Methodenartikel

Kombination von quantitativer Nahrungsaufnahme Assays und zwangsweise Aktivierung von Neuronen um Appetit in Drosophila studieren

8K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/56900

⸱

24. April 2018

 ,  , 
1School of Life Science, University of Science and Technology of China, 2State key Laboratory of Brain and Cognitive Science, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, 3University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quantitative Nahrungsaufnahme Assays mit gefärbten Lebensmittel bieten eine robuste und Hochdurchsatz-Mittel zur Fütterung Motivation zu bewerten. Kombination des Lebensmittel Verbrauch Tests mit thermogenetischen und optogenetische Bildschirme ist ein leistungsfähiger Ansatz zu untersuchen, die neuronale Schaltkreise, die zugrunde liegenden Appetit bei Erwachsenen Drosophila Melanogaster.

Zusammenfassung

Verzehr von Lebensmitteln ist unter strenge Kontrolle des Gehirns, die die physiologischen Zustand, Schmackhaftigkeit und Ernährung Inhalt der Ernährungs- und Themen-Befehle zum Starten und stoppen Fütterung integriert. Entschlüsseln die Verfahren für die Beschlussfassung rechtzeitig und moderate Hauptimplikationen trägt in unserem Verständnis der physiologischen und psychologischen Erkrankungen im Zusammenhang mit der Kontrolle Fütterung Fütterung. Robustere, einfach und quantitative Methoden sind erforderlich, um die Nahrungsaufnahme der Tiere nach experimentelle Manipulation, wie die zwangsweise Erhöhung der Aktivitäten von bestimmten Ziel-Neuronen zu messen. Hier führten wir ein Farbstoff-Kennzeichnung-basierte Fütterung Assays zur Erleichterung die neurogenetic Studie der Fütterung Kontrolle bei Erwachsenen Fruchtfliegen. Wir überprüfen zur Verfügung Fütterung Assays, und dann beschreiben unsere Methoden Schritt für Schritt von Setup zur Analyse, die thermogenetischen kombinieren und optogenetische Manipulation von Neuronen Steuern Fütterung Motivation mit Farbstoff-markierten Lebensmittel Aufnahme Assay. Wir diskutieren auch die Vorzüge und Grenzen unserer Methoden, im Vergleich zu anderen Fütterung Assays, wählen Sie einen entsprechenden Assay Lesern helfen.

Einleitung

Die Menge der aufgenommenen Nahrung die Quantifizierung ist wichtig für die Bewertung mehrere Aspekte der Steuerung durch das Gehirn reagiert auf die internen Bedürfnisse (z. B. Hunger Staaten) und externe Faktoren (z. B. Lebensmittelqualität und Schmackhaftigkeit)1, Fütterung 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. in den letzten Jahren die Bemühungen der Entzifferung der neurale Substrate der Fütterung Kontrolle in Drosophila führen zu die Entwicklung von mehreren Assays direkt die Menge der aufgenommenen Nahrung zu quantifizieren oder dienen als Indikator für die Fütterung von Motivation 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.

Die Kapillare Einzug (CAFE) Assay12,13 wurde entwickelt, um die Menge des Konsums von flüssigen Lebensmitteln in ein Glas Microcapillary zu messen. Die CAFE-Assay ist sehr empfindlich und reproduzierbare17 und vereinfacht die Messung der Verzehr von Lebensmitteln, vor allem zur Quantifizierung der langfristige Fütterung18. Dieser Test erfordert jedoch die fliegen an der Spitze der Microcapillary Klettern und füttern verkehrt, die eignet sich nicht für alle Stämme. Zusätzlich, da die fliegen, mit CAFE-Assay getestet werden auf flüssige Nahrung aufgezogen werden müssen, bleibt die Wirkung dieser Aufzuchtsbedingungen auf Stoffwechsel-Status oder die möglichen Unterernährung ermittelt werden.

Der Rüssel Erweiterung Antwort (PER) Assay11,14 zählt die Häufigkeit der Rüssel Erweiterung Antworten auf sanfte Berührungen von Lebensmittel Tropfen. PRO Test erwies sich als eine hervorragende Möglichkeit, bewerten Fütterung Motivation der einzelnen Fliege und Esel den Einfluss der Schmackhaftigkeit und Inhalt der Nahrung18,19. Es ist jedoch keine direkte Quantifizierung der Einnahme-Menge.

Vor kurzem wurde ein halbautomatisches Verfahren, die manuelle Zuführung Assay (MAFE)15, entwickelt. In MAFE wird eine Fliege immobilisierte manuell mit einem Microcapillary mit Essen zugeführt. Angesichts der Tatsache, dass Rüssel Erweiterung Antworten und Verzehr von Lebensmitteln gleichzeitig überwacht werden können, eignet sich MAFE für die Beurteilung der Nährwerte und die Auswirkungen der pharmakologischen Manipulation. Jedoch könnte eine Fliege Immobilisierung seine Verhaltensstörungen Leistung, einschließlich Fütterung beeinträchtigen.

Darüber hinaus fliegen Rüssel und Aktivität-Detektor (FlyPAD)10 wurde entwickelt, um automatisch Fressverhalten zu quantifizieren. Mit Machine Vision Methoden zeichnet FlyPAD physikalische Wechselwirkungen zwischen einer Fliege und Lebensmittel, die Häufigkeit und Dauer der Rüssel Erweiterungen als Indikator der Fütterung Motivation zu quantifizieren. FlyPAD bietet ein Hochdurchsatz-Ansatz für die Fütterungen Verhalten einer frei beweglichen Fliege zu überwachen, wenn auch die Empfindlichkeit und die Robustheit dieses Systems noch mehr weiter bestätigt werden12Studien.

Kennzeichnung Strategien werden häufig verwendet, um Nahrungsaufnahme fliegen zu schätzen. Es ist üblich, beschriften Sie Lebensmittel mit chemischen Tracer und nach der Fütterung, Messen Sie die Menge des aufgenommenen Tracer, die Menge der Nahrungsaufnahme zu berechnen. Radioaktiver Tracer16,17,20,21,22,23,24,25 ermöglichen die Erkennung durch die Kutikula ohne Homogenisierung der fliegen. Diese Methode bietet bemerkenswert geringe Variabilität und hohe Empfindlichkeit18und ist für Langzeit-Studie der Nahrungsaufnahme möglich. Allerdings sollte die Verfügbarkeit von nutzbaren Radioisotopen und verschiedene Sätze von Absorption und Ausscheidung berücksichtigt werden bei der Arbeit mit dieser Assay.

Kennzeichnung und Rückverfolgung Nahrungsaufnahme mit ungiftige Lebensmittelfarben ist eine sicherere und einfachere alternative2,3,26,27,28. Fliegen werden nach der Fütterung mit Lebensmitteln, die nicht resorbierbaren und lösliche Farbstoffe homogenisiert und die Menge des aufgenommenen Farbstoffs ist später quantifiziert mit einem Spektrophotometer3,24,28,29 . Die Kennzeichnung Strategie ist einfach durchzuführen und bietet eine hohe Effizienz, aber mit einer Einschränkung. Das Volumen der Nahrungsaufnahme geschätzt aus den aufgenommenen Farbstoff ist kleiner als das tatsächliche Volumen weil Ausscheidung bereits 15 Minuten beginnt nach dem Fliegen fressen17. Darüber hinaus bewertet der Assay Nahrungsaufnahme in der Regel binnen 60 Minuten, die nur geeignet für die Untersuchung von kurzfristigen Fütterung Verhalten24,28. Darüber hinaus mehrere interne und externe Faktoren, wie z. B. Genotyp17, Geschlecht17, Stand17, Aufzucht, Dichte30, zirkadianen Rhythmus31,32und Lebensmittel Qualität3 gedeckt , 8 , 16, Einfluss Nahrungsaufnahme. Daher müssen die Fütterung Dauer nach bestimmten experimentellen Bedingungen angepasst werden. Neben die Quantifizierung der Nahrungsaufnahme zu erleichtern, dienen Lebensmittelfarben, Essen Auswahl2,19,27zu bewerten und den Meniskus in einer Microcapillary im CAFE Assay12zu visualisieren.

Hier stellen wir eine Protokoll kombiniert Manipulation von neuronaler Aktivität mit Farbstoff-labeling-Ansatz. Diese Strategie ist in unserer neurogenetic Studie zur Fütterung Kontrolle in Erwachsenen Fruchtfliegen24nützlich erwiesen. Die visuelle scoring-Methode ermöglicht eine schnelle Einschätzung der Verzehr von Lebensmitteln; Daher ist es sinnvoll für das Screening durch eine große Anzahl von Stämmen in einer zeitgemäßen Weise. Die Kandidaten vom Bildschirm werden dann im Detail mit einer kolorimetrischen Verfahren bieten Objektive und präzise Quantifizierung in zusätzliche Studie analysiert.

Neben der Fütterung Assays erläutern wir im folgenden die thermogenetischen27,33,34,35 optogenetische36 Methoden und Ziel Neuronen in Drosophilagewaltsam zu aktivieren. Neuronen von thermogenetischen aktivieren Bedienung ist einfach und bequem mit Drosophila Transienten Rezeptor potenzielle Ankyrin-Repeat-(AR)-1 (dTRPA1), die eine Temperatur und Spannung-gated kation Kanal, die neuronale Erregbarkeit erhöht wenn die Umgebungstemperatur Temperatur steigt über 23 ° C33,37; jedoch könnte die Tiere bei hohen Temperaturen beim Testen nachteilige Auswirkungen auf Verhalten erstellt. Ein weiteres effektiver Ansatz zur Aktivierung von Neuronen in Drosophila nutzt optogenetik mit CsChrimson36, das ist eine rot-verschoben Variante des Channelrhodopsin, das erhöht die Erregbarkeit der Neuronen bei Lichteinfall. Optogenetik bietet höhere zeitliche Auflösung und weniger Störungen für Verhaltensweisen als Thermogenetics. Die quantitative Messung der Nahrungsaufnahme mit der Manipulation von neuronaler Aktivität zu verbinden, stellt einen effektiven Ansatz zur Erforschung der neuronalen Mechanismen der Fütterung.

Wir beschreiben ausführlich die Vorbereitung der Füllraum und die fliegen getestet werden. Mit Taotie-Gal4 fliegen als ein Modell24, beschreiben wir aktivierende Neuronen durch Thermogenetics und optogenetik. Zwei Tests der Quantifizierung der Verzehr von Lebensmitteln mit Farbstoff-markierten Lebensmittel werden ebenfalls im Protokoll beschrieben.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

1. Vorbereitung der füllraum

Hinweis: Der Füllraum für Farbstoff-Kennzeichnung Fütterung Assay besteht aus zwei Teilen: der Außen Container (als Deckel) und innen Container (als Nahrungsquelle).

  1. Ändern den außen Container von einem Glasfläschchen für die Kultivierung von Drosophila mit (einem Innendurchmesser von 31,8 mm) und einer Höhe von 80 mm (Abb. 1A, 1 C). Abdeckung der Unterseite des Behälters mit einer Schicht von 1 % Agarose (5 mL) auf die Fütterung Setup ordnungsgemäß zu halten befeuchtet und dienen als weiche Substrat für die fliegen gehen auf (Abbildung 1 b). Der Container bietet damit eine kontrollierte aber naturalistische Einstellung mit minimalem Stress oder Störung, die fliegen.
    1. Bereiten Sie den äußeren Container. 0,5 g Agarose in 50 mL doppelt destilliertes Wasser, Wärme unter häufigen rühren, suspendieren und Kochen auf einem Magnetrührer mit einer Heizplatte vollständig auflösen.
    2. Wenn das 1 % Agarose kühlt auf ca. 60 ° C, 5 mL 1 % Agarose ein leeres außerhalb Containers (Abbildung 1 b), und lasse Sie den Container bleiben offen, bis auf Raumtemperatur bringen eine Agarose-Pad abgekühlt.
  2. Farbstoff-markierten Essen zubereiten. Zusammensetzung der Farbstoff-markierten Lebensmittel variiert je nach verschiedenen experimentellen Zwecken. Hier ist ein Beispiel der Vorbereitung der Farbstoff-markierten Lebensmittel enthalten nur Saccharose.
    1. 0,5 g Agarose in 50 mL doppelt destilliertem Wasser, Wärme unter häufigen Rühren hinzufügen und Kochen auf einen Magnetrührer mit einer Heizplatte vollständig auflösen.
    2. Wenn die oben genannten 1 % Agarose auf etwa 60 ° C abkühlt, fügen Sie 1,71 g Saccharose die Agarose, 100 mM Saccharose zu erhalten hinzu.
    3. Die Agarose-Lösung 0,5 % (w/V) Farbstoff-markierten Lebensmittel erhalten fügen Sie 0,25 g blauer Farbstoff (Erioglaucine binatrium hinzu).
  3. Bereiten Sie das innere Container. Setzen Sie die leere im Inneren von Behältern auf einer flachen Unterlage, dann 750 µL der blaue Farbstoff-markierten Lebensmittel an einzelne Lebensmittel-Container, lassen Sie es mindestens 5 min lang zu festigen.
    Hinweis: Der innere Container ist eine kleine Plastikschale mit einem Innendurchmesser von 13,6 mm und einer Höhe von 7,5 mm (Abb. 1A, 1 C). Es ist gefüllt mit Farbstoff-markierten Essen und ist dann in der Mitte des Agarose-Pads des äußeren Containers positioniert.
  4. Übertragen Sie einer gefüllten Container in eine vorbereitete außen Container und positionieren Sie es in der Mitte des Agarose-Pad. Lassen Sie die Fütterungen Kammern bei Raumtemperatur für 40 min geöffnet bleiben, bis die Wand des äußeren Containers frei von Kondensation ist.
    Hinweis: Die Trockenmauer ist notwendig, um zu verhindern, dass die fliegen durch Kontaktaufnahme mit Wassertropfen an der Wand stecken.
  5. Bereiten Sie Fütterung Kammern mit Farbstoff-freie Lebensmittel (gleiche Zusammensetzung aber ohne Farbstoff) für Hintergrundabzug.

2. Vorbereitung der fliegen

Hinweis: Erwachsenes Weibchen fliegt 5 bis 10 Tag nach bewegungsapparate dienen normalerweise zur Fütterung Assays. Es empfiehlt sich, fliegt der verschiedenen Genotypen, einschließlich genetischen Kontrollen vorzubereiten und parallel zu testen. 20 fliegen (von einem Füllraum) erzeugen einen Datenpunkt.

  1. Betrachten Sie die Bevölkerungsdichte für die Aufzucht von Erwachsener Flies. In der Regel steuern Sie die Bevölkerungsdichte durch Variation der Anzahl der Eltern fliegen nach den Strapazen und die Dimensionen von Kultur-Flaschen. Als Beispiel 15 Männer und 30 Frauen des Kantons-S eine kulturflasche mit (31,8 mm Durchmesser) und einer Höhe von 80 mm und lasse Sie die Weibchen legen von Eiern für einen Tag, dann entfernen Sie die Erwachsenen fliegen.
  2. Thermogenetischen Aktivierung fliegen vorbereiten.
    1. Verwenden Sie die Gal4/UAS-System38 dTRPA133 in verschiedenen Neuronen durch Kreuzung zum Ausdruck zu bringen, die FH-dTrpA1 mit verschiedenen GAL4 Fahrer Linien (Abb. 2 b) fliegt.
    2. Halten Sie die Erwachsenen fliegen auf standard-Food bei 22 ° C, 60 % relativer Luftfeuchtigkeit und einer 12 h/12 h Hell-Dunkel-Zyklus.
    3. Zwei Tage vor der Fütterung assay, Sortieren und fliegt auf eine CO2 fliegen Pad unter dem Stereo-Mikroskop in eine frische Lebensmittel Durchstechflasche zu sammeln und eine Dichte von 20 fliegen pro Fläschchen halten.
  3. Optogenetische Aktivierung fliegen vorbereiten.
    1. Verwenden Sie die Gal4/UAS-System38 CsChrimson36 in verschiedenen Nervenzellen durch Kreuzung UAS-CsChrimson fliegen mit verschiedenen GAL4 Fahrer Linien zum Ausdruck zu bringen.
    2. Neu sammeln Sie geschlüpften (innerhalb von 24 h) fliegen zu und übertragen Sie sie in ein Fläschchen mit standard-Food mit 400 µM All-Trans-Retinal.
    3. Zur Vermeidung von vorzeitigen Aktivierung der Aufzucht Fläschchen mit Alu-Folie wickeln und dann steckte sie in eine dunkle Kiste fliegen vor unerwünschten Lichtstimulation zu schützen. Halten Sie die fliegen bei 25 ° C, 60 % Luftfeuchtigkeit in der Dunkelheit für 4-6 Tage.
    4. Zwei Tage vor der Fütterung Assay fliegt Art weiblich auf CO2 fliegen Pad unter dem Stereo-Mikroskop. Sammeln Sie 20 fliegen in einem Lebensmittel Durchstechflasche und halten sie in der Dunkelheit vor der Fütterung Test.
    5. Führen Sie alle Operationen unter schwachem Licht so schnell wie möglich, die Auswirkungen durch Umgebungslicht zu vermeiden. Verwenden Sie eine LED-Lampe weit weg aus dem Arbeitsbereich platziert, die Intensität auf den Arbeitsbereich 5 µW/cm2.
      Hinweis: Verwendung verhungert Kanton-S fliegt als Positivkontrolle für die Fütterung Assay. Diese fliegen von Lebensmitteln zu berauben und pflegen auf 1 % Agarose für 24 h vor der Fütterung Test. Die Ebenen der Nahrungsaufnahme dieser fliegen helfen die täglichen Schwankungen zu bewerten.

(3) thermogenetischen Aktivierung

  1. Führen Sie alle Fütterungsversuche zur gleichen Zeit des Tages, um Zeitgeber Zeit 4-631,32, um Abweichungen aufgrund zirkadianen Rhythmen zu minimieren.
  2. Inkubator (oder einen kleinen Raum mit einer Temperatur-kontrollierten Heizung) als die Heizung Umwelt vorbereiten.
  3. Vor Verhaltensexperimente equilibrate der vorbereiteten Fütterungen Kammern an die experimentelle Temperatur (30 ° C) für 2 h um sicherzustellen, dass die Temperatur relativ Uniform in den Füllraum ist.
  4. Um die Fütterung zu starten, übertragen Sie sorgfältig 20 fliegen aus ihrer Heimat Fläschchen in einem vorgeheizten Füllraum durch sanftes antippen. Fahren Sie fort, Fütterung bei 30 ° C für 60 min ( Abbildung 3A) .
    Hinweis: Häufige Aufregungen, sollte wie z. B. Öffnen und Schließen der Tür Inkubator beeinträchtigen das Fressverhalten somit minimiert werden.
  5. 30 min nicht mehr in der Fütterung bei 60 min durch das Einfrieren der Fütterungen Kammern bei-80 ° C (oder-20 ° C).
    Hinweis: Einfrieren hilft, um Fütterungen in allen Kammern gleichzeitig zu stoppen. Fliegen bei-80 ° C Einfrieren dient zwei Zwecken, für die fliegen euthanizing und Einlagerung bis Homogenisierung bis zu einer Woche.
  6. Übertragen Sie für die Kontrollgruppe Temperatur 20 fliegen in einer Fütterung Kammer mit Farbstoff gefärbte Lebensmittel mit der Fütterung beginnen bei 22 ° C für 60 min. Temperatur.
  7. 30 min nicht mehr in der Fütterung der Kontrollgruppe Temperatur durch das Einfrieren der Kammern bei-80 ° C (oder-20 ° C).

4. Optogenetische Aktivierung

  1. Führen Sie alle Fütterungsversuche zur gleichen Zeit des Tages, um Zeitgeber Zeit 4-631,32, um Abweichungen aufgrund zirkadianen Rhythmen zu minimieren.
  2. Sorgfältig 20 fliegen aus einem Fläschchen in einem Füllraum durch sanftes antippen, und setzen Sie dann die Kammer seitlich auf die Beleuchtung Setup (Abbildung 4A, 4 b).
    1. Für optogenetische Manipulation, verwenden Sie ein Array von orange LEDs (607 nm) als Quelle der Lichtstimulation und Fix eine horizontale Plexiglasplatte über die LEDs, die Fütterung unterstützen Kammern während der Beleuchtung. Halten Sie das Setup in einem Inkubator bei 25 ° C mit 60 % Luftfeuchtigkeit (Abbildung 4A, 4 b).
    2. Stimulieren die genetische Kontrolle fliegen parallel zu den Taotie > CsChrimson fliegt, aber füttern in verschiedenen Kammern.
  3. Fortfahren Sie der Fütterung für 60 min mit der hinteren Beleuchtung durch das Orange Licht.
    1. Bestimmen Sie die optimale Beleuchtung Intensitäten für optogenetik experimentell36. Für die Taotie > CsChrimson fliegen, eine Intensität von 2,2 mW/mm2 induziert Lähmung (Einstellung der Fortbewegung) und Verlust der posturalen Kontrolle daher, eine mittlere Intensität 0,1 mW/mm2 verwenden, um die Taotie stimulieren > CsChrimson fliegt während der Fütterung Test.
  4. 30 min nicht mehr in der Fütterung durch Einfrieren Fütterung Kammern bei-80 ° C (oder-20 ° C).

5. visuelle Einschätzung der Verzehr von Lebensmitteln

Hinweis: Die visuelle scoring Ansatz bietet eine semi-quantitative Abschätzung der Nahrung Verbrauch. Es ist, zwar nicht so objektiv wie die optische Methode ermöglicht diese Methode durchläuft eine große Anzahl von fliegen-Stämme in einer zeitgemäßen Weise, eignet sich für die erste Runde eine genetische Bildschirm, um die Liste der Kandidaten für weitere Tests schnell eingrenzen.

  1. Nach der Fütterung Prozess zu betäuben und Gäste die fliegen auf einen CO2 fliegen Pad unter dem Stereo-Mikroskop. Jede Fliege anhand der Lautstärke und Intensität der Farbstoff gefärbte Lebensmittel in ihren Bauch (Abbildung 2A) verleihen Sie Einzelnote.
    Hinweis: Kriterien für visuelle Einschätzung: Score-System verfügt über 4 Ebenen der Nahrungsaufnahme entsprechend unterschiedliche Volumina und Intensitäten der farbigen Nahrung im Bauch.
    1. Partitur fliegt ohne nachweisbare Farbstoff gefärbte Lebensmittel eine Punktzahl von 0; Gib denen mit schwacher (kaum erkennbar) blauen Farbstoff oder mit Farbstoff-farbigen essen weniger als ein Drittel des Volumens des Bauches besetzen einen Wert von 1.
    2. Partitur fliegt mit intensiven Farbstoff gefärbte Lebensmittel besetzen Hälfte des Bauches eine Punktzahl von 2.
    3. Gäste die mit intensiv gefärbten Inhalte besetzen mehr als die Hälfte des Bauches eine Kerbe von 3 (Abbildung 2A).
  2. Berechnen Sie den Anteil von Fliegen mit verschiedenen Punktzahlen in jeder versuchsbedingung (Abb. 2 b).

6. farbmetrischen Quantifizierung der Verzehr von Lebensmitteln

  1. Gießen Sie nach Beendigung der Fütterung alle 20 fliegen von einem Füllraum auf ein Stück mit einem Gewicht von Papier, dann übertragen sie in 1,5 mL Tube mit einer weichen Bürste.
    Hinweis: Nehmen Sie alle Kammern aus-80 ° C Lagerung nicht zur gleichen Zeit fliegen festhalten an der Kammerwand wegen Kondenswasser auf der Kältekammer zu vermeiden.
  2. Das Rohr 500 µL PBST hinzu und homogenisieren die fliegen mit eine Mühle bei 60 Hz für 5 s.
    1. Bestätigen Sie ausreichende Homogenisierung durch Beobachtung, gibt es keine nachweisbaren Fragmente von Körperteilen.
  3. Drehen Sie die Rohre mit Homogenates für 30 min bei 13.000 u/min um die Trümmer zu löschen.
  4. Übertragen Sie nach Zentrifugation 100 µL des Überstandes auf einen Brunnen einer 96-Well-Platte.
  5. Nachdem alle Samples geladen werden, setzen die Platte in einen Teller Reader zur Messung der Extinktion der Proben bei 630 nm.
  6. Entfernen die Hintergrund-Absorption, subtrahieren die Extinktion der Überstände von fliegen gefüttert Lebensmittel ohne Farbstoff aus der Extinktion des Überstands von der blauen Nahrung gefüttert fliegen.
    Hinweis: Dieser Schritt ist optional, abhängig von den Kompositionen des Essens verwendet. Wenn eine Fliege Essen (ohne den Farbstoff) erzeugt Extinktion bei 630 nm, ist es notwendig, führen Sie diesen Schritt, um den Hintergrund zu eliminieren.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Thermogenetischen Bildschirm.

Abnorm gesteigerter Appetit führt zu erhöhter Nahrungsaufnahme, unabhängig von physiologischen Bedürfnissen. Wir nutzten diese Regelung zu einer Hochdurchsatz-design Verhaltens Bildschirm zu genetischen Griffe von Neuronen im Zusammenhang mit hunger und satt Staaten (Abbildung 1). Der Bildschirm hat Taotie-Gal424ergeben. Bei aktiviertem ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Dieser Bericht konzentriert sich auf den technischen Prozess der Farbstoff-Kennzeichnung Fütterung Assays der Verzehr von Lebensmitteln im Rahmen von thermogenetischen und optogenetische Aktivierung von Neuronen zu manipulieren controlling Fütterung. Dieses einfache und zuverlässige Protokoll wird dazu beitragen, die Funktion der Kandidat Neuronen in der Fütterung kontrollieren, Essen bevorzugt fliegen zu messen und zu identifizieren, neue Spieler in der Fütterung Steuerstromkreisen über Fütterung-basierten genetischen B...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch National Basic Research Program of China (2012CB825504), der National Natural Science Foundation of China (91232720 und 9163210042), chinesische Akademie der Wissenschaften (CAS) (GJHZ201302 und QYZDY-SSW-SMC015), Bill und Melinda Gates Stiftung (OPP1119434) und 100-Talente-Programm von CAS, Y. Zhu.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
UAS-CsChrimsonBloomintoon55135
UAS-dTrpA1Bloomintoon26263
TDC1-GAL4 Bloomintoon9312
TDC2-GAL4Bloomintoon9313
sNPF-GAL4zur Verfügung gestellt von Z. Zhao
NPF-GAL4zur Verfügung gestellt von Y. Rao
TH-GAL4zur Verfügung gestellt von Y. Rao
5-HT-GAL4zur Verfügung gestellt von Y.
Rao AKH-GAL4zur Verfügung gestellt von Y. Rao
dip2-GAL4zur Verfügung gestellt von Y. Rao
Taotie-GAL4zur Verfügung gestellt von J. Carlson
AgaroseBiowestG-10
SaccharoseSigmaS7903
Eriogalucin DinatriumsalzSigma861146
all-trans-retinal Sigma R2500in der Dunkelheit gelagert
Triton X-100Amresco9002-93-01
Fliegenfutter1 L Futter enthält: 77,7 g Maismehl, 32,19 g Hefe, 5 g Agar, 0,726 g CaCl2, 31,62 g Saccharose, 63,2 g Glukose, 2 g Kaliumsorbat, pH     
  1x PBS Puffer 1 L 1X PBS enthält: 8 g Nacl, 0,2 g Kcl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4, pH 7,4
PBST-Puffer1X PBS mit 1% Triton X-100
  MahlmühleShang Hai Jing XinTissuelyser-24
InkubatorNing Bo Jiang NanHWS-80
Magnetrührer mit HeizplatteChang Zhou Bo YuanCJJ 78-1
SpektrometerThorlabsCCS200/M
Mikrotiterplatten-SpektralphotometerThermo Scientific Multiskan GO Typ: 1510, REF 51119200
Fluoreszenz-Stereomikroskop Leica  M205FA
StereomikroskopLeicaS6E
AußenbehälterJiang Su Hai MenGlasfläschchen mit einem Durchmesser von 31,8 mm und einer Höhe von 80 mm (Innenmaß)
Innenbehälter Beijing Yi Ran MaschinenfabrikKunststoffschale mit einem Durchmesser von 13,6 mm und einer Höhe von 7,5 mm (Innenmaß)
1,5 mL Eppendorf RöhrenHai Men Ning Mong
  96-Well-PlatteCorning Incorporated Costar 3599
LEDsXin Xing Yuan Guangdian607 nm, 3W https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058

Referenzen

  1. Gao, Q., Horvath, T. L. Neurobiology of feeding and energy expenditure. Annu Rev Neurosci. 30, 367-398 (2007).
  2. Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila. Cell. 156 (3), 510-521 (2014).
  3. Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. J Exp Biol. 197, 215-235 (1994).
  4. Miyamoto, T., Slone, J., Song, X., Amrein, H. A fructose receptor functions as a nutrient sensor in the Drosophila brain. Cell. 151 (5), 1113-1125 (2012).
  5. Morton, G. J., Cummings, D. E., Baskin, D. G., Barsh, G. S., Schwartz, M. W. Central nervous system control of food intake and body weight. Nature. 443 (7109), 289-295 (2006).
  6. Pool, A. H., Scott, K. Feeding regulation in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 29, 57-63 (2014).
  7. Soderberg, J. A., Carlsson, M. A., Nassel, D. R. Insulin-Producing Cells in the Drosophila Brain also Express Satiety-Inducing Cholecystokinin-Like Peptide, Drosulfakinin. Front Endocrinol (Lausanne). 3, 109(2012).
  8. Stafford, J. W., Lynd, K. M., Jung, A. Y., Gordon, M. D. Integration of taste and calorie sensing in Drosophila. J Neurosci. 32 (42), 14767-14774 (2012).
  9. Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13289-13294 (2005).
  10. Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nat Commun. 5, 4560(2014).
  11. Mair, W., Piper, M. D., Partridge, L. Calories do not explain extension of life span by dietary restriction in Drosophila. PLoS Biol. 3 (7), e223(2005).
  12. Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (121), (2017).
  13. Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (20), 8253-8256 (2007).
  14. Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J Vis Exp. (3), e193(2007).
  15. Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Mol Brain. 8, 87(2015).
  16. Ja, W. W., et al. Water- and nutrient-dependent effects of dietary restriction on Drosophila lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18633-18637 (2009).
  17. Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
  18. Deshpande, S. A., et al. Acidic Food pH Increases Palatability and Consumption and Extends Drosophila Lifespan. J Nutr. 145 (12), 2789-2796 (2015).
  19. Dus, M., Min, S., Keene, A. C., Lee, G. Y., Suh, G. S. Taste-independent detection of the caloric content of sugar in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (28), 11644-11649 (2011).
  20. Shen, P., Cai, H. N. Drosophila neuropeptide F mediates integration of chemosensory stimulation and conditioning of the nervous system by food. J Neurobiol. 47 (1), 16-25 (2001).
  21. Yang, Z., et al. Octopamine mediates starvation-induced hyperactivity in adult Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 5219-5224 (2015).
  22. Ramdya, P., Schneider, J., Levine, J. D. The neurogenetics of group behavior in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 220 (Pt 1), 35-41 (2017).
  23. Sanchez-Alcaniz, J. A., Zappia, G., Marion-Poll, F., Benton, R. A mechanosensory receptor required for food texture detection in Drosophila. Nat Commun. 8, 14192(2017).
  24. Zhan, Y. P., Liu, L., Zhu, Y. Taotie neurons regulate appetite in Drosophila. Nat Commun. 7, 13633(2016).
  25. Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
  26. Wood, J. G., et al. Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans. Nature. 430 (7000), 686-689 (2004).
  27. Inagaki, H. K., et al. Visualizing Neuromodulation In Vivo: TANGO-Mapping of Dopamine Signaling Reveals Appetite Control of Sugar Sensing. Cell. 148 (3), 583-595 (2012).
  28. Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), e6063(2009).
  29. Sen, R., et al. Moonwalker Descending Neurons Mediate Visually Evoked Retreat in Drosophila. Curr Biol. 27 (5), 766-771 (2017).
  30. Ewing, L. S., Ewing, A. W. Courtship of Drosophila melanogaster in large observation chambers: the influence of female reproductive state. Behaviour. 101 (1), 243-252 (1987).
  31. Chatterjee, A., Tanoue, S., Houl, J. H., Hardin, P. E. Regulation of gustatory physiology and appetitive behavior by the Drosophila circadian clock. Curr Biol. 20 (4), 300-309 (2010).
  32. Xu, K., Zheng, X., Sehgal, A. Regulation of feeding and metabolism by neuronal and peripheral clocks in Drosophila. Cell Metab. 8 (4), 289-300 (2008).
  33. Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-255 (2008).
  34. Viswanath, V., et al. Ion channels - Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
  35. Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
  36. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  37. Viswanath, V., et al. Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
  38. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  39. Lee, K. S., You, K. H., Choo, J. K., Han, Y. M., Yu, K. Drosophila short neuropeptide F regulates food intake and body size. J Biol Chem. 279 (49), 50781-50789 (2004).
  40. Marella, S., Mann, K., Scott, K. Dopaminergic Modulation of Sucrose Acceptance Behavior in Drosophila. Neuron. 73 (5), 941-950 (2012).
  41. Albin, S. D., et al. A Subset of Serotonergic Neurons Evokes Hunger in Adult Drosophila. Current Biology. 25 (18), 2435-2440 (2015).
  42. Ro, J., et al. Serotonin signaling mediates protein valuation and aging. eLife. 5, e16843(2016).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Test zur NahrungsaufnahmeDrosophila melanogasterthermogenetische Aktivierungoptogenetische Stimulationfarbstoffmarkiertes FutterNeuronenmanipulationFressverhaltenQuantifizierung von blauem FarbstoffEinrichtung von Agarose PadsAnalyse mit dem Plattenleseger t

Verwandte Artikel