Methodenartikel

DNA-Magnetpartikel verbindlich Analyse durch dynamische und elektrophoretische Lichtstreuung

DOI:

10.3791/56815

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9. November 2017

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1Department of Chemistry and Biochemistry, Mendel University in Brno, 2Central European Institute of Technology, Brno University of Technology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt die Synthese von magnetischen Partikeln und Bewertung ihrer DNA-bindende Eigenschaften über dynamische und elektrophoretische Lichtstreuung. Diese Methode konzentriert sich auf die Überwachung von Änderungen der Partikelgröße, ihre Polydispersität und Zeta-Potential der Partikeloberfläche die spielen wichtige Rolle bei der Bindung von Materialien wie DNA.

Zusammenfassung

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Isolierung der DNA mit Hilfe magnetischer Partikel ist ein Feld von hoher Bedeutung in der Biotechnologie und Molekularbiologie. Dieses Protokoll beschreibt die Auswertung der DNA-Magnetteilchen über dynamische Lichtstreuung (DLS) und elektrophoretische Lichtstreuung (ELS) verbindlich. Analyse von DLS liefert wertvolle Informationen über die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Partikel wie Partikelgröße, Polydispersität und Zetapotenzial. Letzterer beschreibt die Oberflächenladung des Teilchens die Hauptrolle in elektrostatische Bindung von Materialien wie DNA spielt. Eine vergleichende Analyse nutzt hier drei chemische Modifikationen von Nanopartikeln und Mikropartikel und ihre Auswirkungen auf die DNA-Bindung und Elution. Chemische Veränderungen durch verzweigte Polyethylenimine, Tetraethylblei Orthosilicate und (3-Aminopropyl) Triethoxysilane untersucht werden. Da DNA eine negative Ladung aufweist, ist zu erwarten, dass Zeta-Potential der Partikeloberfläche bei der Bindung von DNA sinkt. Bildung von Clustern sollte auch Auswirkungen auf die Partikelgröße. Um die Effizienz dieser Partikel isoliert und Elution der DNA zu untersuchen, werden die Partikel mit DNA in niedrigen pH-Wert (~ 6), hohe Ionenstärke und Dehydrierung Umwelt gemischt. Partikel werden auf Magneten gewaschen und dann ist die DNA von Tris-HCl-Puffer eluiert (pH = 8). DNA-Kopienzahl ist anhand quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) geschätzt. Zeta-Potential, Partikelgröße, Polydispersität und quantitative PCR-Daten werden ausgewertet und verglichen. DLS ist eine aufschlussreiche und die Unterstützung der Analysemethode, die eine neue Perspektive auf den Prozess der Überprüfung der Partikel für die DNA-Isolierung hinzufügt.

Einleitung

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DNA-Isolierung ist einer der wichtigsten Schritte in der molekularen Biologie. Die Entwicklung von Nukleinsäure-Extraktionsmethoden hat großen Einfluss auf den aufstrebenden Bereichen Genomik, Metagenomik, Epigenetik und Transkriptom. Es gibt eine Vielzahl von biotechnologischen Anwendungen für die DNA-Isolierung einschließlich medizinische (forensische/Diagnose-Tools und prognostische Biomarker) und Umweltanwendungen (metagenomische Biodiversität, Erreger Prävalenz und Überwachung). Steigende Nachfrage, zu reinigen und DNA zu isolieren, aus verschiedenen Materialien und in unterschiedlichen Maßstäben wie Blut, Urin, Boden, Holz und andere Arten von Proben stattgefunden hat. 1 , 2 , 3 , 4

Und Mikro-Nanopartikel eignen sich für DNA-Isolierung aufgrund ihrer großen Oberfläche und vor allem, wenn sie durch ein Magnetfeld immobilisiert werden können. Physikalisch-chemischen Eigenschaften der Partikel, z. B. Größe oder Ladung, können großen Einfluss auf ihre Fähigkeit, Ziel Biomoleküle zu binden. 5 zur weiteren Verbesserung Bindung von Biomolekülen und Partikel zu stabilisieren, können verschiedene chemische Modifikationen (Oberflächenbeschichtung) genutzt werden. Viele verschiedenen Strategien für die Bindung sind nach kovalente und nicht-kovalente Wechselwirkungen klassifiziert. 6 die Größe der Partikel wirkt sich direkt auf ihre Magnetisierung Eigenschaften, während Partikelzusammensetzung zugeschnitten werden kann, durch Einbau von Metall, Legierung oder andere Materialien, die Dichte, Porosität und Oberfläche beeinflussen können. 7 gibt es keine zuverlässige Möglichkeit, Oberflächenladung kleiner Teilchen zu messen. Stattdessen kann elektrische Potential an das Verrutschen Flugzeug (einiger Entfernung von Nanopartikel-Oberfläche) gemessen werden. 8 dieser Wert heißt Zeta potential und es ist ein starkes Werkzeug, die in der Regel für die Bewertung von Nano- und Mikropartikel Stabilität über DLS verwendet wird. 9 da sein Wert hängt nicht nur der pH-Wert und die Ionenstärke der dispersive Umwelt, sondern auch auf die Oberflächenbeschaffenheit der Partikel ist, es kann auch zu beweisen die Änderungen in dieser Oberfläche, verursacht durch die Wechselwirkung zwischen den Partikel und Molekül des Interesses. 10

Auf der anderen Seite vorkommenden DNA-Struktur in trockene Bedingungen (A-DNA Form) Exponate verdichteten Konformationen, die seinen Niederschlag (Aggregation) ermöglichen im Vergleich zu häufig B-DNA-Form. Elektrostatische (Ionische und H-Bindung) sind die wichtigsten Kräfte kontrollieren die Bindung von DNA an anderen Materialien aufgrund ihrer sterisch zugänglich Phosphat und Stickstoff Basen (besonders Guanin). 7 , 10

In dieser Arbeit werden drei repräsentative chemische Modifikationen von magnetischen Nanopartikeln und Mikropartikel analysiert (Abbildung 1A). Die Methode der Synthese und chemische Modifikation von Nanopartikeln und Mikropartikel werden beschrieben. Eine verbindliche Lösung, dieses Abkommen zu theoretischen Grundlagen der DNA Niederschlag (pH-Wert, Ionenstärke und Dehydrierung), wird verwendet, um DNA-Bindung und Elution zu bewerten. Quantitative PCR wird verwendet, um die Effizienz der Elution der DNA aus dem repräsentativen Nanopartikel und Mikropartikel (Abbildung 1 b) bewerten. Partikelgröße, Polydispersität Index und Zetapotenzial sind wichtige Parameter, die verwendet werden, um die physikalisch-chemischen Veränderungen zu visualisieren, die auf der Partikeloberfläche (Abbildung 1) auftreten. Es ist wichtig zu betonen, auf die chemische Charakterisierung der Magnetpartikel Oberfläche. Während dieser Schritt würde den Rahmen dieses Protokolls war, können mehrere moderne Techniken angewendet werden, um die Effizienz der chemischen Veränderungen zu untersuchen. 11 , 12 , 13 , 14 Fourier Transform Infrarotspektroskopie (FTIR) lässt sich das Infrarotspektrum der Partikeloberfläche zu bewerten und vergleichen Sie es mit dem Spektrum der freien chemische Modifikatoren. Röntgen-Photoelektronen-Spektroskopie (XPS) ist eine weitere Technik, die verwendet werden kann, um die elementare Zusammensetzung der Materialoberfläche zu identifizieren. Anderen elektrochemischen, mikroskopische und spektroskopischen Methoden können verwendet werden, die Aufschluss über die Qualität der Partikelsynthese. Diese Arbeit zeigt eine neue Perspektive für die Analyse von DNA-magnetische Partikel Interaktionen über DLS.

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Protokoll

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1. magnetische Nanopartikel-Synthese

    1. fügen Sie 20 Mmol FeCl 3 Synthese von magnetischen Nanopartikeln mit Citrat (MNPs) stabilisiert ∙ 6 H 2 O (5,406 g) und 10 Mmol FeCl 2 ∙ 4 H 2 O-(1,988 g) in 20 mL sauerstoffarmes doppelt destilliertes Wasser (Ddd). Rühren, die Lösung kräftig im Becherglas unter N 2 Atmosphäre mit einem mechanischen Rührwerk bis eine transparente Lösung erzielt wird.
    2. Unter schnelle mechanische Rühren hinzufügen 150 mL 1 M NH 4 OH, Tropfen für Tropfen mit Tropftrichter (nehmen Sie 1 h oder je nach Bedarf). Übertragen Sie die Lösung in ein Gefäß abschraubbar, nachdem alle NH 4 OH hinzugefügt wird. Schrauben Sie die Schiff und Wärme-Lösung bei 75 ° C für 30 min.
      Achtung: NH 4 OH ist so ätzend und gefährlich für die Umwelt eingestuft.
      Hinweis: Bereiten Sie NH 4 OH-Lösung aus hochwertigem 28 % NH 4 OH im Wasser mit sauerstoffarmes Wasser.
    3. Erfassen den schwarzen Niederschlag mit Magnet und waschen es mit 100 mL Wasser Ddd. Wiederholen Sie 3 Mal. Hinzugeben Sie 50 mL 0,5 M Tri-Natrium-Citrat-Dihydrat ausgefällt. Schrauben Sie das Schiff.
      Hinweis: Verwenden Sie sauerstoffarmes Lösung von Tri-Natrium-Citrat-Dihydrat.
    4. Neu zerstreuen den Niederschlag über Beschallung (35 kHz, Amplitude von 100 %) und Hitze Schiff bei 80 ° C für 1 h
      Hinweis: Ein Sonikator ausreichend Strom wird benötigt.
    5. Die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Niederschlag mit einem Magneten zu sammeln und überstand zu entfernen. Neu zerstreuen schwarzen Schlamm in 50 mL Ddd Wasser mit Sonikator (35 kHz, Amplitude von 100 %).
    6. Aliquote (~ 25 mL) in 50 mL Zentrifuge Röhren übertragen und 20 mL Aceton. Bei 2400 X g für 10 min Zentrifugieren und Überstände entfernen.
    7. Neu zerstreuen Niederschlag und Dialyse Lösung gegen Wasser mit niedrigem Molekulargewicht Cut-off Dialyse Gerät (500-1.000 Da) der angemessene Lautstärke für 24 h
      Hinweis: Bereiten Sie das Dialyse-Gerät laut Hersteller ' s Anforderungen.
  2. Synthese von magnetischen Nanopartikeln modifiziert mit verzweigten Polyethylenimine (MNPs_PEI)
    1. fügen Sie 2 mL der erhaltenen MNPs Lösung (~0.1 g/mL) in ein Becherglas. 38 mL Ddd Wasser hinzugeben und beschallen (35 kHz, Amplitude von 100 %) die Aussetzung (10 min).
    2. Unter schnelle mechanische Rühren hinzufügen 10 mL 10 % verzweigte Polyethylenimine (durchschnittlich 25 kDa). Rühren Sie die Lösung für nachfolgende 3 h
    3. Sammeln Niederschlag mit Magneten und überstand zu entfernen. Niederschlag in 20 mL Ddd Wasser neu zu verteilen. 5 Mal wiederholen dann beschallen die endgültige Aufhebung (35 kHz, Amplitude von 100 %).
  3. Synthese von magnetischen Nanopartikeln Partikeln modifiziert mit Kieselsäure (MNPs_TEOS)
    1. fügen Sie 10 mL der erhaltenen MNPs Lösung (~0.1 g/mL) in ein Becherglas. 60 mL Wasser und 130 mL Ethanol zugeben. Lösung zu beschallen und 6 mL 28 % NH 4 OH.
    2. Unter schnelle mechanische Rühren hinzufügen 1 mL Tetraethylblei Orthosilicate. Rühren Sie die Lösung für nachfolgende 12 h.
    3. Schwarze Niederschlag mit Magneten zu sammeln und waschen Sie es mit 50 mL Ethanol (3 Mal) und 50 mL Wasser (3 Mal). Neu zerstreuen Partikel in 10 mL Ddd Wasser und beschallen die Aussetzung (35 kHz, Amplitude von 100 %).
  4. Synthese von magnetischen Nanopartikeln modifiziert mit Aminogruppen (MNPs_APTES)
    1. fügen Sie 5 mL der erhaltenen MNPs_TEOS Lösung (~0.1 g/mL) in ein Becherglas. 45 mL Wasser und 50 mL Ethanol zugeben. Beschallen Lösung (35 kHz, Amplitude von 100 %).
    2. Unter schnelle mechanische Rühren hinzufügen 0,5 mL (3-Aminopropyl) Triethoxysilane. Rühren Sie die Lösung für nachfolgende 3 h
    3. Schwarze Niederschlag mit Magneten zu sammeln und waschen Sie es mit 50 mL Ethanol (3 Mal) und 50 mL Wasser (3 Mal). Neu verteilen Partikel in Ddd 5 mL Wasser und beschallen die Aussetzung (35 kHz, Amplitude von 100 %).

2. Magnetischer Mikropartikel Synthese

    1. fügen Sie 25 mL 2 M KNO 3, 12,5 mL 1 m KOH und 205,875 mL Ddd Wasser in ein Gefäß abschraubbar Synthese von magnetischen Mikropartikeln mit Citrat (MMPs) stabilisiert. 6,675 mL 1 M FeSO 4 während magnetische rühren hinzugeben. Sofort Überweisung Schiff in einen vorgeheizten Wasserbad (90 ° C) für 2 h
      Hinweis: Bereiten Sie KNO 3 und KOH-Lösungen in Ddd Wasser.
    2. Die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Sammeln Sie schwarze Niederschlag mit Magnet und waschen es mit 50 mL Wasser Ddd (5 Mal). Hinzugeben Sie 50 mL 0,5 M Tri-Natrium-Citrat-Dihydrat ausgefällt. Schrauben Sie das Schiff.
    3. Redisperse den Niederschlag über Beschallung (35 kHz, Amplitude von 100 %) und Hitze Schiff bei 80 ° C für 1 h sammeln schwarzen Niederschlag mit Magnet und waschen es mit 50 mL Wasser Ddd (10mal).
    4. Ändern MMPs mit verzweigten Polyethylenimine (MMPs_PEI), Kieselsäure (MMPs_TEOS) und Aminogruppen (MMPs_APTES) ähnlich wie MNPs Protokoll. Siehe Details im Kapitel 2.2, 2.3 und 2.4, bzw. mehr.
  2. Synthese von magnetischen Mikropartikeln modifiziert mit verzweigten Polyethylenimine (MMPs_PEI)
    1. fügen Sie 5 mL der MMPs Lösung (~0.1 g/mL) in ein Becherglas. Geben Sie 38 mL Ddd Wasser hinzu und beschallen Sie die Lösung (35 kHz, Amplitude von 100 %, 10 min). Fügen Sie unter schnelle mechanische Rühren 10 mL 10 % Polyethylenimine (durchschnittlich 25 kDa) verzweigt. Rühren Sie die Lösung für nachfolgende 3 h
    2. Niederschlag mit einem Magneten zu sammeln und überstand zu entfernen. Redisperse Niederschlag in 20 mL doppelt destilliertem Wasser. 5 Mal wiederholen dann beschallen die endgültige Lösung (35 kHz, Amplitude von 100 %).
  3. Synthese von magnetischen Mikropartikeln modifiziert mit Kieselsäure (MMPs_TEOS)
    1. fügen Sie 5 mL der MMPs Lösung (~0.1 g/mL) in ein Becherglas. 60 mL Wasser und 130 mL Ethanol zugeben. Beschallen Aussetzung (35 kHz, Amplitude von 100 %) und 6 mL 28 % NH 4 OH.
    2. Unter schnelle mechanische Rühren hinzufügen 1 mL Tetraethylblei Orthosilicate. Rühren Sie die Lösung für nachfolgende 12 h.
    3. Schwarze Niederschlag mit einem Magneten zu sammeln und waschen Sie es mit 50 mL Ethanol (3 Mal) und 50 mL Wasser (3 Mal). Redisperse Partikel in 5 mL Wasser Ddd und beschallen die Aussetzung (35 kHz, Amplitude von 100 %).
  4. Synthese von magnetischen Mikropartikeln modifiziert mit Aminogruppen (MMPs_APTES)
    1. fügen Sie 3 mL MMPs_TEOS-Lösung (~0.1 g/mL) in ein Becherglas. 45 mL Wasser und 50 mL Ethanol zugeben. Beschallen Sie die Suspension (35 kHz, Amplitude von 100 %).
    2. Unter schnelle mechanische Rühren hinzufügen 0,5 mL (3-Aminopropyl) Triethoxysilane. Rühren Sie die Lösung für nachfolgende 3 h
    3. Schwarze Niederschlag mit Magneten zu sammeln und waschen Sie es mit 50 mL Ethanol (3 Mal) und 50 mL Wasser (3 Mal). Redisperse Partikel in 3 mL Ddd Wasser und beschallen die Aussetzung (35 kHz, Amplitude von 100 %).

3. Magnetische Partikel Größe Analyse mittels DLS

  1. Partikelgröße in Wasser
    1. Verwendung eine DLS-Instrument, das gilt eine hintere Streuwinkel der Detektor (173 °) und ein Strahl Wellenlänge von 633 nm.
      Hinweis: Rücken Streuung DLS ist geeignet für konzentrierte Proben wo Mehrfachstreuung vermieden werden kann. Seite Streuung (Detektor Winkel 90°) und Vorwärtsstreuung (Detektor Winkel 15°) DLS eignen sich für kleinere Partikel und Teilchen, bzw. gemischt.
    2. Vor der Messung im Wasser, beschallen Partikel für 3 min.
      Hinweis: Verwenden Sie verdünnte Lösung der Partikel. Zu diesem Zweck 9,6 µL von Partikeln mit 96 µL Wasser mischen.
    3. Pipette vorsichtig 50 µL der Partikel-Lösung in Polystyrol latex Küvetten und Blasenbildung zu vermeiden.
      Hinweis: Für jede Probe verwenden Einweg-Küvette (siehe Tabelle der Werkstoffe).
    4. Beachten Sie die Klarheit der Küvette und die Richtung des Lichtstrahls. Legen Sie die Zelle in der Probenhalter und schließen die Kammer.
    5. Verwenden Sie die folgenden Parameter für die Messung: Temperatur: 25 ° C; Brechungsindex dispersive Phase (Eisen): 2.344; Brechungsindex dispersive Umgebung (Wasser): 1,333
      Hinweis: Führen Sie die Messung des Brechungsindex mit einem Refraktometer für genauere Ergebnisse, insbesondere bei der Entwicklung von Roman oder hybride Materialien.

4. Vorbereitung von DNA-Lager, magnetische Partikel und Binding Buffer

  1. DNA-Lager
    1. Einsatz 10 mM Tris-HCL-Puffer (pH = 8) zur Verdünnung und Lagerung von DNA. Verwenden Sie eine standard DNA-Probe, die verstärkt werden kann, speziell mit einem direkten PCR-Protokoll im Labor (siehe Abschnitt 5.2 Reaktion Einstellungen und Bedingungen). Um 498 Basenpaare (bp) des Gens Xis von Bakteriophagen λ Kontrolle zu verstärken, verwenden Sie die folgenden Primer. Grundierung zu übermitteln: 5 ' - CCTGCTCTGCCGCTTCACGC - 3Ɔ Reverse Primer: 5 ' - TCCGGATAAAAACGTCGATGACATTTGC - 3 '
    2. reinigen PCR-Produkt mit kommerziellen DNA Reinigung Kit.
      Hinweis: Kommerzielle Kits mit Kieselsäure spaltenbasierten Verfahren ergeben > 100 ng/µL gereinigte DNA.
    3. Maß Konzentration der DNA mit photometrische Methode (Absorption bei 260 nm). Verdünnen den DNA bestand von 10 11 Kopien/µL, wie oben beschrieben, funktionierende Lösungen von 10 10 10 9 10 8 und 10 7 Kopien/µL.
      Hinweis: Die Anzahl der Kopien des PCR-Produktes kann berechnet werden, nach der folgenden Gleichung, vorausgesetzt, mittleres Molekulargewicht ist 650 Da für jede bp:
      DNA-Kopien/µL = (Menge in ng/µL * 6.022x10 23 Kopien/Mol) / (498 bp * 650 g/Mol von bp * 1 x 10 9 ng/g)
  2. Magnetpartikel
    1. Partikel zu sedimentieren ohne Magneten ermöglichen und überstand zu entfernen. Mischen Sie 01:20 V/V-Verhältnis von magnetischen Partikeln mit Ddd Wasser (Partikel: Wasser).
      Hinweis: Volumen-basierten Ansatz wird verwendet, um Mengen von magnetischen Partikeln zu beschreiben, da gleiche Massen von MNPs und MMPs leicht schwer zu vergleichen waren.
  3. Verbindlich Puffer
    1. für die schnelle Zubereitung von 0,75 M Natrium Acetat-HCL-Lösung (pH = 6), mischen Sie 1 mL Natriumacetat 3 M mit 3 mL HCL 1 mM.
      Hinweis: Alle Lösungen, die für die Bindung können gespeichert werden, bei 4 ° C. beachten Sie, dass Niedertemperatur Bindung vor allem bei Ethanol-Lösung erhöht. Sorgfältig zu kontrollieren, die Temperatur der Lösungen für bessere Reproduzierbarkeit und Genauigkeit des Screenings.

5. Effizienz der DNA-Isolierung mittels quantitativer PCR Tests

  1. DNA-Isolierung durch geänderte MMPs oder MNPs
    1. verwenden eine 96-Well-Platte und ein Magnet für 96-Well-Platte für kleinvolumige Experimente angepasst.
    2. Verwenden Sie die folgende verbindliche Lösung Mischung: 8 µL geändert MMPs oder MNPs, 10 µL Natrium Acetat-HCl (0,75 M, pH = 6), 60 µL von 85 % Ethanol, 10 µL DNA (10 10 Kopien Lösung).
    3. Mix nun durch pipettieren und platzieren Sie die Platte auf den Magneten für 3 min. Während die Platte auf den Magneten, die Lösung entfernen und hinzufügen 100 µL von 85 % Ethanol zum Waschen.
    4. Entfernen Ethanol.
      Hinweis: Lassen Sie das Ethanol für einige Sekunden trocknen lassen aber nicht lassen Sie zu, dass die Partikel zu trocknen oder Risse zu zeigen. Wenn die Partikel über trocknen werden sie schwerlich mit Elution Lösung auflösen.
    5. Die Platte aus der Magnet entfernen und Hinzufügen von 40 µL Elution Lösung. Mischen Sie gut durch pipettieren. Die Platte wieder auf den Magneten und sammeln eluierten DNA (~ 37 µL). Laufmittel bei-20 ° C bis zur weiteren Analyse zu speichern.
  2. Quantitative PCR
    1. verwenden die Primer, die verwendet wurden, bestand DNA im Schritt 4.1.1 zu quantifizieren, Kopien des Gens Xis vorbereiten nach dem Protokoll von Haddad Et Al. 10
    2. master-Mix Lösung entsprechend dem Umfang der zu testenden Proben vorbereiten, dann verteilen Sie die Mischung in PCR-Röhrchen oder einen weißen Hintergrund 96-Well-Platte.
    3. Verwenden Sie die folgenden Mengen für ein komplettes Volumen von 20 µL PCR Mischung: 10 µL Polymerase / verschuppen Farbstoff Gemisch (siehe Tabelle der Materialien), 2 µL DNA-Probe, 2 µL forward Primer (10 µM), 2 µL rückwärts-Primer (10 µM)
    4. Richten Sie die Thermocycler nach dem folgenden Programm: 95 ° C für 120 s, 40 Zyklen (95 ° C für 15 s, 64 ° C für 15 s, 68 ° C für 45 s), 68 ° C für 5 min.
    5. Mit Triplicates für Standards und Proben, die Zyklus-Schwelle zu berechnen und konstruieren eine Standardkurve zur Schätzung der Anzahl der Kopien der DNA in jeder Probe abgerufen. Das hier verwendete Gerät führt dies automatisch.
    6. Hier wird die Anzahl der Kopien der DNA für insgesamt Elution Volumen (~ 40 µL) geschätzt. Prozentsatz der DNA abgerufen, die ursprünglichen Betrag hinzugefügt, um verbindliche Lösung (total 10 11 Exemplare) kann darüber hinaus das Intervall von 0 bis 100 variieren.

6. DNA-magnetische Partikel Bindung Analyse mittels DLS

  1. Bindung der DNA
    1. für großvolumige Experimente (in 1,5 mL-Tube), verwenden Sie die folgende verbindliche Lösung Mischung: 96 µL MMPs oder MNPs, 120 µL Natrium Acetat-HCl geändert (0,75 M, pH = 6), 720 µL von 85 % Ethanol, 120 µL DNA (10 10 Kopien Lösung) oder 120 µL Tris-HCL-Puffer (10 mM, pH = 8) für die Steuerung.
  2. Zeta-potential-Analyse
    1. bereiten zwei verbindliche Lösungen, mit DNA und ein weiteres mit Tris-HCL-Puffer für die Kontrolle, wie in Schritt 6.1.1 angewiesen. Zur Vermeidung von Blasenbildung pipette vorsichtig 800 µL der Bindung Mischung in einer Einwegzelle.
      Hinweis: Verwenden Sie Einweg-Küvette zur Messung der Oberfläche das Zetapotenzial (siehe Tabelle der Werkstoffe).
  3. Verwenden Sie die folgenden Parameter für die Messung auf DLS Instrument: Smoluchowski-Modell mit einem F(ka) von 1,5, Temperatur: 25 ° C, Brechungsindex dispersive Phase (Eisen): 2.344, Brechungsindex dispersive Umgebung (Wasser): 1,333.
    Hinweis: Die Rate der DNA-magnetische Partikel Wechselwirkung wirkt sich direkt auf die Messung von Wiederholungen. Eine Einzelmessung durch das Instrument dauert 60-70 s. Hier wurde das Instrument angewiesen, 10 Messungen mit 1 min Verzögerung Abstand nehmen. Der Einfachheit halber werden die Ergebnisse wieder eingeblendet werden = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 und 18 min aus der ersten Lesung.

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Ergebnisse

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Über das Protokoll beschriebenen chemischen Synthese und Modifizierung der Magnetpartikel, wurden sechs magnetische Partikel synthetisiert und analysiert für DNA-Bindung. Eine Zusammenfassung der Analyse ist in Tabelle 1dargestellt. Durch den Vergleich der Partikelgröße im Wasser und in verbindliche Lösung, ist es klar, dass alle Partikel in verbindlichen Lösung durch 2-22 Falten aggregiert. Einige Partikel weiter zu mehr Falten im Beisein von DNA aggregiert; jedoch war d...

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Diskussion

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In diesem Protokoll wurden die theoretischen Grundlagen, die DNA-Bindung an Magnetpartikel über das Zetapotenzial erklären in Frage gestellt. Das Protokoll beschreibt die Synthese und Modifizierung von magnetischen Nanopartikeln und Mikropartikel. Methode für die Erstellung von DNA-Kontrolle und verbindliche Lösung werden ebenfalls beschrieben. Zwei Strategien sind hier für das Screening der DNA-Partikel-Wechselwirkungen gezeigt: quantitative PCR und DLS nähert. DLS bietet drei Indikatoren für die physikalisch-chemischen...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Die finanzielle Unterstützung von tschechischen Wissenschaftsstiftung (GA CR 17-12816S-Projekt) und CEITEC 2020 (LQ1601) ist sehr anerkannt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Eisen(III)-chlorid-HexahydratSigma-Aldrich207926Magnetpulversynthese
Eisen(II)-chlorid-TetrahydratSigma-Aldrich380024Magnetpulversynthese
Eisen(II)-sulfat-HeptahydratSigma-AldrichF8263Magnetpulversynthese
AcetonPenta10060-11000Magnetpulversynthese
NatriumcitratdihydratSigma-AldrichW302600Magnetpulversynthese
TetraethylorthosilikatSigma-Aldrich131903Magnetpartikelsynthese
(3-Aminopropyl)triethoxysilanSigma-Aldrich440140Magnetpulversynthese
Polyethylenimin, verzweigt, durchschnittlich Mw ~25.000Sigma-Aldrich408727Magnetpulversynthese
AmmoniumhydroxidlösungSigma-Aldrich221228-M Synthese von Magnetpartikeln
EthanolPenta71250-11000Magnetpartikelsynthese
KaliumnitratSigma-AldrichP6083Magnetpulversynthese
KaliumhydroxidSigma-Aldrich1.05012Magnetpulversynthese
ow-molekulare Cut-off-Membran (Mw=1 kDa)Spectrum LabsG235063Magnetpulversynthese
Überkopfrührermit Labortechnik GmbHDH. WOS01035Magnetpartikelsynthese
WasserbadMemmert GmbH + Co. KG84198998Magnetpulversynthese
SonicatorBandelin795Magnetpulversynthese
BRAND UV-Küvette microSigma-AldrichBR759200-100EAKüvette für die Größenmessung
BRAND Kappe für UV-Küvette microSigma-AldrichBR759240-100EAKüvettenkappen für die Größenmessung
Gefaltete Kapillar-ZetazelleMalvernDTS1070Küvette zur Messung des Zetapotenzials
Zetasizer Nano ZSMalvernZEN3600Gerät zur Messung von Größe und Zetapotenzial
Infinite 200 PRO
NanoQuant Gerät		Tecan396 227 V1.0, 04-2010Gerät zur Messung der DNA-Konzentration
SYBR Green Quantitative RT-PCR KitSigma-AldrichQR0100PCR Kit
Mastercycler pro S InstrumentEppendorf6325 000.013Thermocycler
MinElute KitQiagen28004DNA-Aufreinigungskit
NatriumacetatSigma-AldrichS7670DNA-Bindung

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Dynamic Light ScatteringZeta Potential AnalysisParticle Size MeasurementPolydispersity IndexDNA Isolation ProtocolMagnetic Particle SeparationQuantitative PCR AnalysisNanoparticle Surface Modification

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