Methodenartikel

Entwicklung eines In-vitro- Assay, hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen Quantitate Zellen (HSPCs) bei der Entwicklung von Zebrafish Embryos

DOI:

10.3791/56836

⸱

30. November 2017

 , 
1Department of Biological Sciences, California State University, Chico

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache Methode um hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen Zellen (HSPCs) im embryonalen Zebrafisch quantitate. HSPCs von dissoziierten Zebrafisch sind in Methylcellulose mit unterstützenden Faktoren, Differenzierung in Reife Blut beschichtet. Dies ermöglicht die Erkennung von Blut Mängel und Drogen-screening um leicht durchgeführt werden.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hämatopoese ist ein wesentlicher zellulärer Prozess in dem hämatopoetische Stammzellen und Vorläuferzellen Zellen (HSPCs) in der Vielzahl der verschiedenen Zell-Linien zu unterscheiden, die Reife Blut umfassen. Isolierung und Identifizierung von dieser HSPCs ist schwierig, weil sie Ex-post-Factodefiniert sind; Sie können nur nach ihrer Differenzierung in bestimmte Zelle Linien definiert werden. In den letzten Jahrzehnten geworden der Zebrabärbling (Danio Rerio) Modellorganismus Hämatopoese zu studieren. Zebrafisch-Embryonen entwickeln ex Uteround von 48 h nach Befruchtung (hpf) haben definitive HSPCs. Assays zur Beurteilung von HSPC Differenzierung generiert und Verbreitung Funktionen wurden entwickelt, unter Verwendung der Transplantation und die anschließende Rekonstitution des blutbildenden Systems neben der Visualisierung von spezialisierten transgener Linien mit der konfokalen Mikroskopie. Allerdings sind diese Tests Kosten unerschwinglich, technisch schwierig und zeitaufwendig für viele Labore. Entwicklung eines in-vitro- Modells HSPCs zu bewerten wäre kostengünstiger, schneller und weniger Schwierigkeiten im Vergleich zu vorher beschriebenen Methoden, so dass Laboratorien zu schnell beurteilen, Mutagenese und Drogen-Bildschirme, die HSPC Biologie betreffen. Dieser neuartige in-vitro- Assay zur HSPCs Bewertung erfolgt durch Beschichtung getrennt ganze Zebrafish Embryos und Hinzufügen von exogenen Faktoren, die nur HSPC Differenzierung und Verbreitung zu fördern. Embryonen sind getrennt in einzelne Zellen und vergoldet mit HSPC-unterstützende Kolonie stimulierende Faktoren, die bewirken, dass sie Kolonie bildende Einheiten (KBE) erzeugen, die aus einer einzigen Stammvater Zelle entstehen. Diese Tests sollen vorsichtigeren Untersuchung der molekularen Wege verantwortlich für HSPC Proliferation, Differenzierung und Verordnung, die Forscher zu verstehen, die Grundlagen der vertebrate Hämatopoese und seine Dysregulation ermöglichen während der Krankheit.

Einleitung

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Hämatopoese ist der Prozess der Herstellung der Vielzahl von Reife Blutzellen notwendig für das Überleben eines Organismus. Es ist eine wichtige Entwicklungsprozess, die die Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) beinhaltet in einer Vielzahl von entwicklungspolitisch eingeschränkt Zelltypen, die Reife Blut enthalten. Diese HSCs müssen selbst erneuern, so dass das System nie erschöpft ist und sie müssen von der frühen embryonalen Entwicklung bis zum Tod bestehen. Bei Wirbeltieren, ständige Differenzierung und Proliferation von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) genügen, um ausreichend die Mehrheit der Blutzellen wieder aufzufüllen, die Post-mitotische sind und jeden Tag recycelt. HSZ generieren Reife Blutzellen durch die erste Differenzierung in Teilmengen eingeschränkt Vorläuferzellen; gemeinsame lymphoide Vorläuferzellen (CLP)1, die schließlich T, B- und NK-Zellen produzieren, und gemeinsame myeloischen Vorläuferzellen (CMPs)2 , die Erythrozyten, Granulozyten, Makrophagen und Megakaryozyten zu generieren. Diese Vorfahren verpflichtet bestimmte Zelle Linien erzeugen und weiter differenzieren in mehr entwicklungsgeschichtlich eingeschränkt Vorläuferzellen wie myeloischen erythroiden Vorläuferzellen (MdEP), die Erythrozyten und Thrombozyten und Granulozyten generieren Makrophagen Stammväter (GVP), die eosinophile, Basophils, neutrophilen Granulozyten und Makrophagen2erzeugen. Identifizieren und isolieren diese Stammväter ermöglicht die Identifikation von wichtigen molekularen Signalwege hämatopoetischen Differenzierung beteiligt und viele hämatopoetische Krankheiten wie Leukämie entstehen, wenn diese Vorläuferzellen nicht richtig zu unterscheiden.

In den letzten Jahrzehnten ist der Zebrafisch (Danio Rerio) Modellsystem wichtige Recherche-Tool für embryonalen und adulten hämatopoetischen Studien geworden. Zebrafisch sind genetische Analyse zugänglicher und die phylogenetisch niedrigsten vertebrate Modell-Arten, die eine ähnliche Gefäßsystem und blutbildenden Systems auf den Menschen haben. Zebrafisch-Embryonen entwickeln ex Utero, und innerhalb von 48 Stunden Post Düngung (hpf) HSPCs3,4,5,6,7,8. Zebrafisch sind auch äußerst fruchtbar, mit Weibchen legen über 100 Eiern in einer einzigen Kupplung, so dass für große Stichproben und experimentelle Replikation. Zebrafisch-Embryonen sind optisch transparent, zulassend mikroskopische Visualisierung des blutbildenden Systems. Mehreren fluoreszierenden transgenen Linien Zebrafisch Kennzeichnung HSCs wie runx1: EGFP Fisch9, cd41: EGFP Fisch10, und Kdrl:mCherry; Cmyb: GFP3 Doppel-positiven Tieren ermöglichen live, in Echtzeit-Visualisierung von HSC Entstehung und Expansion in Vivo3,4,7,8, 9. Der Zebrabärbling schnell Zeit und Entwicklung ex Utero führte zu seiner Verwendung in Mutagenese Studien11,12,13,14,15 und Droge Screening von16,17,18,19,20 für Verbindungen, die therapeutische Versprechung für Erkrankungen des menschlichen Blutes halten. Insgesamt hat Erhaltung des blutbildenden Systems, das Vorhandensein und die einfache Entwicklung von transgenen Linien und schnelle Regenerationszeit der Zebrabärbling ein billig, schnell, flexibel und ideal Modell für hämatopoetische Studien gemacht.

Zahlreiche Methoden der Isolierung und Testen von HSZ wurden in Säugetieren blutbildenden Systeme entwickelt. Ermittler nutzen eine Kombination aus Oberfläche Zellrezeptoren Markus HSCs21,22,23,24, als auch die Fähigkeit der HSCs Efflux Farbstoff25,26zu nutzen. Nachdem diese gekennzeichnet sind, kann Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) ihre räumliche Trennung. Was beweist, dass eine Zelle eine HSC erfordert Bestrahlung ein Wirtstier endogene HSPCs, vermeintliche HSCs Umpflanzen, und beobachten langfristige, Multi-Linie Wiederherstellung aller Blut Zelltypen Reifen zu zerstören. Diese Tests funktionieren gut in Mäusen, da gibt es zahlreiche Zelloberfläche Antikörper gegen hämatopoetischen Zellen und Inzucht Mausstämme, die immun-Abstimmung für die Transplantation erleichtern. Jedoch wurden einige Zebrafisch hämatopoetischen Zelloberfläche Antikörper generierten27, behindern die Identifizierung und Isolierung von HSZ. Die gängigste Methode zum Markieren und Isolieren von Zebrafisch HSCs ist mit transgenen Tieren, wobei ein zellspezifische Promotorsequenz eine fluoreszierende Protein-Expression treibt. Studien haben visualisiert und HSCs in der ventralen Wand der dorsalen Aorta mit Mikroskopie nutzt diese Technik3,4,8,9aufgelistet. Anderen Labors klonaler Stämme von Zebrafisch28,29 generiert haben und im MHC abgestimmt Tiere30erfolgreichen Transplantationen durchgeführt haben. Jedoch diese Techniken sind kostspielig zu vielen Laboratorien sind technisch schwierig und zeitaufwendig sind. Um diese Probleme anzugehen, haben Labors generiert mehrere in-vitro- Tests, um die Präsenz, die Verbreitung Tarife und die Kapazität der Differenzierung der HSPCs31,32,33zu testen, 34,35,36. Diese Tests zeigen, Proliferation und Differenzierung von HSPCs in-vitro-31,32,33,34,35,36, die Rettung von hämatopoetischen Mängel36, und eine effiziente Methode zum entdecken und testen Zytokine33,34,35. Sie wurden auch genutzt, um für HSPC Biologie31,32verantwortlichen Gene zu identifizieren. In dieser Studie nehmen wir diese Tests einen Schritt weiter und erlaubt die Quantifizierung von HSPCs einer sich entwickelnden Zebrafish Embryos. Diese Tests können auch genutzt werden, um die Anzahl der HSPCs im mutierten Tieren quantitate und Tiere mit hämatopoetischen störende Medikamente behandelt. Im Wesentlichen diese Assays sind schnell, vorhanden einige technische Herausforderungen, und kostengünstige Möglichkeiten, um quantitate HSPC zahlen, prüfen ihre Verbreitung und Blöcke in Abgrenzung zu untersuchen.

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Protokoll

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Die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) Beirat an der California State University, Chico, genehmigt alle unten beschriebene Methoden.

1. Bleach 48 hpf Zebrafish Embryos

  1. Mit 15 cm (w) 15 cm (l) x 7 cm (h) Kunststoffbehälter erstellen 3 Waschstationen: 1) mit 1 mL 5 % Bleichmittel in 1000 mL Embryo Medium (E3; siehe Tabelle 1), (2) mit sterilen E3 und (3) mit sterilen E3. Sicherstellen Sie, dass jeder Container 500 mL der Lösung hat um die Embryonen zu versenken.
    Hinweis: Für jede Bedingung getestet, werden mindestens 10 Embryonen erforderlich sein. Dieser Waschvorgang bietet Platz für bis zu 200 Embryonen.
  2. Mit einer Transferpipette Embryonen in ein Teesieb und Tauchen Sie Eiern in Waschstation #1 für 5 min. Teesieb (mit Embryonen in) zu entfernen und legen Sie in Waschstation #2 für 5 min; Wiederholen Sie für Waschstation #3 für die letzten 5 Minuten.
  3. Nach dem letzten Waschen spülen Embryonen aus Teesieb durch eine saubere 10 cm Petrischale Kopf umdrehen und sanft spülen Embryonen Teesieb mit sterilen E3 und eine Transferpipette ausschalten.

2. Dechorionate Embryonen

  1. Entfernen Sie mit einer Transferpipette und entsorgen Sie soviel E3 wie möglich aus der Petrischale und 500 μL Dechorionation Protease (10 mg/mL) in Embryonen. Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. sanft tippen Sie auf der Seite der Petrischale Chorions vollständig zu entfernen.
  2. Zugeben Sie mit einer serologischen Pipette 20 mL sterile E3 Protease verdünnen. Können Sie Embryonen zu begleichen, und entfernen Sie die E3 mit einer Transferpipette. Wiederholen Sie diese Waschschritt 3 Mal, um alle Spuren der Dechorionation Protease entfernen.

(3) Probenvorbereitung Embryo

  1. Mit einer Pipette P1000, legen Sie 10 Embryonen zu einem einzigen sterile 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
  2. E3 mit einer Pipette entfernen und entsorgen.
    Achtung: Pipette mit Sorgfalt wie Embryonen können leicht verschoben und während der folgenden Schritte waschen verworfen.

(4) vorbereiten Dissoziation Embryonen

  1. Proben in Laminar-Flow-Haube und waschen Embryonen durch Zugabe von 1 mL sterile E3. Lassen Sie Embryonen auf Grund des Schlauches zu begleichen und überstand mit einer Pipette P1000 entfernen. Wiederholen Sie für insgesamt 3 Wäschen.
  2. Nach dem letzten Waschen E3 entfernen und entsorgen. Fügen Sie 1 mL 10 mM Dithiothreitol (DTT) in E3, die Schleim-Beschichtung (und Sporen, Hefe oder Bakterien, die in ihm aufgefangen werden können) rund um die embryonale Zebrafisch zu entfernen. Microcentrifuge Schlauch horizontal legen und bei Raumtemperatur in Laminar-Flow-Haube für 25 min inkubieren.

5. Embryo Dissoziation

  1. Waschen Sie Probe mit 1 mL sterile DPBS (mit Ca2 + und Mg2 +) 3 Mal. Nach dem letzten Waschen 500 μL des DPBS (mit Ca2 + und Mg2 +) dazugeben Sie und 5 μL von 5 mg/mL (26 U/mL) Dissoziation Protease.
    Achtung: Dieses Enzym braucht Ca2 + und Mg2 +, also sicherstellen, dass die DPBS diese Ionen enthält.
  2. Proben bei 37 ° C auf eine horizontale Orbitalschüttler mit 180 u/min für 60 min. Ort Proben in der Laminar-Flow-Haube brüten und genannte Embryonen mit einem P1000 bis Proben vollständig dissoziiert sind.
    Achtung: Prüfen Sie Embryonen in regelmäßigen Abständen zu bestimmen, wenn sie getrennt werden. Die Embryo-Lösung sollte eine gewisse Menge des Gewebes vorhanden haben; Es sollte nicht völlig homogen sein. Es ist möglich, zu verdauen, die die HSPCs zerstören werden (siehe ergänzende Abbildung1).

6. Vorbereitung der dissoziierten Embryonen

  1. Pipette 10 dissoziiert Embryonen auf dem oberen Reservoir von 5 mL Polystyrol runden Unterrohr mit einem 35 μm Zelle Sieb Cap.
  2. Mit einer Pipette gefiltert spülen die Petri-Röhre mit sterilen PBS (mit Ca2 + weder Mg2 +) und Transferlösung 5 mL Polystyrol Rohr mit Zellen aus Schritt 6.1. Wiederholen Sie bis 4 mL der Flüssigkeit in der 5 mL Polystyrol Tube vorhanden ist.
    Hinweis: PBS, DPBS oder andere isotonischen gepufferten Lösungen können in diesem Stadium verwendet werden, solange sie nicht, Ca2 + oder Mg2 enthalten +
  3. Zentrifugieren Sie Rohre bei 4 ° C und 300 X g für 5 min um die homogenisierte Zellprobe pellet. Entfernen Sie mit einer Pipette und entsorgen Sie überstand aus dem Rundboden Röhrchen. Achten Sie darauf, um die Zellen, die oelletiert an der Unterseite des Rohres nicht zu stören. Die Zellen in 100 μl PBS aufzuwirbeln.

7. Vorbereitung der Methylcellulose

  1. 1 x komplette Methylcellulose (Tabelle 1) Stammlösung zu generieren und sterile Rundboden 14 mL Röhrchen mit 3 mL Spritzen und Nadeln, 16 G 2,5 mL hinzufügen. Verwenden Sie eine Röhre für jede Bedingung getestet.
  2. Fügen Sie Zytokine, kleine Moleküle oder andere Agenten für jede Probe untersucht werden.
    1. Myeloische Differenzierung fügen Sie 1 % Carp Serum und 0,3 mg/mL rekombinanter Zebrafisch Granulozyten Kolonie stimulierende Faktor (Gcsf)34 , Methylcellulose Medium hinzu. Siehe Svoboda Et al. 37 für vollständige Beschreibung wie man Karpfen Serum und rekombinanten Zytokine zu generieren.
    2. Fügen Sie 1 % Carp Serum und 0,1 mg/mL rekombinanter Zebrafisch Erythropoetin (Epo)38 erythroiden Differenzierung hinzu Methylcellulose Medium.
    3. Um multilineage Vorfahren zu untersuchen, fügen Sie EPA und Gcsf hinzu.
      Achtung: Zytokine und Zusatzstoffe sollten nicht mehr als 10 % des Gesamtvolumens, total, denn das Medium nicht zäh genug, einzelne Kolonien zu erkennen.

8. Ergänzung der dissoziierten Embryonen zu Methylcellulose

  1. Fügen Sie mithilfe einer Pipette 100 μL der dissoziierten 10 Embryonen auf die Oberfläche des vorbereiteten Methylcellulose mit rekombinanten Zytokine und Karpfen Serum. Kappe Deckel und Wirbel sanft zur Probe vollständig zu homogenisieren. Jedes Rohr sollte nun die dissoziierte Gewebe 10 Embryonen enthalten.
  2. Verwendung von 3 mL Spritzen und 16 G Nadeln, aliquoten 1 mL der Probe in 2 separaten 35 mm Petrischalen. Stellen Sie sicher, dass die Probe in der Petrischale vollständig dispergiert ist. Wiederholen Sie für jede Probe.
  3. Methylcellulose entgegenbringen Sie 35 mm Petrischalen mit Zellen in einem 15 cm Petrischale. Jedes Gericht 15 cm Hinzufügen einer 35 mm-Petri-Platte mit 5 mL sterilem Wasser befeuchten die Proben. 7-10 Tage bei 32 ° C und 5 % CO2 inkubieren.

9. die Visualisierung von HSPC-abgeleitete Koloniebildenden Einheiten (KBE)

  1. Legen Sie nach 7 Tagen Inkubation, Proben auf einem inversen Mikroskop bei 40-100 X für Visualisierung und Enumeration. An dieser Stelle können einzelnen Kolonien isoliert mit einer Pipette und Färbung und/oder gen-Analyse unterzogen werden.

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Ergebnisse

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HSPC Zahlen im embryonalen Zebrafisch zu bewerten, wurden 48 hpf Embryonen verdaut, in Methylcellulose mit exogenen hämatopoetischen unterstützend Wachstumsfaktoren überzogen und für 7 Tage (Abb. 1A) inkubiert. Nach 7 Tagen waren Kolonie bildende Einheiten (KBE) aufgezählten (Abbildung 1B) und Image (Abbildung 1C). Durch die Steuerung der verschieden...

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Diskussion

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Der Zebrafisch-Modell-System ist eine effiziente, effektive und kostengünstige Modell für das Studium primitiv und definitive vertebrate Hämatopoese geworden. Generation von Assays, die sind schnell, preiswert, und einigen technische Schwierigkeiten kann zum Testen kleiner Moleküle, mutierte Embryonen zu analysieren und molekulare Signalwege wichtig für HSPC Biologie Aufklärung genutzt werden. In-vitro- Beschichtung der HSPCs von Erwachsenen Zebrafisch ist eine wirksame Methode, Mutagenese, Zytokine und hämatopo...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Wurde gefördert durch die National Institutes of Health (NIH: K01-DK087814-01A1, D.L.S.), der California State University Program für Bildung und Forschung in der Biotechnologie (CSUPERB: molekulare Kontrolle der Vertebrate hämatopoetischen Nische, D.L.S.) und vom Büro Graduate Studies in California State University Chico (zu A.C.B.).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 % Rinderserumalbumin in den MDM-Stammzelltechnologien von Iscove 9300
DPBS (10x) mit Calcium2+ und Magnesium2+Life Technologies14080-055
HyClone PBS (1x)GE Healthcare Life Sciencessh30256.01
  DMEM 500 mLCorning CellGrow10-017-CV
  Ham's F12 500 mLCorning CellGrow10-080-CV
FBS 500 mLGemini Bio-Products100-108
HEPES 100 mL (1 M)Gibco life technologies15-630-080
Penicillin/Streptomycin (5000 U/mL
und 5000 mg/ml) mit L-Glutamin (200 mM)		Corning Mediatech30-009-CI
Gentamycinsulfat 10 mL (50 mg/ml)Corning Mediatech30-005-CR
1,5 mL MCF-RöhrchenFisherBrand05-408-129
3 mL 23gx1 Injektionsnadel mit Luer-LockBD Safety Glide305905
5 mL Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit ZellsiebkappeCorning Falcon352235
Methocel MCSigma-Aldrich64630
14 mL Polystyrol-RundbodenröhrchenCorning Falcon352057
10 mm Polystyrol easygrip PetrischaleCorning Falcon351008
Librease TMRoche Sigma-Aldrich5401119001Dissoziationsprotease
PronaseRoche Sigma-Aldrich11459643001Dechorionationsprotease
15 cm PetrischaleCorning Falcon351058
ABZebrafish International Resource Center (ZIRC)ZL1verwendeter Zebrafischstamm
Dithiolthreitol (DTT)Sigma-Aldrich646563

Referenzen

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