kultur passagiert werden wird.
  9. Um die Kultur die passage, aspirieren Sie CM vom Kolben, zweimal mit 5 mL der Raumtemperatur PBS waschen Sie und mit 3 mL 0,25 % Trypsin/Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) bei 37 ° C für 5 min zu lösen.
  10. Neutralisieren Trypsin/EDTA mit 6 mL CM 37,0 ° c vorgewärmt, mischen, indem Sie pipettieren, übertragen in eine 15 mL-Tube, Zentrifuge bei 150 X g für 5 min und aspirieren überstand. Freistehende Zellen in 1 mL CM Aufschwemmen, Mischen von pipettieren. Zählen der lebensfähigen Zellen verwenden Trypan blau und Hemocytometer. Neu säen in einem 25 cm2 Gewebekultur Kolben bei 5.000 Zellen/cm2, und 5 % CO2 bei 90 % Luftfeuchtigkeit und 37,0 ° c inkubieren

2. Vorbereitung der Sphäroide mit UCM-MSCs kultiviert auf Chitosan Filme

  1. Um 100 mL 1 % (w/V) Chitosan Lösung vorzubereiten, 1 g Chitosan in 99 mL destilliertem Wasser (dH2O), und mischen Sie gut mit einem Magnetrührer.
  2. 670 µL Eisessig hinzufügen und weiter mischen, bis Chitosan löst sich und wird zähflüssig. Dies dauert in der Regel 3 – 4 h.
  3. Fügen Sie 500 µL Chitosan-Lösung in jede Vertiefung der Gewebekultur 12-Well Platte ein und wirbeln Sie die Platte, um Chitosan Lösung gleichmäßig verteilen und alle von der Bodenfläche.
  4. Trocknen Sie Chitosan Lösung beschichtete Platte unter Laminar-Flow Schrank ohne Deckel über Nacht für 24 h. Sobald getrocknet, wird Dünnschicht gebildet und Platte eingehalten werden.
  5. Chitosan-Film durch Zugabe von 1 mL 0,5 N Natriumhydroxid (NaOH) Lösung in jede Vertiefung zu neutralisieren und 2 h bei Raumtemperatur inkubieren. Aspirieren NaOH aus jedem Brunnen und waschen jeweils mit 1 mL dH2O dreimal so gut. Waschen Sie jeweils einmal mit 1 mL 70 % igem Ethanol (EtOH) gut.
  6. Um Chitosan Film sterilisieren, fügen Sie 1 mL 70 % EtOH in jedem gut und inkubieren Sie über Nacht in Laminar-Flow Kabinett. Aspirieren Sie verbleibende EtOH aus jedem Brunnen am folgenden Tag. Waschen Sie jeweils mit 1 mL sterile PBS dreimal gut. Sterilisieren Sie Chitosan-Film mit UV-Licht unter Laminar-Flow Kabinett über Nacht ohne Deckel.
  7. Form-Sphäroide der UCM-MSCs Samen erweitert passagiert Zellen in jedem Bohrloch bei 5.000 Zellen/cm2und 5 % CO2 bei 90 % Luftfeuchtigkeit und 37,0 ° c inkubieren
    Hinweis: Zellen können unter Hypoxie oder Normoxiezustand, je nach Interesse der Ermittler inkubiert werden.

3. Ausdruck der Oberflächenmarker über Durchflusszytometrie analysiert

  1. Vorbereitung einer einzelnen Zelle Suspension
    1. Standard-Platte
      1. Entfernen Sie Medium aus jedem Brunnen zu und waschen Sie zweimal mit Raumtemperatur PBS.
      2. Lösen Sie Zellen mit 500 µL einer Zelle Dissoziation Reagenz in jede Vertiefung eine 12-Well-Platte für 5 – 10 min bei Raumtemperatur.
      3. Nach der Inkubation 1 ml Puffer (PBS mit 0,5 % BSA) Färbung in jede Vertiefung und Mischen von pipettieren, um Zellen zu lösen.
      4. Übertragen Sie Zellsuspension in 15 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 150 X g für 5 min.
    2. Chitosan-Platte
      1. Sammeln Sie alle Sphäroide durch Absaugnadeln Medium mit einer Pipette mit 1.000 µL Spitze. Gesammelten Übertragungsmedium in ein 15 mL konische Röhrchen. Nach dem Medium sammeln, gut durch Hinzufügen von 1 mL PBS waschen und gewaschenen PBS in den gleichen 15 mL konische Rohr übertragen.
      2. Sphäroide bei 150 X g für 5 min Zentrifugieren und überstand zu entfernen.
      3. Fügen Sie 500 µL der Zelle Dissoziation Reagenz (z.B. Accutase) und 5 – 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Mischen von Pipettieren mit einer 1 mL-Spitze bis Sphäroide distanzieren und sind nicht mehr sichtbar.
      4. Fügen Sie 1 mL der Färbung Puffer in die einzelnen Zellsuspension und Zentrifuge bei 150 X g für 5 min.
  2. Waschen der Zellen
    1. Entfernen Sie den Überstand aus dem konischen Rohr zu und wieder auszusetzen Sie, die Zellen in 3 mL kaltem Puffer Färbung. Halten Sie Zellen auf dem Eis im gesamten Experiment von diesem Schritt.
    2. Zentrifugieren Sie bei 300 X g für 5 min (waschen).
    3. Zweimal waschen.
  3. Färbung von Zellen
    1. 300 X g für 5 min Zentrifugieren und überstand zu entfernen.
    2. Zählen Sie entwicklungsfähigen Zellen mit einem Trypan blau und Hemocytometer. Wieder auszusetzen, 1 x 106 Zellen in 50 µL blocking-Puffer (PBS mit 10 % Pferd Serum) und inkubieren Sie für 30 min auf Eis.
    3. Fügen Sie 10 µL Fluorescein erfolgt (FITC) konjugierten Antikörpern (CD44, CD90, CD105, CD34, großen Histocompatibility complex (MHC)-Klasse II oder Isotype Kontrolle für jeden Antikörper) und 40 µL Puffer Färbung, dann brüten Sie lichtgeschützt für 1 h auf dem Eis.
    4. 3 mL kaltem Puffer Färbung hinzufügen und mischen, Zentrifugieren bei 300 X g für 5 min und aspirieren überstand (waschen).
    5. Wiederholen Sie zweimal waschen.
    6. Wieder aussetzen der Zelle Pellet in 0,5 mL Puffer Färbung
    7. Fügen Sie 5 µL 7-AAD (Lebensfähigkeit Farbstoff) und inkubieren Sie für 30 min auf Eis
    8. Analysieren Sie gebeizt Zellproben von Durchflusszytometer. Verunreinigungen durch ihre kleinere SSC und FSC ausschließen, und entwicklungsfähigen Zellen mit niedriger Aufnahme von 7-AAD identifizieren. Plot-FL1- und FL2 auf die y und X-Achse bzw.. Verwenden Sie Isotype-Steuerelement, um ein Tor über die Diagonale Linie zu erstellen. Messen Sie den Anteil der positiv gefärbten Zellen im Bereich. Zählen Sie mindestens 20.000 Veranstaltungen/Probe (ergänzende Abbildung1).
    9. Messen Sie den Anteil der Zellen befleckt mit Antikörpern von Anspritzung lebensfähige Zellen und Auto-Fluoreszenz zu und subtrahieren Sie Anteil an Zellen befleckt mit Isotype Kontrolle.

(4) bilaterale Patellasehne defekt-Modell bei der Ratte

  1. Wählen Sie Sprague-Dawley Ratten (Erwachsene männlich, 4 – 5 Monate alt, Körpergewicht 350-375 g). Beachten Sie die relativ umfangreich die Ratten für dieses Modell verwendet.
  2. Zu betäuben Sie und wenden Sie Kunstauge Schmiermittel die Ratte mit 8 % Sevofluran in 2 L/min 100 % Sauerstoff über Maske, bis zum Verschwinden der Pinch-Zehe Reflex in der Induktion Kammer geliefert.
  3. Eine intramuskuläre Injektion von Meloxicam (1 mg/kg) als präemptive Analgesie zu verwalten.
  4. Legen Sie die Ratte zwischen zwei 0,5 L Wasserflaschen mit warmem Wasser gefüllt und mit einem Tuch, Körpertemperatur und Position beizubehalten und gleichzeitig die Prävention von Hautverletzungen. Kleben Sie jede Extremität an den Tisch. Um das Risiko von Unterkühlung, Abdeckung des Körpers mit Luftpolsterfolie (Abbildung 1).
  5. Anästhesie mit kontinuierlichen Strom von 5 % Sevofluran im 1 L-100 %-Sauerstoff-Gemisch über Bugnase mit dem Tier auf dorsal liegen auf dem Wasser Heizkissen zu erhalten.
  6. Befestigen Sie die chirurgische Sites nicht zur Vermeidung von Hauttrauma. Stattdessen tragen Sie Haar Entferner Creme über beide Kniegelenke. Verwenden Sie eine Zunge Depressor, um die Creme und die Haare zu entfernen.
  7. Scheuern Sie der Operationsstelle mit Chlorhexidin Digluconate Peeling, und spülen Sie mit 70 % Ethanol 3 Mal.
  8. Die Haut mit einer sterilen #15 Skalpellklinge proximal nach distal Richtung, auf den Craniomedial Aspekt der das Kniegelenk einzuschneiden. Starten des Schnittes ca. 1 cm proximal auf das Niveau der Patella, und ca. 5 mm distal der tibiale Tuberkel zu verlängern.
  9. Die Haut um die Patellasehne verfügbar zu machen, indem er befreit die zugrunde liegende Unterhaut mit einem #15 Skalpellklinge zu reflektieren.
  10. Mit der Skalpellklinge #15, Verbrauchsteuern Sie mittleren Drittel der einzelnen Patellarsehne (1 mm) vom distalen Aspekt der Patella, Tibia Tuber.
    1. Richten Sie 0,99 mm Durchmesser Kirschner Draht gegen die Sehne als Vorlage, um die Größe des Defektes in jede Extremität (Abbildung 2) zu standardisieren.
    2. Stellen Sie 2 volle dicke Einschnitte auf jeder Seite der Kirschner-Draht mit einem #15 Skalpellklinge zu isolieren, den zentralen Teil der Sehne (Abbildung 3). Resezieren Sie Mittelteil proximal und distal mit feinen Iris-Schere (Abbildung 4).
    3. Vor dem Schließen der Faszie der Knie, legen Sie das Gerinnsel (gemischte Zellsuspension und AKP-Staaten) für die entsprechende Behandlungsgruppen wie in 5.5 beschrieben. Schließen Sie die Faszie mit einem Kreuzband Muster und Haut mit einem intradermale Muster mit 5: 0 Polyglactin 910 Nähte (Abbildung 5).
  11. Wiederholen Sie den Vorgang auf der kontralateralen ersticken.
    Hinweis: Ein Mangel ist eine Behandlung (Stammzellen konditioniert auf Chitosan oder kultiviert auf standard Platten) nach dem Zufallsprinzip zugewiesen. Der kontralaterale defekt bleibt leer, als interne Kontrolle dienen.
  12. Nach der Operation, Verwalten von Enrofloxacin 4 Tabletten (2 mg/Tablette, oral, einmal täglich) und eine Tablette mit Meloxicam (2 mg/Tablette, oral, einmal täglich) für 7 Tage. Diese Dosen waren von einem Labor Tier Tierarzt empfohlen und in das IACUC-Protokoll.

5. Lieferung von MSCs innerhalb der Patellasehne defekt

  1. Betäuben Sie eine gesunde Ratte die Patellasehne defekt-Kreation mit 8 % Sevofluran in 2 L/min 100 % Sauerstoff über Maske, bis zum Verschwinden der Pinch-Zehe Reflex in der Induktion Kammer geliefert nicht benutzt wird.
  2. Sammeln Sie 5 mL Blut durch Herzpunktion von narkotisierten Sprague-Dawley Ratten (Erwachsene männlich, 4 – 5 Monate alt, Körpergewicht 350-375 g), in einer 5 mL Spritze mit einer 20 G-Nadel mit 1 mL Säure-Citrat-Dextrose (5:1 V/V).
  3. Einzuschläfern Sie die Ratte nach Herzpunktion und Blutentnahme, durch Intracardial Injektion von Pentobarbital (100 mg/kg), während in der gleichen Narkose.
  4. Zentrifugieren Sie die Probe bei 350 X g für 15 min bei Raumtemperatur. Übertragen Sie überstand und speichern Sie Aliquote (120 µL) bei-20 ° C bis zu seiner Verwendung zu.
  5. Unmittelbar vor der in Vivo Implantation tauen die oben genannten aliquoten und mischen 20 µL mit 0,5 x 106 MSCs (von 1,9 oder 3.1.2.1) losgelöst von Standardplatten mit Trypsin/EDTA oder sammeln von Chitosan Platten durch Spülen (mit PBS/Medium).
  6. Die restlichen 100 µL der aufgetauten Plasma in einem Brunnen der 96-Well-Platte zur Aktivierung des Plasmas und induzieren die Bildung eines Gerinnsels 6 µL 10 % Calciumchlorid (CaCl2) hinzufügen (konditionierte Plasma aktiviert: ACP).
  7. Zellsuspension (20 µL) mischen und AKP-Staaten (100 µL) bilden ein Blutgerinnsel (Abbildung 6). Legen Sie das Gerinnsel innerhalb der Patellasehne Defekt vor dem Schließen der Faszie des die Knie erstellt (siehe Schritt 4.10.3).

6. funktionelle Ergebnis

  1. Überwachen Sie Ratten zweimal täglich auf Anzeichen von Schmerzen, basierend auf die Ratte Grimasse Skala (RGS)37,38 und Schwellung über die Implantation Websites.
    Hinweis: Ein scoring-System (0 – 6) wurde entwickelt, um ambulante Funktion basierend auf 3 Aktivitäten, einschließlich zeitlich Hind Gliedmaßen stehend mit Vorderbeine unterstützt (0-3) auszuwerten, zeitlich ohne fremde Hilfe Hind Gliedmaßen stehen (0: 2) und die Fähigkeit, ein 17 cm Kunststoffkäfig Wand (0 – 1) (Klettern ( Tabelle 1).
  2. Bewerten Sie Ratten für die beiden hinteren Extremität stehenden Aktivitäten, morgens und abends jeden Zeitpunkt um einen Durchschnittswert zu berechnen.
  3. Bewerten Sie Ratten für die Fähigkeit, erfolgreich eine 17 cm Kunststoffkäfig Wand mit beide Hinterbeine erreichen die Spitze klettern.

7. gross aussehen und Histopathologie der Patellasehne

  1. Einschläfern Ratten 7 Tage (auszuwertende Entzündung) oder 28 Tage (um die Heilung des Gewebes zu bewerten) Nachbehandlung durch Intracardial Injektion von Pentobarbital (100 mg/kg) unter Narkose mit 8 % Sevofluran und 2 L 100 % Sauerstoff über Maske geliefert.
  2. Patella-Sehne-Tibia Tuber Einheiten mit Skalpell und Schere nach Sterbehilfe zu ernten. Weichteile und Bänder um das Knie, mit Ausnahme der Patellasehne zu entfernen.
  3. Prüfen Sie jede Probe für gröbere Erscheinung und Verdickung der Sehne (Abbildung 7).
  4. Richten Sie die Probe indem ein Chirurg der Knoten der 5.0 Polydioxanon auf den proximalen und seitlichen Aspekt der Sehne. Jede Probe in 10 % neutral gepuffertem Formalin-Lösung zu beheben und Querschnitte (5 µm) aus dem mittleren Teil des jede Sehne erhalten.
  5. Färben Sie die Abschnitte mit Hämatoxylin und Eosin und Masson Trichrome Färbung, Anschluss an standard-Protokolle.
  6. Abschnitt, um das Vorhandensein von Hämatom innerhalb der Defekt sowie krankhafte Veränderungen wie Entzündungen zu untersuchen.
  7. Bewerten Sie die histologischen Partitur der Abschnitte mit der zuvor veröffentlichten scoring-System, basierend auf Kollagen Grade, Grad der Angiogenese und Knorpel Bildung (Tabelle 2)39.

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Ergebnisse

In der aktuellen Studie werden Ergebnisse präsentiert, da ± SD (Standardabweichung) bedeuten. Zellen wurden isoliert von der Nabelschnur 6 Stuten und Prozentsatz der isolierten Zelllinien mit dem Ausdruck jeder Zelle Oberfläche Marker unter Standard- oder Chitosan Klimaanlage verglichen mit Friedman-Test als eine nicht-parametrische Varianzanalyse mit wiederholt Maßnahmen. Für die Sehne defekt Modellerstellung 8 Ratten dienten für 7 Tage nach der Operation Bewertung und 12 Ratten wurden f...

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Diskussion

Equine Zellen wurden für dieses Projekt ausgewählt, weil wir wollen schließlich Kandidat Ansätze bei der Verwaltung der natürlichen Sehnenpathologien bei Pferden zu testen. In der Tat sind Sehnenverletzungen bei Pferden wegen der biologischen Ähnlichkeit zwischen dem equine oberflächlichen Beugesehne und Achillessehne Menschen41ansprechend als natürlichen Vorbildern der Sehnenerkrankung im Menschen. Die Zelle Oberflächenmarker CD44, CD90, CD105, CD34 und MHC-II wurden für die Immunphänotypisierung...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt, offen zu legen.

Danksagungen

Die Autoren möchten Dr. Su, PhD, für ihre statistische Analyse der Daten zu bestätigen. Die Autoren danken auch Dr. McClure, DVM, PhD DACLAM, für ihre Beratung auf die Anästhesie und Schmerz-Management-Protokolle in der Studie verwendet. Dieses Projekt wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Western University of Health Sciences Amt des Vizepräsidenten für Forschung (12678v) und USDA Abschnitt 1433 Mittel (2090).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
PBS 10xHycloneSH30258.01Verbrauchsmaterial
Kollagenase Typ IAWorthingtonLS004197Verbrauchsmaterial
DMEM Hyklon mit niedrigem GlukosegehaltSH30021. FSVerbrauchsmaterial
Fötales RinderserumHyklonSH30910.03Verbrauchsmaterial
Penicillin/Streptomycin 100xHyklonSV30010Verbrauchsmaterial
Trypsin 0,25%HyklonSH30042.01Verbrauchsmaterial
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104Verbrauchsmaterial
TrypanblauHyklonSV30084.01Verbrauchsmaterial
DimethylsulfoxidSigmaD2650Verbrauchsmaterial
ChitosanSigmaC3646Verbrauchsmaterial
NatriumhydroxidSigmaS8045Verbrauchsmaterial
Rinderserum Albumin HycloneSH30574.01Verbrauchsmaterial
Polystyrolrohr mit rundem BodenCorning149591AVerbrauchsmaterial
Maus Anti-Pferd CD44 (FITC)AbD serotecMCA1082FVerbrauchsmaus
Anti-Ratte CD90 (FITC)AbD serotecMCA47FTVerbrauchsmaus
Anti-Pferd MHC-II (FITC)AbD serotecMCA1085FVerbrauchsmaus
IgG1 (FITC) - Isotyp KontrolleAbD serotecMCA928FVerbrauchsmaus
monoklonal [SN6] bis CD105 (FITC)abcamab11415Verbrauchsmaus
IgG1 (FITC) - Isotypsteuerungabcamab91356Verbrauchsmaus
anti-human CD34 (FITC)BDBDB560942Verbrauchsmaus
IdG1 kappa (FITC)BDBDB555748Verbrauchsmaterial
7-AADBDBDB559925Verbrauchsmaterial
BD Accuri C6 DurchflusszytometerBDAusrüstung
Vacutainer 5 mLMed Vet InternationalRED5.0Verbrauchsmaterial
Säure-Citrat-DextroseSigmaC3821Verbrauchsmaterial
CalciumchloridSigmaC5670Verbrauchsmaterial
SevofluranJD Medical60307-320-25Verbrauchsmaterial
RattenCharles RiverStammcode: 400Versuchstier
Chirurgisches Set für RattenHarvard Gerät728942Ausrüstung
Chirurgische Klinge #15MEDLINEMDS15115Verbrauchsmaterial
Ratte MD's Baytril (2 mg/Tablette),
Rimadyl (2 mg/Tablette)		Bio ServF06801Verbrauchsmaterial
Polyglactin 910, 5-0EthiconJ436GVerbrauchsmaterial
Eosin Alchol ShandonThermo wissenschaftliches6766007Verbrauchsmaterial
Harris HämatoxylinThermo wissenschaftliches143907Verbrauchsmaterial

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