Ein veränderter Split-TET2 Enzym für chemische-induzierbaren DNA Hydroxymethylation und epigenetische Umbau

Zusammenfassung

Detaillierte Protokolle für die Einführung ein veränderter Split-TET2 Enzym (Apfelwein) in Säugerzellen für chemische induzierbaren DNA-Hydroxymethylation und epigenetische Umbau werden vorgestellt.

Zusammenfassung

DNA-Methylierung ist eine stabile und vererbbare epigenetische Modifikation im Säugetier-Genom und engagiert sich bei der Regulierung der Genexpression Zellfunktionen steuern. Die Umkehrung der DNA-Methylierung und DNA Demethylierung wird durch die zehn-elf-Translokation (TET)-Proteinfamilie von Dioxygenases vermittelt. Obwohl es weit berichtet wurde, dass aberrante DNA-Methylierung und Demethylierung Entwicklungsschäden und Krebs zugeordnet sind, tragen wie diese epigenetischen Veränderungen unmittelbar auf die nachträgliche Veränderung im gen-Expression oder Krankheit Fortschreiten bleibt unklar, hauptsächlich aufgrund der Mangel an zuverlässigen Tools genau hinzufügen oder Entfernen von DNA-Veränderungen im Genom mit definierten zeitlichen und räumlichen Auflösung. Um diese Hürde zu überwinden, entwarfen wir ein Split-TET2 Enzym, zeitliche Steuerung der 5-Methylcytosine (5mC) Oxidation und anschließenden Umbau des epigenetischen Staaten in Säugerzellen durch einfaches Hinzufügen von Chemikalien zu ermöglichen. Hier beschreiben wir Methoden für die Einführung einer Chemikalie-induzierbaren Epigenom umgestaltet Tools (Apfelwein), basierend auf ein Enzym entwickelt Split-TET2 in Säugetierzellen und Quantifizierung der chemischen induzierbaren Produktion des 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC) mit Immunostaining, Durchflusszytometrie oder eine Dot-Blot-Test. Diese Chemikalie-induzierbaren Epigenom Umbau Werkzeug finden breite Verwendung in Verhören zellulare Systeme ohne Veränderung des genetischen Codes sowie in Epigenotype−phenotype Beziehungen in verschiedenen biologischen Systemen zu sondieren.

Einleitung

DNA-Methylierung, meist bezieht sich auf die Zugabe von einer Methylgruppe an die Carbon 5 Position von Cytosin, 5-Methylcytosine (5mC) zu bilden, ist durch DNA-Methyl-Transferasen (DNMTs) katalysiert. 5mC fungiert als eine wichtige epigenetische Markierung im Säugetier-Genom, das oft für transkriptionellen Repression, X-Chromosom Inaktivierung und Transposon-Stummschaltung¹signalisiert. Die Umkehrung der DNA-Methylierung wird durch die zehn Elfen Translokation (TET) Protein-Familie vermittelt. TET Enzyme gehören zum Eisen (II) und 2 Oxoglutarate abhängigen Dioxygenases, die die aufeinanderfolgenden Oxidation von 5mC, 5-Hydroxymethylcytosine (5....

Protokoll

(1) Zell-Kultur, Plasmid Transfection und chemische Induktion

1. Kultur eine adhärente Zell-Linie (z. B. der menschlichen embryonalen Niere HEK293T Zelle) in Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum, 100 U/mL Penicillin und Streptomycin bei 37 ° C mit 5 % CO₂.
2. Transfizieren Sie Zellen mit dem Apfelwein-Plasmid.
   1. Mindestens 18 Stunden vor Transfektion, 0,3 x 10⁶ Samenzellen in 2,5 mL des entsprechenden DMEM pro auch in eine 6-Well-Platte und inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C über Nacht um 60-80 % Konfluenz zu erreichen.
   2. Vorwärmen d....

Ergebnisse

Chemische induzierbaren 5mC-5hmC-Umwandlung kann durch Immunostaining auf einzellige, Flow-Zytometrie-Analyse auf transfizierten (mCherry-positiv) Zell-Populationen, oder eine mehr quantitative Dot-Blot-Test wie in Abbildung 1dargestellt validiert werden. Die katalytische Domäne von TET2 oder TET2CD, wurden während der Studie als Positivkontrolle verwendet. Siehe Referenzen 18-20 für weitere Einzelheiten über die genomweite Kartierung von Rapamycin-induzierte.......

Diskussion

Hier haben wir gezeigt, die Verwendung eines technischen Split-TET2 Enzyms, zeitliche Steuerung der DNA-Hydroxymethylation zu erreichen. Nach der Entdeckung des TET-Familie von 5-Methycytosine-Dioxygenase wurden viele Studien durchgeführt, um die biologischen Funktionen von TET Proteine und ihre katalytische Hauptprodukt 5hmC^{1,2,3zu entschlüsseln, 4,5,}

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz	Thermo Fisher Scientific	11668027
Rapamycin	Sigma-Aldrich	37094
Paraformaldehyd, 16% Lösung	VWR	100503-916
Triton X-100	Amresco	0694-1L
Salzsäure	Amresco	0369-500ML
Albumin,	Rind Amresco	0332-100G
Tween 20	Amresco	0777-1L
5-Hydroxymethylcytosin (5-hmC) Antikörper (pAb)	Aktives Motiv	39769
Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11008
4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)	Biotium	40043
SVAC1E SHEL LAB Economy-Vakuumofen, 0,6 Kubikfuß (17 L)	SHEL LAB	SVAC1E
UltraPure SSC, 20X	Thermo Fisher Scientific	15557036
Bio-Dot Apparat	BIO-RAD	1706545
Anti-5-Methylcytosin (5mC) Antikörper, Klon 33D3	Millipore	MABE146
Anti-Maus IgG, HRP-linked Antikörper	Cell Signaling Technology	7076S
Anti-Kaninchen IgG, HRP-linked Antikörper	Zellsignaltechnologie	7074S
West-Q Pico Dura ECL Lösung	Gendepot	W3653-100