Methodenartikel

Quantifizierung der endogenen Auxin und Cytokinin während Internodium Kultur von Ipecac

DOI:

10.3791/56902

⸱

15. März 2018

 ,  , 
1Graduate School of Life Sciences, Toyo University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zufällige Triebe können auf Internodien Segmente der Ipecacuanha ohne Phytohormon Behandlung induziert werden. Um Phytohormon Dynamik während zufällig schießen Bildung zu bewerten, haben wir endogenen Auxin und Cytokinin in Internodien Segmenten von LC-MS/MS gemessen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zufällige Shooting Bildung ist eine wichtige Technik für die Ausbreitung der wirtschaftlich bedeutenden Kulturen und für die Regeneration von transgenen Pflanzen. Phytohormon Behandlung ist erforderlich für die Induktion von zufällige Aufnahmen bei den meisten Arten. Ob zufällig Triebe induziert werden können wird bestimmt durch das Gleichgewicht zwischen Auxin und Cytokinin (CK) Ebenen. Viel Aufwand geht in der Bestimmung der optimalen Konzentrationen und Kombinationen von Phytohormonen in jedem Gewebe als Explantaten verwendet und bei jedem Pflanzenarten. In Ipecac können jedoch zufällig Triebe auf Internodien Segmente in Kulturmedium ohne Phytohormon Behandlung induziert werden. Dies ermöglicht die inhärente Plastizität von Ipecac für Zelldifferenzierung ausgewertet werden. Um zufällige Triebe in Ipecac induzieren, kultivierten wir Internodien Segmente bei 24 ° C unter 15 µmol m−2 s−1 des Lichts in einem 14-h Licht/10-h dunklen Zyklus auf Phytohormon-freie B5 Medium verfestigt mit 0,2 % Gellan Gum für 5 Wochen. Um Phytohormon Dynamik während zufällig schießen Bildung zu untersuchen, haben wir gemessen endogenen Indol-3-acetic Acid und CKs in den Segmenten durch flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie LC-MS/MS. Diese Methode ermöglicht die Analyse der endogenen Indol-3-acetic Säure und CKs Ebenen auf einfache Weise. Es kann angewendet werden, um die Dynamik der endogenen Auxin und CK während der Organogenese in anderen Pflanzenarten zu untersuchen.

Einleitung

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Gottlieb Haberlandt (1854-1945) vorgeschlagen, das Konzept der "Totipotenz", von welchem Werk Zellen teilen können, unterscheiden, und ganze Pflanzen auch nach deren vorherige Differenzierung in bestimmten Zelltypen reifen Pflanzen1zu regenerieren. In der Gewebekultur wird ob Pflanze Regeneration induziert werden kann durch die Kombination und Konzentration von EXOGEN angewandte Phytohormonen in das Wachstumsmedium bestimmt. Skoog und Miller gefunden, dass zufällige Aufnahmen von Tabak Kallus auf Nährmedium enthält ein hohes Verhältnis von CKs, Auxine, induziert werden konnte, während zufällige Wurzeln auf ein niedriges Verhältnis2-haltigem Medium induziert werden konnte. Seit dieser Feststellung hat Gewebekultur für die Ausbreitung der wirtschaftlich bedeutenden Kulturen und für die Regeneration von transgenen Pflanzen3verbreitet. Zufällige Triebe können von Gewebe als Shooting Sprossapikalmeristem Meristem, wie Blätter, Wurzeln und Internodien induziert werden. Phytohormon Behandlung ist erforderlich für die Induktion von zufällige Aufnahmen in den meisten Pflanzenarten. Allerdings unterscheiden sich die optimale Konzentrationen und Kombinationen nach Arten und unter Gewebe als Explantaten verwendet. So geht viel Aufwand in der Bestimmung der optimalen Konzentrationen und Kombinationen von Phytohormonen für Experimente.

Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (Ipecac) ist eine Heilpflanze, die Alkaloide wie Emetine und Cephaeline, hauptsächlich in den Wurzeln4enthält. Wurzelextrakten dienen als schleimlösend, ein Brechmittel und eine Amoebicide5. Obwohl Ipecac natürlich in den tropischen Regenwäldern von Brasilien wächst, es ungern Samen in Kultur gesetzt, und die Keimrate verringert während der Lagerung der Samen in Japan mit seinen kälteren Klima6. Stattdessen ist es durch Gewebekultur fortgepflanzt, in denen zufällig schießen Formation auf Internodien ist die effizienteste Methode7,8. Interessanterweise können zufällige schießt in dieser Spezies ohne Phytohormon Behandlung8induziert werden.

Zufällige Triebe bilden sich auf der Epidermis in der apikalen Region der Internodien Segmente ohne callusing, aber nicht in den basalen Region9. Dieser Unterschied zeigt Gewebe Polarität in der Internodien Segmente, die wahrscheinlich unter phytohormonal Regelung. Das Ipecac-Kultur-System ermöglicht eine einzigartige Gelegenheit, Änderungen im endogenen Phytohormon Ebenen während zufällig schießen Bildung zu analysieren. Hier stellen wir unsere Methode für die Analyse der endogenen Ebenen ein Auxin (Indol-3-acetic Acid (IAA)) und vier CKs (Isopentenyl Adenin (iP), Isopentenyl Adenin Riboside (iPR), Trans-Zeatin (tZ) und Trans-Zeatin Riboside (tZR)) in Internodien Segmente durch den Einsatz von LC-MS/MS.

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Protokoll

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Hinweis: Ipecac (C. Ipecacuanha) wurde in dieser Studie verwendet, weil es die Analyse der endogenen Phytohormone erleichtert.

(1) Wachstumsbedingungen induzieren zufällige Triebe von Ipecac

  1. Bereiten Sie Phytohormon-freie B5 Medium bis pH 5,710eingestellt zu, und 0,2 % Gellan Gum. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren.
  2. Gießen Sie 25 mL des Mediums autoklaviert in eine sterile Petrischale (90 mm × 20 mm).
  3. 8 mm Internodien Segmente von Ipecac Pflänzchen mit einem chirurgischen Skalpell mit Klinge Nr. 22 auf eine sterile Acrylplatte, und auf dem Medium (Abbildung 1).
  4. Kultur auf Phytohormon-freie B5 Medium bei 24 ° C unter 15 µmol m−2 s−1 des Lichts in einem 14-h Licht/10-h dunklen Zyklus für 5 Wochen.
  5. Regionen zu identifizieren ich (apikalen) bis IV (basal) in jedem Segment (Abbildung 1B). Die Anzahl der zufällige Triebe > 0,3 mm Länge in den einzelnen Regionen unter dem Mikroskop einmal pro Woche.

(2) Extraktion und Reinigung von Phytohormonen

  1. Setzen Sie eine 5 mm Zirkonia Perle in jeder der vier 2-mL-Probenröhrchen.
  2. Schneiden Sie die Segmente in Regionen I bis IV (je 2 mm in der Länge) mit einem chirurgischen Skalpell auf eine sterile Acrylplatte.
  3. Sammeln Sie acht Segmente der einzelnen Regionen in separaten Probenröhrchen (10-30 mg Frischgewicht).
  4. Wiegen, und dann Einfrieren der Proben in flüssigem Stickstoff.
  5. Die gefrorenen Proben unter Verwendung einer Perle-basierte Homogenisator zu vernichten.
  6. Aussetzen der zerkleinerten Proben in 1 mL Acetonitril mit 500 Pg der einzelnen internen Standards von Auxin und CKs (d5-IAA, d5- tZ, d5- tZR, d6- iP, d6- iPR) mit einem Vortex-Mixer.
  7. Halten Sie bei 4 ° C für 1 h und Zentrifugieren bei 3.500 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
  8. Waschen Sie das Pellet in 80 % (V/V) Acetonitril mit Essigsäure 1 % (V/V). Zentrifuge wieder bei 3.500 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Kombinieren Sie die Überstände (aus Schritt 2.7 und 2.8) in einer Einweg-Glasröhre.
  9. Fügen Sie 600 µL Wasser mit 1 % (V/V) Essigsäure zu jeder kombinierten überstand und verdunsten das mit einer Vakuum-Konzentrator Acetonitril.
  10. Equilibrate hydrophilen lipophil-ausgewogen (HLB) Spalte Patronen durch die Anwendung von 1 mL Acetonitril, Methanol und Wasser mit 1 % (V/V) Essigsäure.
  11. Gelten Sie eine Beispiellösung pro äquilibriert HLB Patrone.
  12. Waschen Sie die Patronen mit 1 mL Wasser mit 1 % (V/V) Essigsäure.
  13. Eluieren Sie alle Hormone mit 2 mL 80 % (V/V) Acetonitril mit 1 % (V/V) Essigsäure in einer Glasröhre.
  14. Verdunsten Sie Acetonitril in das Eluat Extrakt in Wasser mit 1 % (V/V) Essigsäure mit einem Vakuum Konzentrator zu erhalten.
    Hinweis: Nicht trocken Sie dies vollständig.
  15. Equilibrate gemischt-Modus, starken Kationenaustausch (MCX) Spalte Patronen durch die Anwendung 1 mL Acetonitril, 1 mL Methanol, 0,5 mL 0,1 M HCl und 1 mL Wasser mit 1 % (V/V) Essigsäure.
  16. Gelten Sie eine Beispiellösung pro äquilibriert MCX Patrone.
  17. Waschen Sie die Patronen mit 1 mL Wasser mit 1 % (V/V) Essigsäure.
  18. Eluieren Sie IAA mit 2 mL 30 % (V/V) Acetonitril mit 1 % (V/V) Essigsäure in einer Glasröhre.
  19. Waschen Sie die Patronen mit 2 mL 80 % (V/V) Acetonitril mit Essigsäure 1 % (V/V).
  20. Waschen Sie die Patronen mit 2 mL Wasser und 1 mL Wasser, 5 % wässriger Ammoniak enthält.
  21. Die CKs mit 2 mL 60 % (V/V) Acetonitril mit 5 % wässriger Ammoniak in einer Glasröhre eluieren.
  22. Verdunstet das Lösungsmittel der einzelnen Hormon-Fraktionen mit einem Vakuum Konzentrator und Lagern bei-30 ° C bis die LC-MS/MS-Analyse.

(3) LC-MS/MS-Analyse der IAA und CKs

  1. Jedes Hormon-Extrakt in einem Rohr mit 600 µL Methanol auflösen und die Lösung zu einem Schraube Hals völligen Heilung Fläschchen zu übertragen. Verdunsten Sie das mit einer Vakuum-Konzentrator Lösungsmittel.
  2. Auflösen der IAA Bruch in 20 µL 30 % (V/V) Acetonitril und die CK-Brüche in 20 µL Wasser mit 1 % (V/V) Essigsäure in Schraube Hals völligen Heilung Fläschchen.
  3. Analysieren Sie die Proben im positiven Ionen-Modus auf eine Triple-Quadrupol-MS-System mit einer HPLC-Anlage ausgestattet.
    Hinweis: Wir legen die HPLC-Bedingungen, wie in Tabelle 1aufgeführt.
    1. Für die IAA Elution verwendet einen binären Gradienten von 5-50 % Lösungsmittel B mehr als 7 min, dann erhöhen durch 98 % Lösungsmittel B 1 min warten und dann für 2 min bei 5 % Lösungsmittel B durch Nest Injektion equilibrate.
    2. Für die CK-Elution verwendet eine binäre Gefälle von 2 % - 40 % Lösungsmittel B mehr als 5 min, 40-70 % Lösungsmittel B in 7 min, dann erhöhen, indem Sie 95 % Lösungsmittel B 1 min warten und dann für 2 min bei 2 % Lösungsmittel B durch equilibrate Injektion zu verschachteln.
    3. Festlegen die Elektrospray-Ionisation (ESI)-MS-Parameter der Ionenquelle wie in Tabelle 2aufgeführt.
  4. Verwenden Sie die mehrere Reaktion monitoring (MRM) Übergang zur Quantifizierung der einzelnen Analyten in Tabelle 3aufgeführten.
  5. Endogene IAA und CK-Ebene gegen eine Standardkurve des Verhältnisses der unbeschrifteten Deuterium-Label Standards zu quantifizieren.

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Ergebnisse

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1St Woche hatte keine zufällige Triebe gebildet. Bei der 2Nd Woche erschienen kleine Triebe. Die Anzahl der schießt auf die 3rd und 4th Wochen erhöhte meist in den apikalen Regionen (I und II) (Abb. 2A). Inder 5 Woche die Zahl der Triebe war etwa 7 in Region ich und 5 in Region II (Abbildung 2B). Im Gegensatz dazu bildeten sich nur ein paar T...

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Diskussion

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Ermittlung die Verteilung von Phytohormonen unbedingt beteiligt Organogenese verwenden Pflanzenmaterial in denen Organogenese auf Phytohormon-freies Medium beobachtet werden kann, weil wenn Phytohormone Explantaten zur Induktion exogen zugewiesen werden Triebe oder Wurzeln, beeinflussen sie das ganze Explant, macht es schwierig, die inhärente Plastizität der Pflanzen in Zell-Differenzierung und Organogenese zu bewerten. Zufällige Triebe können auf Phytohormon-freie Kulturmedien in andere Pflanzenarten wie Dianthus Ca...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

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Wir sind dankbar, Herr Akira Murakami der Abteilung für Angewandte Biowissenschaften, Toyo University und Herr Koudai Taniguchi Gunma Agricultural Technology Center für ihre technische Unterstützung. Wir sind auch Professor Shosaku Kashiwada und Dr. Uma Maheswari Rajagopalan, Toyo University für ihre Anregungen dankbar. Diese Studie wurde teilweise durch das Forschungszentrum für Leben und Umweltwissenschaften, Toyo University unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
[2H5]Indol-3-essigsäureOlchemlm Ltd031 1531Interner Standard für LC-MS/MS
[2H5]trans-zeatinOlchemlm Ltd030 0301Interner Standard für LC-MS/
MS[2H5]trans-Zeatin-RibosidOlchemlm Ltd030 0311Interner Standard für LC-MS/MS
[2H6]N6-isopentenyladeninOlchemlm Ltd030 0161Interner Standard für LC-MS/MS
[2H6]N6-isopentenyladenosinOlchemlm Ltd030 0171Interner Standard für LC-MS/
Wako098 00181Standard für LC-MS/MS
Trans-ZeatinSIGMA-ALDRICHZ0876 5MGStandard für LC-MS/MS
Trans-Zeatin-RibosidWako262 01081Standard für LC-MS/MS
N6-isopentenyl AdeninSIGMA-ALDRICHD7674 1GStandard für LC-MS/MS
N6-isopentenyl adenosinACROS ORGANICS22648 1000Standard für LC-MS/MS
Acetonitril hypergrade für LC-MS LiChrosolvMERCK1.00029.1000Lösungsmittel für LC-MS/MS
Wasser für die Chromatographie LiChrosolvMERCK1.15333.1000Lösungsmittel für LC-MS/MS
HPLCSHIMADZUProminence
MSSciex3200QTRAP
Oasis HLB 30 mg/1 ccWasserWAT094225Kartuschensäule
Oasis MCX 30 mg/1 ccWasser186000252Kartuschensäule
Schraubhals Fläschchen mit TotalrückgewinnungWasser186002805
blau, 12 x 32 mm Schraubverschluss und PTFE/Silikon-SeptumWasser
Acquity UPLC BEH C18, 2,1x100 mmWaters186002350UPLC Säule
Proshell 120 EC-C18, 2,1x50 mmAgilent699775-902UPLC Säule
DigitalmikroskopLeicaDHS1000
TissueLyser IIQIAGEN85300
Chirurgische KlingeFederNr. 22
SkalpellstielFeatherNo. 4
Savant SpeedVac/Gekühlte DampffalleThermo Fisher ScientificSPD111/RVT4104Vakuumkonzentrator
Einweg-Glasbehälter (13x100 mm)IWAKI9832-1310
Sterile PetrischaleINA OPTICAI-90-20
MS-Indol-3-essigsäure186000274

Referenzen

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  1. Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).
  2. Skoog, F., Miller, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).
  3. Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N. Transgenic plants and crops. Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. , CRC Press. Ch. 4 69-84 (2002).
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CytokininalyseLC MS MS Methodeadventive SprossbildungIpecac InternodialkulturPhytohormondynamikPflanzengewebekulturHormonquantifizierungGellan Gummi MediumVakuumkonzentrator

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