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Genomweiten RNAi-Screening, Host Faktoren zu identifizieren, die onkolytische Viren Therapie zu modulieren

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DOI:

10.3791/56913

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3. April 2018

 ,  ,  ,  , 
1Children's Hospital of Eastern Ontario (CHEO) Research Institute, 2Department of Biology, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 3Department of Pediatrics, University of Ottawa, 4Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll für den Einsatz von Hochdurchsatz-Screening der RNAi Host Ziele aufzudecken, die manipuliert werden können, um die onkolytische Viren Therapie zu verbessern, speziell Rhabodvirus und Vaccinia-Virus-Therapie, aber es kann leicht an andere onkolytische angepasst werden Virus-Plattformen oder für die Entdeckung von Host-Gene, die Replikation des Virus in der Regel zu modulieren.

Zusammenfassung

Hochdurchsatz-Screening-Technologie genomweiten RNAi (RNA-Interferenz) hat am meisten benutzt, für die Entdeckung von Host-Faktoren, die Replikation des Virus auswirken. Hier präsentieren wir die Anwendung dieser Technologie zur Aufdeckung Host-Ziele, die die Vermehrung des Virus Maraba, onkolytische Rhabdovirus und Vaccinia-Virus mit dem Ziel der Verbesserung der Therapie gezielt modulieren. Während das Protokoll für die Verwendung mit onkolytische Maraba und onkolytische Vaccinia-Virus getestet wurde, dieser Ansatz gilt für andere onkolytische Viren und kann auch zur Identifizierung von Host-Ziele, die Virusreplikation in Säugetierzellen in modulieren genutzt werden Allgemeine. Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung und Validierung eines Assays für Hochdurchsatz-Screening der RNAi in Säugerzellen, wichtige Überlegungen und vorbereitende Schritte für die Durchführung von einem primären Hochdurchsatz-RNAi-Bildschirm und eine schrittweise Anleitung für wichtig Durchführung von einem primären Hochdurchsatz-RNAi-Bildschirm; Darüber hinaus beschreibt es im großen und ganzen die Methoden für die Durchführung von Nebenbild Validierung und tertiären Validierungsstudien. Der Vorteil von Hochdurchsatz-RNAi-Screening ist, dass es erlaubt, in einer umfangreichen und unvoreingenommene Weise, Host Faktoren zu katalogisieren, die jeden Aspekt der Virusreplikation zu modulieren, wofür man einen in-vitro- Test wie Infektiosität, entwickeln kann, platzen Größe, und Zytotoxizität. Es hat die macht, unvorhergesehene biotherapeutischen Ziele basierend auf aktuellen Erkenntnissen zu entdecken.

Einleitung

Hochdurchsatz-genomweiten RNAi Screening erweist sich als ein wertvolles Instrument zur Aufdeckung biologischer Erkenntnisse in den verschiedensten Bereichen des Studiums einschließlich der Virus Biologie. In den vergangenen zehn Jahren haben sich zahlreiche Gruppen verpflichtet zellbasierte groß angelegte RNAi screening ausführlich Host Gene zu identifizieren, die Virusreplikation (bewertet in1,2,3,4 modulieren , 5 , 6 , 7). Interessanterweise wurden eine große Anzahl dieser Bildschirme in Krebszellen und mehrere mit Viren, die aktuellen onkolytische Viren einschließlich Vaccinia Virus8,9,10 kommen durchgeführt , Myxome Virus11, Herpes-Simplex-Virus12, vesikuläre Stomatitis Virus13,14und Maraba Virus15. Während die meisten dieser Studien auf Host Faktoren, die Einfluss auf einige Aspekte der Virusreplikation, zu bestimmen, und nicht auf die Identifizierung von biotherapeutischen Zielen für die Verbesserung der onkolytische Viren Therapie konzentrierte, konnte wertvolle Daten aus diesen Datensätzen in abgebaut werden diesem Zusammenhang. Es ist klar, dass das mächtige Potential Host Ziele zu identifizieren, die manipuliert werden können, um die onkolytische Viren Therapie zu verbessern nicht voll ausgeschöpft worden.

Eine Fülle von onkolytische Viren Plattformen sind derzeit in präklinischen und klinischen Studien einschließlich Herpes simplex Virus, wirtseigenen und Vaccinia-Virus, die nachweisbaren Erfolge in klinischen Studien hatten getestet. Für die meisten dieser Plattformen haben Anstrengungen gerichtet in Richtung verändern das Virus-Genom, Therapie zu verbessern. Zum Beispiel um Tumor-Spezifität zu erhöhen, wurden bestimmte Viren Gene gelöscht oder mutiert zur Virusreplikation in normalen Zellen, aber nicht in Tumorzellen erheblich einschränken. In einigen Fällen transgene hinzugekommen wie GM-CSF (Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierende Faktor), die Immunantwort zu potenzieren oder NIS (Natrium-Iodid-Symporter) in Vivo Bildgebung und zelluläre Radioiodide Aufnahme aktivieren für therapeutische Zwecke verwendet werden. Allerdings gab es sehr wenig Arbeit konzentrierte sich auf Host/Tumor-Gene zu manipulieren und Untersuchung der Auswirkungen von Host/Tumor-Gene auf die onkolytische Viren Replikation. Mit dem Aufkommen von Hochdurchsatz-Screening-Technologie, es ist nun möglich, Host-Virus Interaktionen im Maßstab des Genoms zu erforschen und zu entschlüsseln, Möglichkeiten zu manipulieren das Wirtsgenom um onkolytische Viren Therapie zu verbessern (überprüft in16, 17,18).

Wir berichteten das erste Studie zeigt Proof-of-Concept für die Verwendung von Hochdurchsatz-genetisches screening um Host Ziele zu identifizieren, die manipuliert werden könnte, um die onkolytische Viren Therapie zu verbessern. Um Host Gene zu entdecken, die modulieren, Maraba Virus Oncolysis, ein onkolytische Rhabdovirus derzeit getestet in Phase I und II-Studien, haben wir durchgeführt genomweiten RNAi-Screens über drei verschiedene Tumorzelllinien in zweifacher Ausfertigung mit einem SiRNA (kurze RNA stören) Bibliothek für 18.120 Gene15. Pathway Analyse der Zugriffe auf den Bildschirmen identifiziert offenbart Bereicherung der Mitglieder des ER (endoplasmatische Retikulum) Stress Reaktion Wege. Wir haben 10 Treffer innerhalb dieser Wege für die sekundäre Validierung mithilfe SiRNA mit verschiedenen targeting Sequenzen von denen auf dem primären Bildschirm. Im Rahmen der tertiären Validierung, führten wir eine Rettungs-Experiment mit IRE1α (Inositol-erfordern Enzym 1 Alpha) zu bestätigen, dass der Hit war. In Vitro und in Vivo Tests mit einem niedermolekularer Inhibitor des IRE1α führte zu dramatisch verbesserte onkolytische Wirksamkeit.

Workenhe Et al. 12 auch durchgeführt einen genomweiten RNAi-Bildschirm mit einer gepoolten Lentivirale ShRNA (kurze Hairpin RNA) Bibliothek targeting 16.056 Gene Ermittlung Host Faktoren beschränken die menschliche Herpes-Simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) mutierte KM100-vermittelten Oncolysis Brust Krebszellen. In den Primärbildschirm identifiziert sie 343 Gene den Zuschlag führen zu verstärkten Zytotoxizität KM100-infizierten Zellen über Mock-infizierten Zellen; 24 dieser Gene für die sekundäre Validierung ausgewählt. Aus den 24 Gene wurden 8 Gene auf dem sekundären Bildschirm mit einem von ihnen bestätigt wird SRSF2 (Serin/Arginin-Rich Spleißen Faktor 2) anschließend mit einer genetischen Rettungs-Experiment während der tertiären Validierung bestätigt wurde. Die Gruppe fuhr fort, um einen DNA-Topoisomerase-Hemmer chemotherapeutischen zu identifizieren, der die Phosphorylierung des SRSF2 reduziert und zeigte, dass die Kombinationsbehandlung von HSV-1 KM100 mit dieser Hemmstoff führen zu längeren Überleben der TUBO Tumor-tragenden Mäusen.

In den genannten Studien folgte ein ähnlicher Workflow. Jeder begann mit einer genomweiten RNAi Primärbildschirm gefolgt von einem sekundären Bildschirm auf eine ausgewählte Anzahl von Treffern in den Primärbildschirm identifiziert. Dies wurde gefolgt von tertiären Validierungsstudien, die bestätigt, dass der Treffer auf Ziel war durch die Durchführung genetischer Experimente in Vitro mit ultimativen Validierung durchgeführt durch die Manipulation der Ziel-gen Produkt in Vivozu retten. In diesem Artikel bieten wir zunächst ein allgemeines Protokoll für die Entwicklung und Validierung eines Hochdurchsatz-SiRNA-Screening-Assays, die umfasst die Bestimmung der optimalen Transfektion Bedingungen, Höhe des Virus und die Länge der Infektion. Wir bieten auch einem detaillierten Protokoll für die Durchführung von einem primären, einem Hochdurchsatz-SiRNA-Bildschirm sowie eine allgemeine Beschreibung des Verfahrens zur Durchführung von Nebenbild Validierung und tertiären Validierung.

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Protokoll

(1) Entwicklung und Validierung einer Hochdurchsatz-SiRNA screening assay

Hinweis: Verwenden Sie für alle Experimente Hepes gepufferten Wachstumsmedium für jede Zelllinie geeignet. Siehe Abbildung 1 für einen Überblick über den Workflow von der Assay-Optimierung tertiären Validierung.

  1. Festlegung der optimalen Transfektion Bedingungen
    1. Wählen Sie eine Tumor-Zell-Linie oder im Idealfall mehrere Tumorzellen Linien zur Transfektion Bedingungen (z.B. 786-O, NCI-H226, SF268, U373, OVCAR-8, U20S; siehe Diskussion nähere Informationen über die Auswahl der Zelllinien) zu optimieren.
    2. Wählen Sie eine Transfektion Reagenz oder mehrere zu testen. Es möglicherweise notwendig, mehrere Transfektion Reagenzien zu testen einige giftige oder effizienter als andere in einer bestimmten Zelle Linie möglicherweise. Auch, denken Sie daran, dass einige möglicherweise auf Virenbefall Auswirkungen oder hohe Hintergrundsignal auf Bildgebung generieren kann.
    3. Entscheiden Sie sich für Positive [e. g. SiRNA targeting PLK-1(Polo Like Kinase 1) mRNA, die induziert Zelltod] und negative Transfektion Steuerelemente (z.B. nicht-targeting SiRNA).
    4. Folgen Sie das umgekehrte Transfektion Protokoll für das besondere Transfection Reagens, aber variieren Sie die Menge von Transfection Reagens (z. B. 0,05, 0,1, 0,15 bis 0,2 μl/Well) und Zelle Aussaat dichten (z.B. 625, 1250, 2500 Zellen/gut). Wiederholungen der folgenden Bedingungen sind: unbehandelt Zellen, mock transfizierten Zellen (d. h. Zellen plus Transfection Reagens), und mit positiven und negativen Transfektion Kontrolle SiRNA transfiziert (siehe Abb. 2A für eine Probenteller (Layout).
      1. 80 nM Verdünnungen von jedem SiRNA vorbereiten in der Regel eine Endkonzentration im Brunnen von 10 nM (je nach Bibliothek, kann eine höhere Konzentration von SiRNA erforderlich sein). Sofern nicht anders angegeben, verdünnen Sie die SiRNA mit Transfection Reagens Verdünnungsmittel. Verdünnungen von Transfection Reagens vorzubereiten.
      2. Pipettieren 5 μL von SiRNA pro Bohrloch gefolgt von 5 μL verdünnt Transfection Reagens. Um diesen Schritt zu erleichtern, entlang einer Spalte mit einer U-Boden-96-Well-Platte, die SiRNA-Mixe und die SiRNA Verdünnungsmittel allein (für unbehandelte und mock-transfizierten Zellen) zu verteilen. Verteilen Sie entlang einer zweiten Spalte, die verdünnten Transfection Reagens und Transfection Reagens Verdünnungsmittel allein (für unbehandelten Zellen).
        1. Mit einem elektronischen pipettieren, Pipettieren 5 μl/Well von den Inhalt der ersten Spalte mit SiRNA oder SiRNA Verdünnungsmittel in die entsprechenden Vertiefungen von 384-Well-Platte gefolgt von 5 μl/Well des verdünnten Transfection Reagens oder Transfection Reagens Verdünnungsmittel aus der zweiten Spalte.
      3. Zentrifugieren Sie die Platten bei 1026 X g für 1 min bei Raumtemperatur, und die Zeit für die Transfektion Reagenz vorgeschriebenen inkubieren (z.B. 5-20 min).
      4. Während die Platten Inkubation sind, bereiten Sie Zellsuspensionen unterschiedlicher Dichte. Pipettieren 30 μl Zellsuspension pro Bohrloch. Lassen Sie bevor die Platten im Inkubator platziert die Platten sitzen für 45-60 min bei Raumtemperatur für die einheitliche Abrechnung von Zellen19zu ermöglichen.
        Hinweis: Wenn die Inkubationszeit für die Transfektion Reagenz mit SiRNA vorgeschriebenen kurz ist, bereiten Sie die Zellsuspensionen vor der Inkubation.
      5. Inkubieren Sie für 48 bis 72 h abhängig von der gewünschten Länge der Zuschlag für den Bildschirm gewählt.
    5. Bereiten Sie eine Befestigung und Färbelösung bestehend aus Formaldehyd, Hoechst 33342 und PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) für eine Endkonzentration von 4 % Formaldehyd und 5 Ug/mL Hoechst 33342 in jede Vertiefung. Bei Bedarf versuchen Sie eine höhere (z.B. 7,5 Ug/mL) oder niedriger Konzentration (z.B. 2 Ug/mL) von Hoechst ist das Signal zu schwach oder zu stark, beziehungsweise.
    6. 30 μl der Fixierung und Färbung Lösung direkt in alle Vertiefungen zu verzichten. Inkubieren Sie die Platten für 30 min bei 37 ° c Speichern Sie die Platten bei 4 ° C. Wenn ein nicht-confocal Mikroskop verwenden, waschen Sie die Platten mit PBS mit einer Platte Scheibe; in den meisten Fällen erübrigt sich waschen, wenn ein confocal Mikroskop verwenden.
    7. Entwickeln Sie ein Skript, um die Anzahl der Zellen pro Bohrloch zu quantifizieren.
      Hinweis: Es stehen mehrere Software-Suites für diesen Zweck und während jeder verschiedene Möglichkeiten der Generierung von Skripts haben, sie haben alles im Allgemeinen Mittel zur Identifizierung von Kernen, Zellen und Regionen von Interesse, sowie die Berechnung der Intensitäten und morphologische Eigenschaften. Wenn ein Screening-Skript entwickeln, ist es wichtig zu überlegen, den Zeitaufwand zum Ausführen des Skripts pro Platte und vielleicht einzige wesentliche Messungen um Verarbeitungszeit zu minimieren. Beispielsweise könnte eine Quantifizierung der Zellzahl Bereich Hoechst pro Bohrloch oberhalb einer bestimmten Intensität berechnen; und um die Ausbreitung des Virus zu quantifizieren, könnte man berechnen Sie die GFP (grün fluoreszierendes Protein) Fläche pro Bohrloch oberhalb einer bestimmten Intensität. Die "abgespeckte" Skript müssen verglichen werden, um die aufwändigere Skript um sicherzustellen, dass keine wichtige Information verloren geht.
    8. Analysieren Sie die Ergebnisse, um die optimale Transfektion Bedingungen, das ist Transfection Reagens Betrag und die Zelle Aussaat Dichte, das führt zu erheblichen Zelltod (0-30 % Überleben der Zellen) und minimal toxisch auf die Zellen (z.B. 90-100 % Überleben der Zellen). Hinweis: Es dauert länger, die Zelle Tod Phänotyp in Zelllinien mit lange Verdoppelung Mal zu beobachten. Abbildung 2 b und 2 C für repräsentative Ergebnisse zu sehen. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Zellen mit SiRNA-targeting transfiziert ca. 90-100 % Zusammenfluss zum Zeitpunkt der Fixierung, da später eine Zellen infizieren, die von diesem Konfluenz sind wollen.
  2. Bestimmung der optimalen Menge an Viren und Länge der Infektion
    1. Führen Sie dieselben Schritte rückwärts Transfektion, wie beschrieben (siehe 1.1.4.1, 1.1.4.4); jedoch nur die optimalen Transfektion Bedingungen (siehe 1.1.8) verwenden (z.B. für 786-O Zellen: 1500 Zellen/gut und 0,05 μL/gut von RNAiMAX) und darüber hinaus sind zusätzliche Brunnen mit [z.B. Brunnen mit unbehandelten Zellen, mock-Virus infiziert ist transfizierten Zellen transfected Zellen mit nicht-targeting SiRNA und Zellen mit positiven Virus Steuerelemente transfiziert, wenn diejenigen bekannt sind (d. h. SiRNA Ausrichtung auf Host-Gene, die hemmen oder Replikation verbessern)].
      1. Siehe Abbildung 3A für eine Beispielanlage Platte. 48-72 h inkubieren.
    2. Infizieren Sie weitere Virus-Brunnen mit ein onkolytische Viren mit dem Ausdruck eines fluoreszierenden Reporter-Proteins (z. B. GFP) mit einer Reihe von Mannigfaltigkeiten der Infektion (MOIs) (z.B. 0,001 bis 10; Die Palette gewählt werden hängt das Niveau des Widerstands oder Anfälligkeit der Zelllinie.). Gehören Sie nicht infizierte Brunnen sowie. Pipettieren 40 μL jeder Virus Verdünnungsgrad pro Bohrloch für ein Endvolumen von 80 μl. Zentrifugieren Sie jede Platte 400 X g für 30 min bei Raumtemperatur.
    3. Folgende Infektion, Bild, die Zellen mit einem hohen Gehalt Leben, automatisierte Mikroskop in regelmäßigen Abständen (z.B. alle 4-8 h). Siehe Abb. 3 b und 3 C.
    4. Entwickeln Sie ein Skript zur Quantifizierung der Virus verbreitet (z. B. GFP Bereich pro Well) (s. 1.1.7). Analysieren Sie die Bilder und wählen Sie einen Zeitpunkt und einer MOI, die für den Nachweis von zu- und Abnahmen in Ausbreitung zu ermöglichen. Gewährleisten Sie die Zeit-Punkt und MOI fallen in einem linearen Bereich, Erkennung von kleinen Veränderungen in der Verbreitung zu erleichtern. Schätzen Sie den Z-Faktor (oder Z') für den gegebenen Zeitpunkt und MOI.
      Hinweis: Geschätzte Z-Faktor = 1-3 (σp + σn) / | μp- μn|, wo σp die Standardabweichung der Stichprobe der positiven Virus Steuerelemente ist und σn die Standardabweichung der Stichprobe des negativen Virus ist Kontrollen; und μp wird der Stichprobe-Mittelwert der positiven Virus Steuerelemente und μn der Stichprobe-Mittelwert von den Negativkontrollen. Eine geschätzte Z-Faktor von 0,5 - ist 1.0 als eine ausgezeichnete Assay und geeignet für das screening von20,21.
    5. Bestätigen Sie, dass die negativen Virus Control SiRNA keinen Einfluss auf die Virusreplikation durch den Vergleich mit der mock transfizierten und unbehandelten Brunnen. Es ist oft notwendig, mehrere Negativkontrollen als einige negative SiRNA zu testen, die Kontrollen auf die Virusreplikation auswirken können.
  3. Zur Validierung von Hochdurchsatz-Screening-Test
    1. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.1 und 1.2.2 oben, aber nur diese Zeit infizieren Zellen mit der optimalen MOI. Statt live Imaging, beheben und Flecken auf die Platte (wie unter 1.1.5 und 1.1.6) bei der optimalen Zeitpunkt (siehe 1.2.4).
    2. Bild der Platte. Analysieren Sie die Ergebnisse mit dem gleichen Skript, die für den Bildschirm verwendet werden (siehe 1.1.7 und 1.2.4). Bestätigen Sie die Transfektion Bedingungen (d.h. gute Zuschlag in Brunnen mit positiven Transfektion Kontroll- und minimale Toxizität in Brunnen mit negativen Transfektion Kontrolle transfiziert transfiziert). Schätzen Sie den Z-Faktor um die Robustheit des Assays zu bestimmen (vgl. 1.2.4).
  4. Weitere Tests und Überlegungen für die Durchführung von Hochdurchsatz-screening
    1. Testen Sie die Haltbarkeit der Mikrotiter-Platten, wie einige Platten bei der Zentrifugation, knacken können, vor allem, wenn der Deckel gehalten werden und mehrere Platten auf einmal zentrifugiert werden. Rissbildung reduzieren, ohne den Deckel Zentrifugieren (zur Verfügung gestellt die Platten haben Dichtungen), oder verringern Sie die Anzahl der Platten pro Eimer zentrifugiert.
    2. Testen Sie die Stabilität des Transfection Reagens Mix im Laufe der Zeit. Sobald die Platten die Transfektion Reagenz hinzugefügt wird, möglicherweise eine erhebliche Verzögerung vor der Zugabe von Zellen; Daher ist es wichtig, den Zeitraum für die Transfektion Reagenz Mischung wirksam bleibt. Für den Bildschirm ist die Zellen im Vorfeld die Platten die Transfection Reagens Mischung hinzufügen vorbereiten erforderlich.
    3. Hinweise zur Verwendung des liquiden Dispensers. Bestimmen Sie die Volumes, die erforderlich, um Transfection Reagens, Zellen, Viren zu verzichten, und beheben Sie unter Berücksichtigung der Band, dass hält die Schläuche das Volumen verloren, vor Abgabe (wenn das Gerät diese Funktion hat) und das Restvolumen in den Flaschen für erforderlich der Verzicht auf.
      1. Stellen Sie ein und testen Sie die Programme, die für die Abgabe von Transfection Reagens, Zellen und Viren verwendet werden. Um den Verlust von Transfection Reagens zu minimieren, vorab verzichtet zu begrenzen, wenn möglich, die Anzahl der. Ein Protokoll für die Kalibrierung des liquiden Dispensers und testen die Genauigkeit und Präzision zu etablieren.
    4. Bereiten Sie für die Bulk-Abgabe von Transfection Reagens, Zellen und Viren
      1. Zuerst bestimmen Sie die Anzahl der Platten in einem Batch in Anbetracht der Anzahl der Platten der Zellen, die praktisch auf einmal trypsinized können verarbeitet werden, die Anzahl der Mikrotiter-Platten kann zentrifugiert auf einmal die Länge der Zeit benötigt, um einen Stapel von verarbeiten Platten mit liquid Dispenser und auch der Zeitaufwand für die Bildgebung. Hinweis: In der Regel ca. 30 Platten gleichzeitig die Verarbeitung ist durchaus machbar und Verarbeitung 3 Chargen der Platten ist überschaubar an einem Tag.
      2. Empirisch überprüfen Sie die Lautstärke des Transfection Reagens benötigt, um einen Stapel von Platten zu verarbeiten. Testen Sie die dieses Volumen durch Abgabe 5 μl destilliertes Wasser mehrmals über eine Platte die entsprechende Anzahl von Zeiten, die benötigt werden ausreicht, um einen Stapel zu verarbeiten.
      3. Um die gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten, schätzen Sie die notwendige Zeit, um Zellen in einem Stapel von Platten zu verzichten. Bereiten Sie eine Flasche mit dem Volumen der Zellen erforderlich für eine Charge und die Zellen in mehrere Spalten aus einer Platte zu einem Zeitpunkt zu verzichten, in regelmäßigen Abständen über die gleiche Zeit dauert um über einen Stapel von Platten zu verzichten. Testen Sie, wie oft es notwendig, mischen Sie die Zellen, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen aufrechterhalten werden.
      4. Um die gleichmäßige Verteilung der Virus sicherzustellen, wiederholen Sie das gleiche Verfahren wie oben (siehe 1.4.4.3), aber dieses Mal Verzicht auf Virus auf konfluierende Brunnen. Wenn der Virus nicht gleichmäßig verteilt ist, betrachten Sie bereitet dem Virus in konischen Rohren und vortexen jedes Röhrchen vor der Abgabe.
    5. Verfolgen Sie das Wachstum von Zellen zu bestimmen, die Zeitleiste für den Anbau von genügend Zellen für den Bildschirm. Darüber hinaus bestimmen Sie die durchschnittliche Anzahl von Zellen, die pro Platte von Zellen wachsen in Log-Phase um die Nummer für den Bildschirm abschätzen zu können geerntet werden kann.
  5. Endgültige Vorbereitungsschritte für Hochdurchsatz-screening
    1. Bis zu einem Monat vor Beginn der Vorführung, bestimmen Sie alle notwendigen Materialien für den Bildschirm. Bestellen Sie alle erforderlichen Reagenzien (siehe Material). Sicherzustellen, dass die erforderliche Menge des Virus auf Seite (vorzugsweise verwenden den gleichen bestand, die während der Optimierung verwendet wurde.).
    2. Bis zu zwei Wochen vor Beginn der Vorführung, tauen Sie auf und wachsen Sie die Zellen für den Bildschirm benötigt. Sicherstellung der Verfügbarkeit der Zentrifuge und quadratischen Zentrifuge Eimer.
    3. Während der Woche vor Beginn der Vorführung, bereiten Medien Flaschen auf die umgekehrte Transfektion und Infektion, einen Bestand von 70 % Ethanol, 2 X Transfection Reagens Verdünnungsmittel (z.B. 2 X Opti-MEM), wenn nötig (z. B. wenn die SiRNA-Bibliothek in verdünnt wird RNase-free Wasser, eine 2 X verwenden, um Zellen zu transfizieren wollen), und Aliquote des Virus (einer pro Stapel von Platten). Überprüfen Sie den Zustand der Zellen.
      1. Bereiten Sie eine Stammlösung von Hoechst 33342-Fleck (z.B. 5 mg/mL). Bereiten Sie eine Ausgleichsplatte, wenn man für Zentrifugieren benötigt werden.
      2. Stellen Sie sicher, dass die Platte Scheibe in einwandfreiem Zustand ist, wenn es verwendet wird. Sicherstellen Sie, dass der flüssige Spender richtig kalibriert und Dosierung genau und präzise ist. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Programme auf dem flüssigen Spender korrekt eingestellt sind.

2. Durchführung der primären Hochdurchsatz-Bildschirm

Hinweis: Vor Beginn der RNAi-Bildschirm, Mikrotiter-Platten (z. B. 384-Well-Platten) müssen mit den SiRNA-Bibliothek und Screening Kontrollen angeordnet werden. Die folgenden Schritte werden am besten von zwei Personen mit einer Person (d. h. Person A) wird in erster Linie verantwortlich für die Abgabe der Transfektion Reagenz und Zellen über die Platten und die zweite Person (z. B. Person B) ist verantwortlich für durchgeführt. Zentrifugieren die Platten unmittelbar vor Transfektion und zur Vorbereitung auf der Zellen. In Klammern enthalten sind einige Besonderheiten für die Verarbeitung einer Charge von 33 Platten (d. h. die Hälfte der Bibliothek) mit 786-O-Zelllinie.

  1. Vorbereitung zur umgekehrten Transfektion
    1. Person A: Legen Sie genügend Medien, Trypsin und PBS notwendig, ein Stapel von Platten in einem 37 ° C Wasserbad zu verarbeiten. Optional: Trypsinize eine Platte von Zellen, und die Anzahl der Zellen pro Platte um eine Echtzeit-Schätzung der Anzahl der Platten pro Batch zu bieten.
    2. Erhalten Sie einen Stapel von Platten (z.B. 33 Platten) aus der Tiefkühltruhe und warten Sie 20-30 min um die Platten zum Auftauen lassen. Während die Platten Auftauen sind, mit den folgenden Schritten fortfahren.
      1. Person A: Pipettieren in 50 mL konische Röhrchen die Menge an Transfection Reagens Verdünnungsmittel für die Bearbeitung einer Charge der Platten notwendig (z.B. 2 x 37.125 mL) und legen Sie sie in ein Wasserbad von 37 ° C. Füllen Sie zwei Flaschen mit 70 % igem Ethanol (z.B. 250-500 mL-Flaschen). Füllen Sie zwei 50 mL konische Röhrchen mit PBS und eine mit destilliertem Wasser.
      2. Person A: Tauchen Sie die liquiden Dispenser Schlauch in eine Flasche von 70 % Ethanol. Wenn alle Tipps nicht verwendet werden für die Abgabe der Transfektion Reagenz (z. B. wenn die äußere Vertiefungen der Platte nicht verwendet werden), lösen Sie zuerst die unnötigen Schläuche. Legen Sie ein Stück Klebeband um den Schläuche anlässlich den Punkt, unterhalb, den die Schläuche steril angesehen werden kann. Grundieren Sie mit ca. 25 mL. Gießen Sie zusätzliche Ethanol in der Flasche, die verlorene Volumen zu ersetzen. Lassen Sie den Schlauch in Ethanol für mindestens 5 Minuten sitzen.
      3. Person B: Prepare to Zellen trypsinize. Sprühen Sie die Gewebekultur (TC) Kapuze mit 70 % Ethanol. Sprühen und die notwendigen Mehrkanalpipette, Tipps, Flaschen und Microfuge Rohre für die Zubereitung von Zellen in der Haube (siehe 2.2.1.1 und 2.2.1.2). Zentrifugieren Sie die versiegelten Platten in Sätzen 1026 X g für 2 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Deckel von den Platten in einer TC-Haube, wenn zuvor festgestellt, dass die Platten bei der Zentrifugation knacken können, wenn die Deckel (siehe 1.4.1) gehalten werden.
    3. Person A: Entfernen Sie die Dichtungen von den Platten. Vor, während oder nach der Dichtungen wurden entfernt (abhängig von der Länge der Ausbrütung erforderlich), die erforderliche Menge an Transfection Reagens (z.B. 375 μL/Rohr für eine Endkonzentration von 0,05 μl RNAiMAX/Brunnen) in die konische Röhrchen pipettieren Das vorgewärmte Transfection Reagens Verdünnungsmittel (z.B. 37.125 mL/Tube) enthält.
    4. Mischen Sie, indem Sie nach oben und unten 10 Mal pipettieren. Die Zeit für die Transfektion Reagenz verwendet wird (z.B. 0-10 min.) bei Raumtemperatur inkubieren.
  2. Umgekehrte Transfektion
    1. Haben Sie Person B die folgenden Aufgaben durchgeführt.
      1. Begin trypsinizing Zellen (z. B. 3 Platten von 786-O Zellen). Aspirieren Sie die Medien aus jeder Platte. Spülen mit 9 mL PBS. Pipettieren 3 mL Trypsin pro Platte. Inkubation bei 37 ° C für ca. 5 min. Aufschwemmen der Zellen mit 22 mL Medien. Pipettieren nach oben und unten 10 Mal.
      2. Kombinieren Sie die Zellsuspension aus jeder Gewebekultur-Platte in eine sterile Flasche. Mischen Sie die Zellsuspension durch invertieren. Pipettieren 1 mL Aliquote die Zellsuspension in zwei separaten Microfuge Röhren. Jedes Microfuge Rohr eine Probe entnehmen und die Zellen zu zählen. Berechnen Sie das Volumen der Zellsuspension erforderlich für die Dichte erforderlich (z.B. 1500 Zellen/gut), und bereiten Sie genügend verdünnter Zellsuspension (z.B. 500 mL) in einem Stapel von Platten zu verzichten.
    2. Haben Sie Person eine der folgenden Aufgaben parallel zur Person B.
      1. Leeren Sie den liquiden Dispenser von Ethanol Schläuche. Den Schlauch mit ca. 25 mL PBS Prime, und leeren Sie den Schlauch. Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit des Schlauch um sicherzustellen, dass im Abschnitt der Schlauch unter dem Klebeband, das in Transfection Reagens eingetaucht werden und später in der Zellsuspension steril gehalten. Zeichnen Sie aus Platten, die mit einem konischen Rohr der Transfektion Reagenzlösung sicher durchgeführt werden können.
      2. Pipettieren der Transfektion Reagenzlösungen nach oben und unten 10 Mal. Grundieren Sie den Schlauch mit der Transfektion Reagenzlösung. Um den Verlust von Transfection Reagens zu minimieren, prime mit gerade genug Lösung um die Spitzen kaum zu löschen. Wählen Sie das richtige Programm auf dem flüssigen Spender und verzichten Sie 5 μl Transfection Reagens pro Bohrloch zu.
        Achtung: Verfolgen Sie das Niveau des Transfection Reagens aufmerksam, so dass sie wieder aufgefüllt wird, bevor es abläuft. Die Fertigstellung der Platten, die sind Satz auseinander soll ein Stichwort um mehr Transfection Reagenzlösung hinzuzufügen.
      3. Zentrifugieren Sie die Platten bei 1026 X g für 1 min bei Raumtemperatur. Diesmal werden die Deckel auf, so dass es möglicherweise erforderlich, weniger Platten gleichzeitig, um zu verhindern, dass Risse (z.B. 2 Platten pro Eimer) zentrifugieren. Die vorgeschriebenen für Transfection Reagens verwendet werden die Platten bei Raumtemperatur inkubieren (z.B. 10-20 min).
      4. Während der Inkubation leeren Sie den Schlauch von der Transfektion Reagenzlösung, und legen Sie es in eine volle 50 mL konische Röhrchen mit PBS. Spülen Sie den Schlauch mit ca. 25 mL PBS durch Priming und entleeren.
        1. Wenn mehr Tipps zur Abgabe von Zellen als dienten zur Abgabe Transfection Reagens verwendet werden wollen, befestigen Sie die nicht verwendete Schläuche und resterilisieren alle Schläuche mit 70 % Ethanol vor dem Spülen des Schlauch mit PBS (vgl. 2.1.2.2).
      5. Mischen Sie die Flasche mit der Zellsuspension, sobald es erstellt wurde. Legen Sie den Schlauch in die Zellsuspension und prime genug zu sehen, dass jeder Tipp richtig dosieren ist. 30 μL pro Well die Zellsuspension über alle Platten zu verzichten. Falls erforderlich, mischen Sie die Zellsuspension in regelmäßigen Abständen zur Beilegung zu vermeiden.
        Achtung: Manchmal können Tröpfchen der Suspension mit Medien zu den Seiten der Tipps haften. Wenn dies beachtet wird, so bald wie möglich abzusaugen Sie oder wischen Sie mit einem fusselfreien Tuch in 70 % igem Ethanol übergossen.
      6. Leeren Sie den Schlauch von der Zellsuspension. Spülen Sie den Schlauch mit ca. 25 mL PBS, gefolgt von ca. 50 mL destilliertem Wasser.
    3. Lassen Sie die Platten, für 45-60 Minuten ab dem Zeitpunkt der Zelle Aussaat bei Raumtemperatur vor der Rückkehr der Platten in den Inkubator zu sitzen. Die Platten in einem ungestörten Inkubator für die gewünschte Länge der Gen-Silencing-(z. B. 48 h) inkubieren (siehe 1.1.4.5).
  3. Infektion
    1. Zeitersparnis, am Tag vor der Zellen zu infizieren Pipettieren in sterile Flaschen die genaue Höhe der Medien erforderlich, jede Charge der Platten einschließlich Medien für nicht infizierte Brunnen zu infizieren (z.B. 2 x 350 mL und 2 x 50 mL für 33 Platten). Darüber hinaus liquiden Dispenser für Präzision und Genauigkeit zu testen, und bei Bedarf neu zu kalibrieren.
    2. Die Medien bei 37 ° c warm Füllen Sie zwei Flaschen mit 70 % Ethanol, zwei 50 mL konische Röhrchen mit PBS und eine mit destilliertem Wasser. Überprüfen Sie die Zentrifuge bei Raumtemperatur.
    3. Sterilisieren Sie die Schläuche mit 70 % Ethanol, und Spülen mit PBS wie zuvor beschrieben (siehe 2.1.2.2 und 2.2.2.1). Während das Rohr in das Ethanol sitzt, Pipettieren das genaue Volumen des Virus in die Flasche mit den Medien zuvor erforderlich vorbereitet für Infektion (siehe 2.3.1). Spülen Sie den Schlauch mit PBS durch Grundieren mit 25 mL und dann entleeren.
    4. Entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und legen Sie sie in die TC-Haube. Grundieren Sie die Schläuche mit den Medien. 40 μl der Medien in die nicht infizierten Kontroll-Vertiefungen zu verzichten. Das Rohr der Medien zu entleeren und Spülen mit 25 mL PBS. (siehe 2.2.2.5 Vorsicht)
    5. Nach dem Mischen der Virus, legen Sie den Schlauch in die Flasche mit dem Virus. 40 µl des Virus über die Platten zu verzichten. Zentrifugieren Sie die Platten für 30 min bei 400 X g bei Raumtemperatur. Die Platten in den Inkubator zurück. Die Platten für die vorher festgelegte Zeitspanne (z.B. 24 h) inkubieren (siehe 1.2.4).
  4. Fixierung und Färbung der Zellen
    1. Zeitersparnis, am Tag vor der Befestigung, bereiten Sie eine Flasche von Fixierung und Färbung Lösung mit Formaldehyd und PBS (z. B. 179 mL 37 % Formaldehyd und 270 mL PBS für eine Endkonzentration von 4 % Formaldehyd) für jede Partie der Platten, aber auslassen der Hoechst-Fleck. In der brennbaren Kabinett lichtgeschützt aufbewahren.
    2. Spülen Sie den Schlauch mit 70 % Ethanol und PBS wie zuvor beschrieben (siehe 2.1.2.2 und 2.2.2.1). Fügen Sie die gewünschte Lautstärke von Hoechst (zB. 2,5 mL von 5 mg/mL Hoechst für eine Endkonzentration im Brunnen von 7,5 μg/mL), die Fixierung und Färbung der Lösung und Mix.
    3. 30 μl von Fixierung und Färbung Lösung über die Platten zu verzichten. Legen Sie die Platten in den Inkubator für 30 min. Gelten Sie nach Inkubation die Dichtungen an den Platten und aufbewahren Sie die Platten bei 4° C, vor Licht geschützt. Die Platten zu waschen, wenn nötig (siehe 1.1.6).
  5. Bildverarbeitung und Bildanalyse
    1. Die Platten mit einem automatisierten, hoch-Inhalt Mikroskop Bild. Verwenden Sie die zuvor festgelegten Einstellungen, aber testen Sie zuerst die Einstellungen, um sicherzustellen, dass keine Anpassungen vorgenommen werden müssen.
    2. Quantifizieren der GFP (oder andere fluoreszierende Reporter) und Hoechst Bereich pro auch mit dem bisher entwickelten Skript (siehe 1.3.2). Testen Sie das Skript mit einer Handvoll Platten zuerst zu bestimmen, ob geringfügigen Änderungen vor Batch Analyse aller Platten vorgenommen werden müssen.
    3. Treffer zu identifizieren. Hinweis: Die robuste Z-Score/MAD (mittlere absolute Abweichung) Methode ist eine Methode, die häufig zu diesem Zweck verwendet wird. In der Regel Resultate von > 2 oder <-2 als Trenngrenzen festgelegt werden. Diese Methode ist am besten verwendet, wenn die SiRNA-Proben sind nach dem Zufallsprinzip auf die Platten verteilt und nicht, z. B. nach Funktion gruppiert, da die Proben als de-facto Negativkontrollen eingesetzt werden. Zytotoxischen SiRNAS ausfiltern Sie her, wie diese zu erwarten wäre, unspezifisch Virus verbreitet (siehe Diskussion weitere Einzelheiten zur zytotoxischen Treffer herausfiltern) zu verringern.

(3) Nebenbild Validierung von Treffern mit der TRC (RNAi-Konsortium) ShRNA-Bibliothek

Hinweis: Weitere Informationen zum Auswählen von Treffer zu sekundären Validierung und screening-Technologien möglich Diskussion. Wenn SiRNA-Technologie für sekundäre Validierung ausgewählt wird, kann das gleiche Assay-Entwicklung und Validierung-Protokoll verwendet werden, wie für den Primärbildschirm verwendet wurde (siehe 1).

  1. Erhalten Sie eine benutzerdefinierte TRC ShRNA Bibliothek Ausrichtung der Kandidatengene von Interesse wie Glycerin Aktien.
  2. Bereiten Sie Transfektion Qualität Plasmid-DNA aus den Beständen von Glycerin. Hinweis: Ein detailliertes Protokoll (d. h. "ShRNA/SgRNA/ORF Glycerin und Plasmid DNA-Vorbereitung") finden Sie hier: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
  3. Produzieren Sie mit dem Ausdruck ShRNA gezielt Gene von Interesse mit der DNA Plasmide Lentiviren. Hinweis: Ein detailliertes Protokoll für Lentivirus Produktion in 96-Well Platten [d.h. "ShRNA/SgRNA/ORF Hochdurchsatz virale Produktion (96 gut)"] finden Sie hier: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
  4. Infizieren Sie Zellen mit den Lentiviren. Hinweis: Ein detailliertes Protokoll für Lentivirale Infektion in 96-Well-Platten (d. h. "Lentivirale Infection") ist online verfügbar unter http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/dir/download?dirpath=protocols/production&filename=TRC%20viral % 20infection%20200909.pdf.
  5. Zellen mit onkolytische Viren infizieren entweder folgende Puromycin-Auswahl (siehe 3.4 für das Auswahl-Protokoll) erfolgreich ausgestrahlt Zellen oder unmittelbar folgenden Transduktion (ohne Puromycin Auswahl). Um die optimale Höhe des Virus und die Dauer der Inkubation mit Virus zu bestimmen, verwenden Sie dieselbe Methode für den primären Bildschirm verwendet.

(4) tertiäre Validierung

Hinweis: Die tertiäre Validierung dient in erster Linie bestätigen, dass der Hit am Ziel, spezifische, Tumor ist und verbessert die Wirksamkeit in-vivo. Man kann auch testen, ob es Ausbreitung in einem Spektrum von Tumorzelllinien moduliert

  1. Bestätigung, dass Niederschlag des Gens Kandidat soll
    1. Zuerst bestätigen Sie, dass es eine Korrelation zwischen Phänotyp und Gen-silencing. Verwenden Sie den gleichen Test, der entwickelt wurde für den Bildschirm oder ändern Sie es für ein 6-Well-Format für die Beurteilung der Verbesserung oder Hemmung der Verbreitung in einem größeren Format zu. Führen Sie einen zeitlichen Verlauf mit Zellen mit SiRNA targeting ursächlich an plus und minus Virus transfiziert.
    2. Bild der Brunnen mit Virus-infizierten Zellen, und sammeln die Zelle Lysates aus den nicht infizierten Brunnen in regelmäßigen Zeitabständen. Festzustellen Sie, ob eine Korrelation zwischen Gen-silencing und Förderung oder Hemmung der Verbreitung. Gen-silencing durch Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) und/oder Western blotting zu beurteilen.
    3. Führen Sie eine genetische Rettung Experiment, um zu bestätigen, dass der Hit am Ziel ist. Hinweis: In einem typischen Rettungs-Experiment, das Kandidaten-gen ist geworfen mit RNAi während zur gleichen Zeit Zellen mit resistenten RNAi cDNA (z.B. Ortholog des Gens) vorübergehend transfiziert sind mit dem Ausdruck des Kandidaten-Gens zu bestimmen, ob die Phänotyp des Gens ist wiederhergestellt oder "gerettet". Stabilen Zelllinien überexprimiert RNAi beständig cDNA Kandidaten-gen von Interesse können auch eingesetzt werden.
    4. Alternativ anstelle einer genetischen Rettung Experiment verwenden mehrere orthogonale Assays um zu bestätigen, dass der Treffer auf Ziel ist [z.B. festzustellen, ob die gleiche Phänotyp nach Zuschlag des Zielgens mit mehreren SiRNAs auf Knockdown von gewonnen wird das Zielgen in mehreren stabilen Zelllinien, die mit dem Ausdruck ShRNA gegen das Zielgen und auf Knockout mit CRISPR (Clustered regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholung)-Cas9-Technologie in mehreren Zelllinien.].
  2. Bestätigung, dass der Hit tumorspezifischen und moduliert verteilt eine Reihe von Tumor-Zell-Linien
    1. Führen Sie einen ähnlichen Assay in 4.1.1, aber mit normalen Zellen sowie mit anderen Tumorzelllinien.
  3. Bestätigung, dass die Manipulation des Kandidaten-Gens erhöht die Wirksamkeit in vivo
    Hinweis: Nachfolgend beschriebenen sind drei mögliche Methoden zur Manipulation des Gens in Vivorichten.
    1. Finden Sie eine Medikament, das gen Ziel zu manipulieren. Wenn es ein Medikament wie ein niedermolekularer Inhibitor, der auf das gleichen gen abzielt gibt, verwalten Sie es mit onkolytische Viren in Vivo. Es ist wichtig, den optimalen Zeitpunkt für die Verabreichung des Medikaments zu bestimmen.
    2. Ingenieur, das Virus zu hemmen oder overexpress gen Ziel abhängig, ob man wünscht zu hemmen oder zu verbessern das gen Ziel. Um das Gen zu hemmen, Ingenieur onkolytische Viren eine dominante negative des Gens oder ausdrückliche ShRNA gezielt das Gen zum Ausdruck bringen. Um den Ausdruck des Gens Ziels zu erhöhen, Klonen Sie onkolytische Viren mit einem Transgen das Gen überexprimiert.
    3. Ingenieur-Zell-Linien mit dem Gen geworfen oder herausgetrennten mit ShRNA oder CRISPR-Cas9 Technologie, beziehungsweise. Implantat-veränderter Zell-Linie und die Wildtypzelle Linie in Vivo und anschließend mit dem onkolytische Viren infizieren. Hinweis: Diese Methode dient als ein Proof-of-Principle und kann helfen, festzustellen, ob zusätzliche Zeit und Ressourcen zur Entwicklung eines Medikaments zu manipulieren das Gen in Vivo, z. B. investieren lohnen würde.

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Ergebnisse

Ein Überblick über den Workflow zur Identifizierung von Host-Ziele zur Verbesserung der onkolytische Viren Therapie ist in Abbildung 1dargestellt.

Wie in Abbildung 1dargestellt, ist der entscheidende erste Schritt die Durchführung eines Hochdurchsatz-RNAi Bildschirms Assay-Entwicklung. Abbildung 2A bietet eine Beispielanlage Platte für die ...

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Diskussion

Hier präsentieren wir ein Protokoll für den Einsatz von Hochdurchsatz-Screening der RNAi Host Ziele zu identifizieren, die manipuliert werden können, um die onkolytische Viren Therapie zu verbessern. Dies wurde erfolgreich getestet mit onkolytische Maraba und onkolytische Vaccinia Virus, aber wie bereits erwähnt, es angepasst werden kann für die Verwendung mit anderen onkolytische Viren oder andere Viren in der Regel um Host Gene zu identifizieren, die Replikation des Virus zu modulieren. Das Screening Protokoll soll auc...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Ontario Institut für Krebsforschung, der Kanada-Stiftung für Innovation, die Ottawa Regional Cancer Foundation und der Terry Fox Research Institute unterstützt. K.J.A. wurde durch ein Vanier Canada Graduate Stipendium, ein Canadian Institute for Health Research-Master Award unterstützt und ein Ontario-Graduate-Stipendium.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ConsumablessiRNA-Bibliothek
GE DharmaconG-005005-02
Corning 384-Well-PlatteCorning3985
Falcon 384-Well-PlatteBecton Dickinson353962
WaterSigmaW4502
siGenome SMARTpool PLK1GE DharmaconM-003290-01
AllStars siRNA mit NegativkontrolleQiagenSI03650318
siGenome siRNA-Pool #2GE DharmaconD-001206-14-20
DMEM/HIGH GlukoseGE Healthcare Life SciencesSH30022.01
Fötales RinderserumSigmaF15051-500ML
HEPES-Lösung (1M)SigmaH3535-100ML
Penicillin-Streptomycin 100X-LösungGE Healthcare Life SciencesSV30010
Trypsin-EDTA (0,25 %)Thermo Fisher Scientific2500056
DPBS/ModifiedGE Healthcare Life SciencesSH30028,02
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778100
OligofectamineThermo Fisher Scientific1225011
Opti-MEMThermo Fisher Scientific22600-050
Resazurin NatriumsalzSigmaR7017-5G
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH21492
Formaldehyd (37 % Massenanteil)Fisher ScientificF79-4
500 ml FlaschenCorning
selbstklebende Dichtungsfolie für MikroplattenExcel Scientific361006007
abziehbare HeißsiegelfolieThermo Fisher ScientificAB-3720
BioTek MicroFlo Select SpenderkassetteFisher Scientific11-120-625<
strong>NameUnternehmenKatalog AnzahlKommentare
Ausrüstung
MicroFlo Select (Flüssigkeitsspender)Fisher Scientific11120621
BioTek Synergy HT PlattenleserBiotekN/A
Opera Bildgebungs- und AnalysegerätPerkinElmerHH10000115
KiNEDx Robotic ArmPeak Analysis and Automation (ehemals Peak Robotics)KX-300-660
Cytomat 24C Series Automatisierter InkubatorThermo Fisher Scientific50080227
JANUS Automated WorkstationPerkinElmerAJI4M01
PlattenkarussellPeak Analysis and Automation (ehemals Peak Robotics)N/A
Alps 3000 PlattenversiegelerThermo Fisher ScientificAB-3000
430282

Referenzen

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