Methodenartikel

Geführte Protokoll für fäkale mikrobielle Charakterisierung von 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung

DOI:

10.3791/56845

⸱

19. März 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Sheba Medical Center, 2Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC, 3Ariel University, 4Cincinnati Children's Hospital Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Manuskript beschreibt ein detaillierte standardisierte Protokoll von Hochdurchsatz-16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung. Das Protokoll stellt eine integrierte, uniformierte Machbare und preiswerte Protokoll Kotprobe Sammlung durch Datenanalysen ab. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse einer großen Anzahl von Proben mit strengen Standards und mehrere Steuerelemente.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der menschliche Darm Microbiome spielt eine zentrale Rolle beim Schutz der Zellen vor Verletzungen, bei der Verarbeitung von Energie und Nährstoffen und bei der Förderung der Immunität. Abweichungen von was als eine gesunde Mikrobiota Komposition (Dysbiose gilt) können lebenswichtige Funktionen führt zu pathologischen Bedingungen beeinträchtigen. Bisherigen und laufenden Forschung Bemühungen haben auf die Charakterisierung der Zusammenhänge zwischen mikrobiellen Zusammensetzung und menschliche Gesundheit und Krankheit.

Fortschritte in der Sequenzierung von Hochdurchsatz-Technologien ermöglichen Charakterisierung der mikrobiellen Zusammensetzung Darm. Diese Methoden umfassen 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung und Schrotflinte Sequenzierung. 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung wird verwendet, um taxonomische Zusammensetzung Profil während Schrotflinte Sequenzierung zusätzliche Informationen über Gene Vorhersagen und funktionellen Annotation bietet. In einer gezielte Sequenzierung Methode der 16 s rRNA Gens Variable Region von Vorteil ist die wesentlich geringeren Kosten im Vergleich zu Schrotflinte Sequenzierung. Sequenzunterschiede in der 16 s rRNA-Gen dienen als mikrobieller Fingerabdruck zur Identifikation und Quantifizierung von verschiedenen Taxa innerhalb einer einzelnen Probe.

Große internationale Anstrengungen haben Standards für die 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung eingetragen. Mehrere Studien berichten jedoch eine Sourceschaltung der Variation von Batch-Effekt verursacht. Zur Minimierung dieser Effekt, uniformierten Protokolle für die Probenentnahme, müssen Verarbeitung und Sequenzierung umgesetzt werden. Dieses Protokoll schlägt die Integration von allgemein verwendeten Protokolle ab Kotprobe Sammlung auf Datenanalysen. Dieses Protokoll beinhaltet einen stützenfreie, direkt-PCR Ansatz, der gleichzeitige Handling und DNA-Extraktion einer großen Zahl von Stuhlproben, zusammen mit PCR Verstärkung der V4 Region ermöglicht. Darüber hinaus wird das Protokoll beschreibt die Analyse Pipeline und liefert ein Skript mit der neuesten Version des QIIME (QIIME-2-Version 2017.7.0 und DADA2). Dieses schrittweise Protokoll zielt darauf ab, die Interessenten bei der Einleitung der Verwendungdes der 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung in einer robusten, reproduktive, einfach zu bedienen, detaillierte Weise zu führen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konzentrierte Anstrengungen wurden unternommen, Microbiome Vielfalt und Fülle, als ein weiterer Aspekt für den Fang von Unterschiede und Ähnlichkeiten zwischen den Individuen in gesunden und pathologischen Bedingungen besser zu verstehen. Alter2,3, Geographie4, Lebensstil5,6, und Krankheit5 zeigten sich die Zusammensetzung der Darm Microbiome zugeordnet werden, aber viele Bedingungen und Populationen wurden noch nicht vollständig gekennzeichnet. Vor kurzem wurde berichtet, dass das Mikrobiom für therapeutische Anwendungen7,8,9geändert werden kann. Daher ist zusätzliche Einblicke in die Beziehung zwischen verschiedenen physiologischen Bedingungen und der mikrobiellen Zusammensetzung der erste Schritt zur Optimierung der potenzielle zukünftige Änderungen.

Die traditionelle mikrobielle Kultur-Methoden sind durch niedrige Erträge10,11begrenzt und sind konzipiert als einen binären Zustand, wo ein Bakterium ist entweder, im Darm zu präsentieren, oder nicht. Hochdurchsatz-DNA-basierte Sequenzierung hat mikrobielle Ökologie, ermöglichen die Erfassung aller Mitglieder der mikrobiellen Gemeinschaft revolutioniert. Länge und Qualität bleiben erhebliche Hindernisse für genaue Taxonomie Zuordnung12lesen Sequenz jedoch. Darüber hinaus können Batch-Effekte, Hochdurchsatz-basierte Experimente leiden an denen Messungen von nicht-biologischen oder nichtwissenschaftlichen Variablen13betroffen sind. In den letzten Jahren haben mehrere Programme eingerichtet, um der menschlichen Mikrobiom, einschließlich der amerikanischen Darm-Projekt, die Vereinigten Staaten (US) Human Microbiome Project und das Vereinigte Königreich (UK) MetaHIT Projekt zu studieren. Diese Initiativen haben Unmengen an Daten generiert, die nicht aufgrund mangelnder Konsistenz in ihren Ansätzen leicht vergleichbar sind. Eine Vielzahl von internationalen Projekten wie International Human Microbiome Consortium, das Projekt International Human Microbiome Standards und der National Institute of Standards and Technology (NIST) versucht, einige dieser Probleme14-Adresse , und entwickelt Standards für Microbiome Messungen, die das Erreichen der reproduktiven Ergebnisse ermöglichen sollte. Hier beschriebene ist ein integriertes Protokoll mehrere allgemein verwendeten Methoden15,16 für die 16 s rRNA Hochdurchsatz-Sequenzierung (16 s-Seq) ab Kotprobe Sammlung durch Datenanalysen. Das Protokoll beschreibt einen stützenfreien PCR-Ansatz, ursprünglich für direkte Extraktion von pflanzlichen DNA16, ermöglichen das gleichzeitige Handling einer großen Zahl von fäkalen Proben in relativ kurzer Zeit mit hoher Qualität verstärkt DNA für eine gezielte Sequenzierung der mikrobiellen Variable V4 Region auf einer gemeinsamen Plattform der Sequenzierung. Dieses Protokoll soll Wissenschaftler, die Verwendung der 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung gewissermaßen robuste, reproduktive, einfach zu bedienen, ausführliche Einleitung mit wichtigen Kontrollen führen. Eine geführte und detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokoll kann Batch-Effekt minimieren und so wird mehr vergleichbare Ergebnisse der Sequenzierung zwischen Labors zulassen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ethische, Genehmigung für die Studie wurde von der lokalen Forschungsethikkommission Sheba gewährt und alle Methoden wurden gemäß den einschlägigen Richtlinien und Verordnungen durchgeführt. Das Protokoll erhalten eine Zustimmung des Patienten-Ausnahme von der lokalen ethischen Review Board, seit der Fäkalien, die verwendet wurden wurden bereits vorgelegt der Mikrobiologie-Kern im Rahmen des klinischen Aufarbeitung und ohne erkennbare Patienteninformationen als Alter, Geschlecht und mikrobielle Ergebnisse. Geschrieben, wurde die Einwilligung von gesunden Probanden und der Institutional Review Board bewilligt. Einige dieser Proben wurden bereits in einer vorherigen Analyse1aufgenommen.

1. Probe Handhabung

  1. Sammeln eine ca. 5 mm2 Abstrich (etwa die Größe von einem Radiergummi) aus einer frischen Kotprobe mit einem sterilen Tupfer in einem Test tube (siehe Tabelle der Materialien). Speichern Sie alle Tupfer mit Stuhlproben bei-80 ° C innerhalb von 24 h. Die fäkale Tupfer können es bleiben, bis die Weiterverarbeitung.

(2) DNA-Extraktion

  1. Die Extraktion und Verdünnung Lösungen bei Raumtemperatur auftauen (siehe Tabelle der Materialien).
  2. Übertragung der fäkale Tupfer in eine leere 2 mL Sammlung Rohr (siehe Tabelle der Materialien). Passen Sie die Tupfer Stick Größe durch Schneiden sie mit einer sauberen Schere Rohr Verschluss mit minimalen Cross-Kontamination zu ermöglichen. Jede Sammlung-Röhrchen mit der fäkalen Tupfer und Vortex mischen fügen Sie 250 μL der Extraktionslösung hinzu.
  3. Die Proben für 10 min in ein kochendes Wasserbad erwärmen (95-100° C). Jede Probe und Vortex mischen fügen Sie 250 μL der Verdünnung der Lösung hinzu.
  4. Lagern Sie die 2 mL Röhrchen mit der extrahierten DNA und den Tupfer bei 4 ° c

(3) PCR und Bibliothek-Vorbereitung

Arbeiten Sie für Schritt 3.1 und 3.2 in einer PCR-Workstation, die sauber, bietet Vorlage und Amplifikate Umgebung.

  1. Beschriften Sie die Primer (Tabelle 1) entsprechend ihren Barcode. Verdünnen Sie jede Grundierung in doppelt destilliertem Wasser (DDW) zu einer 50 μM Konzentration und speichern bei-20 ° C.
  2. Verwenden Sie eine 96-Well-Platte für PCR-Reaktionen. Jede Platte kann 32 verschiedene Proben enthalten, die von 32 verschiedenen Index Primer versehen sind. Tauen Sie der forward Primer und die 32 reverse Primer bei Raumtemperatur auf und verdünnen sie bis 5 μM.
  3. 100 Reaktionen (Endvolumen in jede Vertiefung werden 20 µl) bereiten Sie PCR Reaktionsmischungen durch das Mischen von 100 μL von 5 μM Forward Primer, 1 mL 2 X PCR Master Mix und 400 μl DDW vor. Legen Sie 15 μl dieser PCR Mischung in jede Vertiefung (insgesamt 96 Wells). 3 verschiedene Brunnen (32 verschiedene Grundierungen in Triplicates bietet insgesamt 96 Wells) fügen Sie 1 μL jeder 5 μM Reverse indizierten Grundierung hinzu.
  4. In einem Pre-PCR eigene Zone, was bedeutet einen sauberen Werkbank, die Vorlage und Amplifikate frei, ist hinzufügen 4 μL jeder extrahierten DNA-Probe Reaktionsgemischen (jede extrahierte DNA-Probe ist in dreifacher Ausfertigung verstärkt — 32 Proben pro 96-Well-Platte).
  5. Führen PCR mit den folgenden Einstellungen: erste Denaturierung von 94 ° C für 3 min; gefolgt von 35 Zyklen der Denaturierung bei 94 ° C für 1 min, bei 55 ° C für 1 min und Erweiterung bei 72 ° C für 1 min Glühen; und eine letzte Verlängerung bei 72 ° C für 10 Minuten.
  6. Kombinieren Sie auf einer anderen Bank, die als ein Post-PCR-eigene Zone definiert wird jeweils dreifacher PCR-Reaktion in einem Einzelband-Rohr (60 μl pro Probe).
  7. Zur Beurteilung der Qualität der PCR Amplifikate laufen Sie 4 μL jeder kombiniert PCR-Reaktion auf eine Interkalation Bromid-gefärbten 1 % Agarose-Gel. Unter UV-Wellenlänge von 260 nm, die positive Amplifikate erscheint in einem erwarteten Bandgröße von 375-425 bp. Nur diese Amplifikate werden in den nachfolgenden Schritten berücksichtigt.
    Hinweis: Jede Probe wird in dreifacher Ausfertigung, Bedeutung verstärkt, dass jede Probe in 3 verschiedenen PCR-Reaktionen verstärkt wird. Nicht skalieren.

(4) Bibliothek Quantifizierung und Reinigung

  1. Um einen Pool äquimolaren Konzentration aller PCR Proben zu erhalten, zu quantifizieren jedes Amplifikate durch eine doppelte stranded DNA (DsDNA quantifizieren Reagenz) fluoreszierendes Nukleinsäure Fleck (siehe Tabelle der Materialien), geeignet für die gleichzeitige Quantifizierung eines großen Höhe der Proben.
    Hinweis: Da der Größenbereich der Amplifikate zweideutig ist, dient die tatsächliche Höhe in Nanogramm eine äquimolaren Konzentration zu laden.
  2. Kombinieren Sie 500 ng jeder Probe in ein einziges, sterilen Röhrchen. Vortex mischen.
  3. Führen Sie 200 μL der gepoolten Bibliothek auf einer Interkalation Bromid-gefärbten 1 % Agarosegel. Extrahieren Sie die 375-425-bp-Bands aus dem Gel mit einem Gel Extraction Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien) und die gepoolte Bibliothek in 80 μl DDW eluieren.
    Hinweis: Die gepoolte Bibliothek Größe ausgewählt, um unspezifische Amplifikationsprodukte vom Host DNA reduzieren sollte.
  4. Messen Sie die endgültige Bibliothek Konzentration mit Hilfe eines hochsensiblen DsDNA Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers zu erkennen (siehe Tabelle der Materialien). Messen Sie die genaue Bibliotheksgröße mit einem hochsensiblen Trennung und Analyse-Kit für DNA-Bibliotheken nach den Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien).

(5) Sequenzierung

  1. Verdünnen die gepoolte Bibliothek bis 19:00 mit Zusatz von 20 % Steuerelementbibliothek (siehe Tabelle der Materialien), nach der Sequenzierung Maschine Protokoll.
  2. Für die Sequenzierung lesen Verwendung kundenspezifisch angefertigt, Grundierungen, die komplementär zu den V4 Verstärkung Zündkapseln sind (siehe Tabelle 1).
  3. Verwendung einer dritten benutzerdefinierten gestaltete Sequenzierung Grundierung, die den Barcode in einer zusätzlichen liest (siehe Tabelle 1) und erzeugt gepaart Ende liest 175 Basen Länge in jeder Richtung, entsprechend den Vorgaben des Herstellers.
  4. Laufen Sie die Sequenzierung Maschine und erhalten Sie FASTQ Dateien nach Protokoll des Herstellers.

6. Datenverarbeitung

  1. Zusammen nähen Sie und verarbeiten Sie die überlappenden gepaart-End FASTQ Dateien in einer Daten-Kuration-Pipeline in QIIME 2 Version 2017.7.017umgesetzt. Demultiplex liest nach Probe bestimmten Barcodes.
  2. Verwenden Sie DADA218 für Qualitätskontrolle und Sequenz-Variante (SVs)-Erkennung. Kürzen Sie liest am 13 Basen aus dem 3'-Ende und 15 Stützpunkte von 5'-Ende, verwerfen liest mit mehr als 2 erwartete Fehler. Erkennen und Entfernen der Chimären verwenden die Konsensmethode — Chimären sind in Proben einzeln erkannt und Sequenzen gefunden Chimären in Sekundenbruchteilen genügend Proben werden entfernt.
  3. SVs taxonomische Klassifikation mit eine Naive Bayes ausgestattet-Sichter durchführen, ausgebildet am August 2013 99 % Identität Greengenes Datenbank-6, für 175 lange Lese- und der vorwärts/rückwärts-Primer eingestellt.
  4. Verdünnen Sie alle Proben zu Tiefe von 2.146 Sequenzen.
  5. Nutzen Sie ungewichteten UniFrac für Messung der β-Vielfalt (zwischen Probe Vielfalt19,20) auf die verdünnten Proben, um eine Probe-Größe-Effekt zu vermeiden.
  6. Verwenden Sie die daraus resultierenden Distanzmatrix um eine Analyse der wichtigsten Koordinaten (HKoA) durchzuführen.
    Hinweis: Die Datenverarbeitung Skript und Mapping-Dateien dienen als ergänzendes Material (ergänzende Material 1 und 2).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine schematische Darstellung des Protokolls ist in Abbildung 1dargestellt.

Wir haben prospektiv Stuhlproben von hospitalisierten Patienten mit vermuteten infektiösen Durchfall gesammelt. Diese Proben wurden klinische Mikrobiologielabor am Sheba Medical Center zwischen Februar und Mai 2015 vorgelegt wie zuvor beschrieben1war. Stuhlproben wurden herkömmliche mikrobiologische K...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

16 s rRNA-Amplifikate und Metagenomik Shotgun Sequencing haben Popularität in klinischer Mikrobiologie Anwendungen21,22,23gewonnen. Diese Techniken sind vorteilhaft in ihre erhöhte Fähigkeit, kultivierbare und nicht-kultivierbare Taxa, die Bereitstellung von Daten über die relative Häufigkeit der pathogenen Inokulum und ihre Fähigkeit, genauer gesagt eine infektiöse Biofilm zu identifizieren zu erfassen Fingerabdruck-24. Die Fortschritte a...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde zum Teil unterstützt von Programms-CORE (Zuschüsse Nr. 41/11), Israel Science Foundation (Grant Nr. 908/15), und die europäischen Morbus Crohn und Colitis Organisation (ECCO).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
PrimerIntegrated DNA Technologies (IDT)
ExtraktionslösungSigma-AldrichE7526
VerdünnungslösungSigma-AldrichD5688
Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR KitKAPABIOSYSTEMSKK2601PCR Master Mix
Quant-iT PicoGreen dsDNA ReagenzienkitInvitrogenP7589dsDNA Quantifizierung des Reagenzes
MinElute Gel ExtraktionskitQiagen28606
AgaroseAmresco0710-250G
Reinstwasser Dnase- und RNASE-freiBiological Industries01-866-1A
Qubit dsDNA HS Assay KitMolekulare SondenQ32854dsDNA-Detektionskit
Hohe Empfindlichkeit D1000Agilent TechnologiesScreen Tape 5067-5582Trennung und Analyse
Screen Tape AssayAgilentTechnologies Reagenzien 5067-5583für DNA-Bibliotheken
PhiX Control v3Illumina15017666Kontrollbibliothek
MiSeq Reagent Kit v2 (500 Zyklen)IlluminaMS-102-2003
EthidiumbromidAmrescoE406-10mL-TAM
2 mL Kollektion RöhrchenSARSTEDT72.695.400Safe Seal Sammelröhrchen
Kunststoff-Stabtupfer im PP-ReagenzglasSTERILER INNENRAUM23117
NameUnternehmen<>KatalognummerKommentare
>Ausrüstung
PCR-MaschineApplied Biosystems2720 Thermocycler
SequenziermaschineIlluminaMiseq
PCR-WorkstationBiosanUV-Reiniger
Schere
VortexerScientific IndustriesVortex-Genie 2

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Braun, T., et al. Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis. Scientific Reports. 7, 1088(2017).
  2. De Filippo, C., et al. Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 14691-14696 (2010).
  3. Yatsunenko, T., et al. Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature. 486, 222-227 (2012).
  4. Rodriguez, J. M., et al. The composition of the gut microbiota throughout life, with an emphasis on early life. Microbial Ecology in Health and Disease. 26, 26050(2015).
  5. Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
  6. McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6, 610-618 (2012).
  7. Bakken, J. S., et al. Treating Clostridium difficile infection with fecal microbiota transplantation. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9, 1044-1049 (2011).
  8. Khoruts, A., Dicksved, J., Jansson, J. K., Sadowsky, M. J. Changes in the composition of the human fecal microbiome after bacteriotherapy for recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea. Journal of Clinical Gastroenterology. 44, 354-360 (2010).
  9. Nood, E. V., et al. Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile. The New England Journal of Medicine. 368, 407-415 (2013).
  10. Koplan, J. P., Benfari Ferraro, M. J., Fineberg, H. V., Rosenberg, M. L. Value of stool cultures. The Lancet. 316, 413-416 (1980).
  11. Platts-Mills, J. A., Liu, J., Houpt, E. R. New concepts in diagnostics for infectious diarrhea. Mucosal Immunology. 6, 876-885 (2013).
  12. Bokulich, N. A., et al. Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing. Nature Methods. 10, 57-59 (2013).
  13. Leek, J. T., et al. Tackling the widespread and critical impact of batch effects in high-throughput data. Nature Reviews Genetics. 11, (2010).
  14. Dubilier, N., McFall-Ngai, M., Zhao, L. Create a global microbiome effort. Nature. 526, 631-634 (2015).
  15. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. PNAS. 108, 4516-4522 (2011).
  16. Flores, G. E., Henley, J. B., Fierer, N. A direct PCR approach to accelerate analyses of human-associated microbial communities. PloS One. 7, (2012).
  17. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
  18. Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13, 581-583 (2016).
  19. Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 71, 8228-8235 (2005).
  20. Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison. The ISME Journal. 5, 169-172 (2011).
  21. Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PloS One. 10, e0117617(2015).
  22. Hiergeist, A., Gläsner, J., Reischl, U., Gessner, A. Analyses of intestinal microbiota: culture versus sequencing. ILAR Journal. 56, 228-240 (2015).
  23. Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13, 601-612 (2012).
  24. Salipante, S. J., et al. Rapid 16S rRNA next-generation sequencing of polymicrobial clinical samples for diagnosis of complex bacterial infections. PloS One. 8, e65226(2013).
  25. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME Journal. 6, 1621-1624 (2012).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

16S rRNA Amplikon SequenzierungStuhlgrobenentnahmeDNA ExtraktionPCR AmplifikationV4 RegionQIIME 2DADA2Library Pr parationGelelektrophoreseHauptkoordinatenanalyse

Verwandte Artikel