Eine In Vivo murinen Ischiasnerv Modell Perineural Invasion

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine in Vivo Mausmodell Perineural Invasion durch Einspritzen von Phänomen pankreatischen Krebszellen in den Ischiasnerv. Das Modell ermöglicht eine Quantifizierung des Ausmaßes der Nerv Invasion und Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen der Perineural Invasion unterstützt.

Zusammenfassung

Krebszellen dringen in Nerven durch einen Prozess bezeichnet Perineural Invasion (PNI), in denen Krebs Zellen vermehren sich und Wandern in den Nerv Mikroumgebung. Diese Art der Invasion wird durch eine Vielzahl von Krebsarten ausgestellt und findet sich sehr häufig bei Bauchspeicheldrüsenkrebs. Die mikroskopische Größe der Nervenfasern innerhalb Maus Bauchspeicheldrüse macht das Studium der PNI in Orthotopic murinen Modellen schwierig. Hier beschreiben wir eine heterotopisch in Vivo Modell des PNI, wo wir den murinen Ischiasnerv Phänomen Pankreatischer Krebs-Zell-Linie Panc02-H7 zuzuführen. In diesem Modell sind Ischias Nerven narkotisierten Mäuse ausgesetzt und mit Krebszellen injiziert. Die Krebszellen dringen in den Nerven nach proximal in Richtung Rückenmark ab dem Zeitpunkt der Injektion. Drangen Ischias Nerven sind dann extrahiert und verarbeitet mit OCT für gefrorenes schneiden. H & E und Immunfluoreszenz-Färbung dieser Abschnitte erlauben Quantifizierung von sowohl der Grad der Invasion und Änderungen im Protein-Expression. Dieses Modell kann auf eine Vielzahl von Studien auf seine Vielseitigkeit PNI angewendet werden. Mit Hilfe von Mäusen mit unterschiedlichen genetischen Veränderungen und/oder verschiedene Arten von Krebszellen ermöglicht die Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen der PNI und verschiedenen Krebsarten. Darüber hinaus können die Auswirkungen von Therapeutika auf Nerv Invasion durch Behandlung mit diesen Mäusen untersucht werden.

Einleitung

Nerven bilden einen bestimmten Tumor Mikroumgebung, die Krebs Wachstum und Migration^1,2,3stimuliert. Perineural Invasion (PNI) ist der Prozess, durch welche, den Krebs Zellen in und um die Nerven dringen. Es kann als eine individuelle Route von Metastasen da Krebs Invasion von den Stätten der Ursprung entlang Nerven erstreckt. PNI findet sich bei verschiedenen Krebsarten, einschließlich Bauchspeicheldrüse, Prostata, Kopf & Hals, Speicheldrüsen, Hals-, und Kolorektale Karzinome mit einer Inzidenz von 22 % bis 100 %^1,2. PNI ist mit Schmerzen verbunden und korreliert mit schlechter Prognose und schlechter Überleben Rate^1,2.

Entwicklung von Modellen der Perineural Invasion ist unerlässlich, die zellulären und molekularen Mechanismen dieses Prozesses aufzuklären und Kandidat Therapeutika PNI verringern zu testen. In-vitro- Methoden des Studierens Wechselwirkungen zwischen Krebserkrankungen und Nerven gehören Kokulturen von Krebszellen mit Nerv Explantaten⁴, Dorsal Root Ganglien^5,6,7, oder bestimmte Zellen vom Nerv Zellen Mikroumgebung wie Schwann⁷. In Vivo Ansätze jedoch mehr physiologisch relevant sind, umfassen die Verwendung von Krebs Mausmodelle, in denen Krebs induzierte oder transplantiert wurde, und haben den Vorteil der Rechnungslegung für die gesamte Nerv Mikroumgebung. Im orthotopen Modelle von Pankreas oder Prostata Krebs, PNI wurde gemeldeten^8,9,10 und die Inzidenz von PNI kann aufgezeichnet werden, aber wegen der geringen Größe der Nerven in diese Organe, ist es schwer zu sehen den gesamten Nerv und damit das Ausmaß der PNI zu quantifizieren. Die, die wir hier beschreiben ist ein in Vivo Modell des PNI in welcher Krebs Zellen in den Ischiasnerv von Mäusen durch einen einfachen chirurgischen Eingriff¹¹injiziert werden. Die heterotopisch Transplantation dringt innerhalb der Nerv in Richtung Rückenmark. Die Länge der Nerv Invasion von der Website der Injektion des Rückenmarks kann gemessen werden, sowie die Lautstärke des Krebses in den Nerv. Wichtig ist, kann die angegriffene Nerven auch für eine Vielzahl von Tests einschließlich mikroskopische und Molekulare Analysen gesammelt werden. Eine Vielzahl von Krebszellen kann getestet werden, und die Host-Mäuse, die genetisch modifiziert oder mit bestimmten Substanzen behandelt wurden sowie verwendet werden. Dieser leistungsstarke Assay ermöglicht die Krebszellen und der Host Mikroumgebung für die Untersuchung der Mechanismen der PNI geändert werden.

Protokoll

Alle Verfahren mit tierischen Probanden stimmten die institutionellen Animal Care und Use Committee am Memorial Sloan Kettering Cancer Center.

1. Vorbereitung der Krebszellen

1. Ernte Sub konfluierende Panc02 H7 Zellen mit 0,25 % Trypsin für 5 min bei 37 ° C. Sammeln Sie die Zellen in einem Zentrifugenröhrchen 15 mL.
   Hinweis: Die Zellen wachsen in T-225 Kolben, enthält etwa 12 x 10⁶ Zellen pro Flasche bei 80 % Konfluenz und 4 mL Trypsin / Kolben verwendet wird.
2. Zentrifugieren Sie die Zellen an x 900 g bei 4° C für 5 min. Waschen der Zellen durch die Zelle resuspending pellet in 1 mL PBS (durch pipettieren zweimal rauf und runter) und übertragen die Aussetzung zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch auf Eis.
3. Zentrifugieren Sie die Zellen wieder auf x 900 g bei 4° C für 5 min und verwerfen Sie den überstand, ohne zu stören das Pellet. Bewahren Sie die gebeizte Zellen auf Eis bis Injektion.

2. Vorbereitung der Mäuse und Chirurgie

Hinweis: 8 Wochen alten, männlichen und weiblichen C57BL/6J Mäuse werden in dieser Studie verwendet. Die Chirurgie-Bedingungen gelten die IACUC Regeln unserer Institution. Die Instrumente sterilisiert, chirurgische Arbeitsfläche desinfiziert, das Tier wird desinfiziert und der Chirurg trägt sterile Handschuhe.

1. Am Tag vor der Operation die Maus mit 2 % Isofluran zu betäuben und dann das Fell über die Länge des Oberschenkelknochens an der dorsalen Seite mit einer dünnen Rasierklinge oder einem chemischen Haar Entfernung Agent entfernen.
2. Am Tag der Operation die Mäuse, die mit 2 % Isofluorane in eine Induktion-Kammer zu betäuben. Die Anesthetization von Zehen Prise Ansporn und ein Mangel an Antwort zu bestätigen.
3. Tragen Sie Tierarzt Salbe auf Augen, Trockenheit in Narkose zu verhindern.
4. Legen Sie die narkotisierten Maus auf die ventrale Seite und sichern Sie sanft jede Extremität mit hypoallergenen Klebestreifen erstelle ich milde Spannung in der Extremität injiziert werden. Anästhesie ist gepflegt mit Isofluran über eine Präzision Vaporizer und bugnase geliefert.
5. Reinigen Sie die Injektionsstelle mit Betadine, dann wieder mit 70 % Alkohol. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch zweimal. Stellen Sie sicher, dass keine losen Haare auf das OP-Feld bleibt.
6. Machen Sie einen 1 cm Schnitt mit einer kleinen Schere ca. 2 mm unterhalb und parallel in den Oberschenkelknochen. Zurückziehen der Haut mit einer Pinzette seitlich um die Muskeln unter aussetzen.
7. Der Ischiasnerv verläuft tief in die Muskeln Gluteus Maximus und Bizeps Femoris. Diese beiden Muskeln entlang einer faszialen Ebene mit einer kleinen Schere zu trennen und den Ischiasnerv unter aussetzen. Kostenlos den Nerv von den umliegenden Muskeln mit stumpfe Dissektion.
8. Ziehen Sie 3 μL von Krebszellen (ca. 50.000 Zellen) aus das Pellet in eine 10 μl Spritze.
   Hinweis: Alternativ zeichnen Sie 3 μl PBS als ein Steuerelement.
9. Legen Sie eine kleine Metallspatel unter den Nerv zum Zeitpunkt der Injektion für die Unterstützung. Stechen Sie unter Visualisierung mit einem sezierenden Mikroskop die Nadel in den Nerv gegen Metallfuß, halten Sie die Nadel als parallel zu den Nerv wie möglich beim einsetzen. Achten Sie darauf, dass Sie nicht durch die Hintertür des Nervs zu durchbohren. Minimieren Sie die Handhabung des Nervs im Laufe dieses Prozesses so weit wie möglich.
10. Langsam injizieren in den Nerv über 5 s. Eine Formation von einer Glühbirne im Bereich Injektion zeigt eine gute Injektion. Dann lassen Sie die Nadel für 3 s vor dem Entfernen der Nadelöhrs sanft. Halten die Nadel im Ort für 3 s minimiert Rückfluss der Zellen aus den Nerv.
    Hinweis: Injektion kann in Richtung der distalen Nerven oder das Rückenmark durchgeführt werden. Es ist wichtig, innerhalb einer Reihe von Experimenten konsistent bleiben. Wenn die Zellen außerhalb verschütten, sollte das Tier nicht in der Analyse des Experiments enthalten. Mit Erfahrung sind diese Ereignisse sehr selten.
11. Den Nerv in seine ursprüngliche Position zurück. Decken Sie den Nerv mit den darüber liegenden Muskeln. Behandeln Sie die Mäuse mit dem richtigen Analgesie zu, und schließen Sie dann die Haut mit 5: 0-Nylon-Fäden.
12. Platzieren Sie den Mauszeiger in einem sauberen Käfig für die Beobachtung während der Wiederherstellung, allein, bis es vollständig aus der Narkose erwacht.
    Hinweis: Es dauert 5-15 min für das Tier zu vollständigem Bewusstsein wieder zu erlangen. Das Tier ist nicht unbeaufsichtigt gelassen, bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat. Das Tier wird nicht an die Gesellschaft anderer Tiere bis vollständig erholt zurückgegeben. Danach bewerten Sie Erholung mindestens einmal alle 24 h für 72 h.

3. n. ischiadicus Extraktion

1. Am OP Tag #7 einschläfern Sie die Mäuse mit CO₂. Platzieren Sie den Mauszeiger auf der Bauchseite und stabilisieren Sie die distalen Extremitäten mit Hilfe der Pins.
2. Entfernen Sie die Haut an der dorsalen Seite des injizierten Gliedmaßen und Rumpf.
3. Verwenden stumpfe Dissektion, aussetzen der Ischiasnerv tief in die Muskeln.
4. Die Nerv-Kurse zwischen dem Ilium und dem Kreuzbein. Um Zugriff auf die Nerven im Rückenmark Region haben, trennen Sie die beiden Knochen. Legen Sie zuerst geschlossenen Schere im schmalen Bereich befindet sich der Ischiasnerv und öffnen Sie dann die Schere halten Sie die Maus. Sein zart und die Integrität des Nervus ischiadicus während der Präparation.
5. Sorgfältig den Ischiasnerv bis zum Ende des Femur distal und proximal des Rückenmarks zu sezieren.
6. Hinweis: Angegriffene Nerven sind sehr zerbrechlich und anfällig für Bruch unter Spannung oder gewaltsame Behandlung.
7. Ernten Sie den Nerv durch erste schneiden ihrem distale Ende. Heben Sie vorsichtig den Nerv während aus angrenzenden Gewebe zu befreien. Schneiden Sie den Nerv am proximalen Ende, so nah wie möglich an seinem Austritt aus der Wirbelsäule.
8. Datensatz dann Brutto Länge der Invasion mit einem Nonius-Bremssattel. Diese makroskopische Abschätzung ist nur indikativ.

(4) Nerven Sie Verarbeitung und Quantifizierung

1. Nervus seziert in zusammengesetzten OCT einbetten. Vergewissern Sie sich, Nerven längs zu platzieren und so flach auf den Boden der Form wie möglich.
2. Zeigen Sie auf der Kassette der proximalen und distalen Seite des Nervs durch markieren den Buchstaben P und D.
3. Platzieren Sie eingebettete Nerven auf Trockeneis, wenn sie nicht sofort geschnitten werden. Probe konnte bei-80 ° C für mehrere Wochen erhalten.
4. Abschnitt Muster mit einem Kryostat Mikrotom bei 5 μm Dicke und Ort Abschnitte auf Objektträgern. Wenn möglich, passen Sie 2 Nerven Abschnitte pro Folie. Proximalen Seite des Nervs anzugeben.
5. Führen Sie Folien mit H & E Färbung¹²zu Flecken.
6. Digital Scan gebeizt Nerv Abschnitte mit einem Dia-Scanner, der hochauflösende digitale Daten bereitstellt.
7. Mit imaging-Software, die Länge der Invasion durch Klicken auf die Schaltfläche Maßnahme Abstand zu quantifizieren, Bereich der Invasion oder anderen gewünschten Parameter. Verwenden Sie für eine gute Einschätzung der Länge der Invasion mehrere Abschnitte (2 bis 4) auf den gleichen Nerv.

Ergebnisse

Diese Methode beschreibt die chirurgische Implantation der pankreatischen Krebszellen in der murinen Ischiasnerv, ein in Vivo Modell quantifizierbare Nerv Invasion zu erstellen. Abbildung 1 zeigt die anatomische Lage des Nervus ischiadicus und der Injektionsstelle. Abbildung 2 zeigt die zwei Ischias Nerven eine nackte Maus. Ein Nerv injiziert PBS (links) kann auf einen Nerv injiziert mit MiaPaCa-2 Krebszellen (rechts) ve...

Diskussion

In diesem Protokoll beschreiben wir eine in Vivo Mausmodell Perineural Invasion, die für die Quantifizierung der Ischiasnerv Invasion von pankreatischen Krebszellen ermöglicht. Dieses Modell ermöglicht die Untersuchung der molekularen Mechanismen der Nerv Invasion. Erfolgreiche Experimente mit dieser Technik erfordern eine sorgfältige Annäherung an drei wichtige Schritte im Prozess: (1) die Injektion von Krebszellen (Schritte 2.7, 2.8), (2) die Gewinnung von angegriffene Nerven (Schritt 3.4) und (3) die Verarbei...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Maus			Anzahl und Alter variabel je nach experimentellem Bedarf
Zellkulturmedien (PBS, Trypsin und DMEM+10% FBS)	Alle		Schritte 1.1, 1.2, 1.3.
Konisches Zentrifugenröhrchen, 50 mL	Falcon	352098	Step 1.1
Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mL	Axygen	MCT-150-C-S	Step 1.2
Elektrorasierer	WAHL	9962	Step 2.1. Kann durch handelsübliches Haarentfernungsmittel
ersetzt werden Isofluran, 250 mL	Baxter	1001936060	Step 2.2
Hypoallergenic Surgical	Tape 3M Blenderm	70200419342	Step 2.3
Betadine Swapsticks	PDI	SKU 41350	Step 2.4
Webcol Alcohol Preps	Covidien	5110	Step 2.4
Sterile chirurgische Instrumente (Schere und Pinzette)			Schritte 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5
10 μ L Hamilton Spritze	Hamilton	80308	Schritte 2.7, 2.8
Stahl Mikrospatel	Fisher	Scientific S50823	Schritt 2.7
Präpariermikroskop			Schritt 2.7
Bupivacin, 1 g	Enzo Life Sciences	BML-NA139-0001	Schritt 2.9. Rekonstituieren zu 0,5
%5-0 Nylon-Nahtmaterial	Ethicon	698H	Schritt 2.9
Tissue-Tek O.C.T. Compound	VWR	25608-930	Schritt 4.1
Tissue-Tek Kryomold-Formen	VWR	25608-916	Schritt 4.1