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Methodenartikel

Ein Protokoll für die Produktion der Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren für CRISPR/Cas9-vermittelte Gen Knockout in teilenden Zellen

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DOI:

10.3791/56915

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12. Dezember 2017

 , 
1Duke Viral Vector Core, Department of Neurobiology, Duke University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Produktionsstrategie der Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren (IDLVs) als Vehikel für Zellen CRISPR/Cas9 bereitzustellen. Mit der Fähigkeit, schnell und robust Gene in Zellen bearbeiten zu vermitteln IDLVs präsentieren ein sicherer und ebenso wirksame Vektor Plattform für gen-Lieferung im Vergleich zu Integrase-kompetente Vektoren.

Zusammenfassung

Lentivirale Vektoren sind eine ideale Wahl für die Bereitstellung von gen-Bearbeiten von Komponenten auf Zellen aufgrund ihrer Fähigkeit zur stabil transducing einen breiten Bereich von Zellen und hohe Stufen der Genexpression zu vermitteln. Jedoch ihre Fähigkeit zur Integration in das Wirtsgenom Zelle erhöht das Risiko der insertional Mutagenität und damit Sicherheit Bedenken und schränkt ihre Verwendung in klinischen Umgebungen. Weiter, geliefert der anhaltenden Ausdruck der gen-Bearbeiten von Komponenten durch diese Integration zuständigen Lentivirale Vektoren (ICLVs) erhöht die Wahrscheinlichkeit von promiscuous Gene targeting. Als Alternative hat eine neue Generation von Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren (IDLVs) entwickelt, die viele dieser Bedenken befasst. Hier Produktionsprotokoll einer neuen und verbesserten IDLV-Plattform für CRISPR-vermittelten gen bearbeiten und Liste der Schritte bei der Reinigung und Konzentration von solchen Vektoren beschrieben und deren Transduktion und gen-Bearbeitung Effizienz mit HEK-293T Zellen zeigte. Dieses Protokoll ist leicht skalierbar und kann verwendet werden, um hohe Titer IDLVs generieren, die in der Lage, transducing Zellen in Vitro und in Vivo. Darüber hinaus kann dieses Protokoll für die Herstellung von ICLVs leicht angepasst werden.

Einleitung

Gen präzise Bearbeitung bildet den Grundstein biomedizinische Fortschritte, die die Entwicklung neuer Strategien zur Bekämpfung genetischer Krankheiten betreffen. An die Spitze der gen-Bearbeitungs-Technologien ist die Methode unter Berufung auf die Nutzung der clustered rregelmässig -IchNterspaced sHort pAlindromic REpeats (CRISPR) / Cas9-System, das zunächst identifiziert wurde als Bestandteil des bakteriellen Immunität gegen die Invasion der viralen Erbsubstanz (rezensiert in Referenzen1,2). Ein wesentlicher Vorteil des CRISPR/Cas9-Systems gegenüber anderen gen-editing-Tools, wie z. B. Zinkfinger-Nukleasen (ZFN) und Transkription Aktivator-ähnliche Effektor Nukleasen (TALENs) (rezensiert in Referenz3), ist die relative Einfachheit der Plasmid-Design und Bau von CRISPR-Komponenten – ein Feature, das den Ausbau der gen-Bearbeitung von wenigen Speziallabors für eine viel breitere Forschungsgemeinschaft angetrieben hat. Darüber hinaus haben die Einfachheit der CRISPR/Cas9 Programmierung und seine Kapazität für Multiplex Zielerfassung seine Popularität als eine kostengünstige und einfach zu bedienende Technologie weiter angeheizt. Unter den verschiedenen Methoden zur Verfügung, um Forscher solche gen-Bearbeiten von Komponenten an Zellen zu liefern bleiben virale Vektoren bei weitem die beliebteste und effizientes System.

Lentivirale Vektoren (LVs) entstanden als das Fahrzeug der Wahl für die Komponenten des CRISPR/Cas9 System in Vivo für unterschiedlichste Anwendungen4,5,6,7liefert. Mehrere wichtige Funktionen machen LVs eine beliebte Wahl für diesen Prozess, einschließlich ihrer Fähigkeit, sowohl trennende und nicht teilenden Zellen, niedrige Immunogenität und minimale zelluläre Toxizität (rezensiert in Referenz8) zu infizieren. Infolgedessen wurde LV-vermittelte Gentherapie in der Behandlung von Infektionskrankheiten wie HIV-1, HBV und HSV-1, sowie bei der Korrektur von Mängeln, die zugrunde liegenden menschlichen Erbkrankheiten, wie Mukoviszidose und Neo-Kreislauf Makuladegeneration eingesetzt 4 , 5 , 7 , 9 , 10 , 11. Außerdem, LVs wurden effektiv geändert um Multiplex-gen an unterschiedliche genomic Loci mit einem einzigen Vektor System12Bearbeitung ausführen.

Jedoch kann die inhärente Eigenschaft des LVs in das Wirtsgenom integrieren mutagen und oft behindert ihre Nützlichkeit als Transgen Lieferfahrzeuge, vor allem im klinischen Umfeld. Da zudem stabil integriert LVs ihre transgene auf einem nachhaltig hohen Niveau zum Ausdruck bringen, ist dieses System ungeeignet für die Lieferung von gen-Bearbeiten von Komponenten wie CRISPR/Cas9; Überexpression des Cas9-Guide RNA (gRNA) und ähnliche Proteine wie ZFN, sind verbunden mit erhöhten Konzentrationen von Ziel-Effekte, darunter unerwünschte Mutationen13,14,15,16 , 17 und können potenziell Zytotoxizität18verbessern. Daher unbedingt um präzise zu erreichen gen-Bearbeitung mit minimal Ziel Effekte, Design-Systemen, die für die transiente Expression des Gens, die Bearbeitung von Komponenten ermöglichen.

In den letzten Jahren wurden eine Vielzahl von Plattformen entwickelt, um vorübergehend CRISPR/Cas9 in Zellen16,19,20,21 (rezensiert in Referenz22) zum Ausdruck bringen. Dazu gehören Methoden, die direkt Einführung von gereinigten Cas9 zusammen mit der passenden Guide-RNAs in Zellen, die gezeigt wurde, effektiver auf gezielte gen-Bearbeitung im Vergleich zu Plasmid-vermittelte Transfektion16abhängig. Studien haben gezeigt, dass Ribonucleoprotein (RNP) komplexe, bestehend aus Leitfaden RNA/Cas9 Partikel werden schnell umgedreht nach Vermittlung Spaltung der DNA auf ihre Ziele, was darauf hindeutet, dass kurzfristige Ausdruck dieser Komponenten zu erzielen ist robuste gen16bearbeiten. Denkbar, nicht-Integration von viralen Vektoren Plattformen wie Adeno-assoziierten viralen Vektoren (Flugabwehrpanzer) bieten eine echte Alternative um gen-Bearbeitung Maschinen an Zellen zu liefern. Leider AAV Capsids besitzen deutlich geringere Verpackung Fähigkeit als LVs (< 5kb), die schwer behindert ihre Fähigkeit, das Mehrkomponenten CRISPR-Toolkit innerhalb einer einzigen Vektor (rezensiert in Referenz8) zu verpacken. Es ist erwähnenswert, dass die Zugabe von Verbindungen, die Histon Deacetylases (z.B. Natrium Butyrat23) hemmen oder verhindern den Zellzyklus (z.B. Koffein24) gezeigt worden, um Lentivirale Titer zu erhöhen. Trotz der jüngsten Fortschritte sind die transiente Expression-Systeme so weit entwickelt noch mehrere Mängel auf, z. B. geringere Produktionseffizienz, behindert durch führen zu reduzierten virale Titer und niedrigen Transduktion Effizienz erzeugt durch Viren solche Ansätze25.

Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren (IDLVs) stellen einen großen Fortschritt in der Entwicklung von gen-Lieferfahrzeuge, wie sie die Verpackung-Fähigkeit des LVs mit dem zusätzlichen Vorteil der AAV-artigen episomal Wartung in Zellen verbinden. Diese Funktionen helfen IDLVs, die die wichtigsten Probleme im Zusammenhang mit Integration von Vektoren, Vis À Vis kontinuierliche Überexpression von potenziell genotoxische Elementen und Integration-vermittelten Mutagenität weitgehend zu umgehen. Es wurde bereits gezeigt, dass IDLVs erfolgreich zur Verbesserung der episomal gen Ausdruck26,27geändert werden kann. In Bezug auf IDLV-vermittelten CRISPR/Cas9 Lieferung beschränkt niedrige Titer und niedriger Ausdruck von Episome getragen Genomen relativ Integrase-kompetente Lentivirale Systeme ihre Nützlichkeit als Bona Fide -Tools für die Bereitstellung von Genom-Bearbeitung transgene Konstrukte. Wir zeigten kürzlich, dass Transgene Ausdruck und virale Titer IDLV Produktion durch die Einbeziehung von Bindungsstellen für den Transkriptionsfaktor Sp1 in der viralen Ausdruck Kassette28erheblich verbessert werden. Die modifizierte IDLVs unterstützt robust CRISPR-vermittelten gen Bearbeitung sowohl in Vitro (in HEK-293T Zellen) und in Vivo (im Post-mitotische Gehirnneuronen), während minimalste Ziel Mutationen im Vergleich zu den entsprechenden ICLV-vermittelte Induktion Systeme-28. Insgesamt entwickelten wir eine neuartige, kompakte, all-in-One CRISPR-Toolkit auf einer IDLV Plattform durchgeführt und erläutert die verschiedenen Vorteile der Verwendung solch ein Transportvehikel für verbesserte gen zu bearbeiten.

Hier ist das Produktionsprotokoll des IDLV-CRISPR/Cas9-Systems beschrieben, darunter die verschiedenen Schritte in der Montage, Reinigung, Konzentration und Titration von IDLVs sowie Strategien, die gen-Bearbeitung Wirksamkeit dieser Vektoren zu validieren. Dieses Protokoll ist leicht skalierbar, um die Bedürfnisse der verschiedenen Forschern und wurde entwickelt, um erfolgreich LV Vektoren mit Titer im Bereich von 1 x 1010 transducing Einheiten (TU) erzeugen / mL. Die Vektoren generiert durch dieses Protokoll können genutzt werden, um effizient mehrere verschiedene Zelltypen, einschließlich schwer transduzieren embryonale Stammzellen, blutbildenden Zellen (T-Zellen und Makrophagen) und kultiviert und in Vivozu infizieren- eingespritzte Neuronen. Darüber hinaus ist das Protokoll für die Produktion der Integrase-kompetente Lentivirale Vektoren in ähnlichen Mengen gleich gut geeignet.

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Abbildung 1: IDLV Verpackung. (a) schematische Darstellung der Wildtyp Integrase Protein (b) das modifizierte Plasmid wurde von psPAX2 abgeleitet (siehe Methoden, Plasmid-Konstruktion für Details). Vertreter Agarose Gelbild geschirmt für mutierte Integrase Klone Klone. DNA-Proben mit den standard Plasmid DNA-Isolierung Mini-Kit zubereitet wurden durch Vergärung mit EcoRV und SphI analysiert. Der richtig verdaut Klon (Nummer 5, gestrichelten roten Feld) wurde weiter durch Sequenzierung der direkten (Sanger) für die D64E Substitution in INTüberprüft. Die Integrase-defizienten Verpackung Kassette wurde pBK43 genannt. (c) schematische Darstellung der transiente Transfektion Protokoll eingesetzt, um generieren IDLV-CRISPR/Cas9 Vektoren zeigen, dass 293T Zellen mit VSV-G, Verpackungen und Transgen Kassetten (Sp1-CRISPR/Cas9 all-in-One Plasmid) transfiziert. Viruspartikel, die heraus von der Zellmembran Knospe enthalten die Full-length RNA des Vektors (ausgedrückt aus der Transgen-Kassette). Die zweite Generation der IDLV-Verpackungssystem diente, worunter die regulatorische Proteine Tat und Rev Rev Ausdruck wird von einer separaten Kassette (RSV-REV-Plasmid) ergänzt. Abbrev: LTR Long Terminal repeat, VSV-G, Stomatitis vesicularis Virus G-Protein, pCMV-Zytomegalievirus Veranstalter; Rous Sarkom-Virus (RSV) Veranstalter; RRE-(Rev-Response-Element). Weitere regulatorische Elemente auf der Expressionskassette gehören Sp1-Bindungsstellen, Rev Response-Element (RRE), Murmeltier Hepatitis Virus posttranskritionelle regulatorische Element (WPRE), Kern-Dehnung Faktor 1α Förderer (EFS-NC), der Vektor-Verpackung Element-ψ (Psi), menschliches Cytomegalovirus (hCMV) Veranstalter und menschlichen U6 Förderer. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Protokoll

(1) Kultivierung HEK-293T Zellen und Aussaat zur Transfektion

Hinweis: Menschliche embryonale Nieren 293T (HEK-293T) Zellen wachsen in DMEM, hohe Glukose Medien mit 10 % bovine Kälberserum ergänzt mit Eisen und Wachstum Promotoren und 1 x Antibiotikum antimykotische Lösung ergänzt (100 X Lösung enthält 10.000 Einheiten Penicillin 10 mg Streptomycin und 25 µg Amphotericin B pro mL). Die Medien ist auch mit 1 X Natrium Pyruvat, 1 X nicht-essentielle Aminosäure-Mix und 2 mM L-Glutamin ergänzt (Lager 200 mM L-Alanyl-L-Glutamin Dipeptid in 0,85 % NaCl). Zellen sind in 100 mm Gewebekultur Platten kultiviert (ungefähre Wachstum Fläche beträgt 55 cm ²). Ein Sub-Anbau-Verhältnis von 01:10 dient mit Sub-Kultivierung alle 2-3 Tage. Trypsin-EDTA 0,05 % dient zur Dissoziation von Zellen zwischen Passagen. Um Konsistenz zwischen Experimente zu gewährleisten, wir empfehlen Tests Kalb Sera, beim Wechsel zu einer anderen Menge/Charge und alle Änderungen im Zellwachstum, Transfektion Effizienz überwachen und Vektor-Produktion.

  1. Starten Sie eine neue Kultur mit niedrigen Durchgang Zellen (es empfiehlt sich, nach Passage 15 oder wenn Wachstum sich verlangsamt Zellen nicht mehr verwenden) durch Aussaat in einer Gewebekultur 10-cm-Platte. Verwenden Sie DMEM mit 10 % Serum für das Zellwachstum ergänzt. Wachsen Sie bei 37 ° C mit 5 % CO2 in einem Inkubator standard Gewebekultur Zellen. Verwenden Sie ein standard Hemocytometer Zellen für alle weiteren Schritte zu zählen.
  2. Sobald die Zellen konfluierende Wachstum von 90-95 %, Reseed in 15 cm Gewebekultur Platten (siehe unten, Schritte 1,3 - 1,5) erreichen.
  3. Um reseed, aspirieren Sie Medien aus der konfluierende Platte und sanft spülen mit sterilen 1 X PBS. Inkubieren Sie Zellen mit 2 mL Reagenz (z.B.Trypsin-EDTA) Dissoziation bei 37 ° C für ca. 3-5 min. hinzufügen 8 mL Medium, das Serum zu inaktivieren die Dissoziation-Reagenz, genannte 10 - 15 Mal mit einer serologischen 10 mL-Pipette, erstellen Sie eine einzelne Zelle enthält Aufhängung. Aufschwemmen Sie Zellen in der Kultur, Medien, eine Zelldichte von ca. 4 x 106 Zellen/mL zu erhalten.
  4. Zur Verbesserung der Einhaltung der auf das Substrat vor Mantel 15 cm Platten mit 0,2 % Gelatine, Hinzufügen von 8 mL Gelatine pro Platte. Gleichmäßig über die Oberfläche der Platte, bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren und die Flüssigkeit abschöpfen.
  5. Bringen Sie das Gesamtvolumen der jede Platte auf 25 mL mit Warm (37 ° C) HEK-293 T Medien (siehe Hinweis unter Schritt 1) und Samen der Platten durch Zugabe von 2,5 mL Zellen (insgesamt ~ 1 x 107 Zellen/Platte). Inkubieren Sie Platten bei 37 ° C mit 5 % CO2 , über Nacht oder bis 70-80 % Konfluenz erreicht ist.
    Hinweis: Bis zu sechs 15 cm Platten kann für die Produktion verwendet werden. Einstellen Sie Lautstärke der Medien pro Platte bis ~ 20-22 mL, wenn Sie mehr als vier Platten verwenden (siehe Schritt 5 des Protokolls zur Begründung).

2. transfecting HEK-293T Zellen mit einem Calcium-Phosphat-basiertes Protokoll

  1. Transfektion Reagenzien
    1. 2 x BES-gepufferte Lösung BBS (50 mM BES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4) vorzubereiten, kombinieren Sie 16,36 g NaCl, 10,65 g BES (N, N-Bis (2-Hydroxyethyl) -2-amino-Ethanesulfonic Säure), und 0,21 g Na2HPO4. Fügen Sie bidestilliertem H2O (Dd-H2O) bis zu 900 mL. Auflösen, bis pH 6,95 mit 1 M NaOH titrieren und Volumen 1 L. Filter über 0,22 µM-Filter-Einheit zu bringen. Shop bei-20 ° C.
    2. 1M CaCl2vorbereiten. Filtern Sie Lösung über einen 0,22 µM-Filter. Shop bei 4 ° C.
  2. Beobachten Sie die Platten, die einen Tag zuvor ausgesät wurden. Zellen sind bereit zur Transfektion, sobald sie 70-80 % Konfluenz erreicht.
  3. Aspirieren Sie alte Medien von den Platten und fügen Sie frisch zubereiteten Medien ohne Serum sanft hinzu.
    Hinweis: Weitere Informationen über den gewählten Plasmiden und deren Vorbereitung Ergänzende Datei 1-Plasmide .
  4. Bereiten Sie den Plasmid-Mix durch Aliquotierung der vier Plasmide in eine 15 mL konische Röhrchen. Für eine 15 cm Einzelgericht Zubereitung verwenden 37,5 µg der CRISPR/Cas9-Übertragung Vektor-(pBK198 oder pBK189), 25 µg des pBK43 (psPAX2-D64E), 12,5 µg pMD2.G und 6,25 µg pREV (Abbildung 1 c).
  5. 312,5 µL 1M CaCl2 der Plasmid-Mischung hinzufügen. Dazu fügen Sie bis zu 1,25 mL sterile Dd-H20.
  6. Langsam (tropfenweise) 1,25 mL 2 X BBS-Lösung beim Aufschütteln der Mischung hinzugeben. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  7. Fügen Sie die Transfektion Mischung tropfenweise auf jede 15-cm-Platte (2,5 mL pro Teller). Die Platten sanft wirbeln und Inkubation bei 37 ° C mit 5 % CO2 für 2-3 h. Danach fügen Sie 2,5 mL (10 %) Serum pro Platte und weiter Inkubation über Nacht (12-18 h).
    Hinweis: Einige Labors verwenden 3 % CO2 Inkubatoren Medien pH-Wert stabilisieren. Wir beobachten jedoch keiner Unterschied in Transfektion Effizienz zwischen 3 % und 5 % CO2. Auch ist die Größe des CaPO4 Ausscheidungen entscheidend für Transfektion Effizienz; die Transfektion Mischung muss klar vor seinen Zusatz auf die Zellen sein. Wenn die Mischung während der Inkubation trübe wird, bereiten frische 2 X BBS (pH = 6,95).

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Abbildung 2: Konzentration der viralen Partikel mit Doppel-Saccharose gradient Protokoll. Viruspartikel aus der Überstand (SN) gesammelt werden auf Farbverlauf Saccharose Farbverlauf geladen. 70 %, 60 %, 30 % und 20 % Saccharose-Lösungen werden verwendet, um den Farbverlauf zu erzeugen. Nach Zentrifugation werden die Partikel von 30-60 % Saccharose Fraktionen gesammelt weiter auf 20 % Saccharose Kissen verladen und ausgefällt. Die endgültige Pellet mit gereinigtem Viruspartikel ist Nukleinsäuretablette mit 1 X PBS-Puffer für die weitere Verwendung (siehe Text für weitere Details). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

3. Tag nach Transfektion

  1. Beobachten Sie die Zellen um sicherzustellen, dass sie 100 % Konfluenz zu diesem Zeitpunkt mit wenig bis kein Zelltod nähern. Ersetzen Sie Medien durch Zugabe von 25 mL frische DMEM + 10 % Serum auf jede Platte. Weiter Inkubation bei 37 ° C mit 5 % CO2 für weitere 48 h.
    Hinweis: Lautstärke der Medien im Schritt 3.1, wenn mehr als sechs 15 cm Platten verwenden (siehe Schritt 5.2, beachten).

4. Ernte Virus

  1. Sorgfältig sammeln des Überstands von den Gewebekultur Platten der transfizierten Zellen mit einem sterilen 10 mL Gewebekultur Pipette und Pool in 50 mL Zentrifuge Röhren.
  2. Deaktivieren Sie die Suspension durch Zentrifugation bei 400-450 X g für 10 min. mit einer Tischplatte Zentrifuge. Filtern des Überstands durch eine 0,45 µm-Vakuum-Filter-Einheit.
    Hinweis: Der gefilterten überstand kann bei 4 ° C für bis zu 4 Tage vor dem fortfahren mit Konzentration, gespeichert oder regelmÄÑig und bei-80 ° c gelagert werden Die erwarteten Titer IDLV-Sp1-CRISPR/Cas9 (konzentriert) virale Präparate sollte ~ 2 x 107 TU/mL (siehe Schritt 6 für Titer-Bestimmung). Vermeiden Sie jedoch die virale Vorbereitungen für mehrere Gefrier-Tau-Zyklen als jeder Runde von Einfrieren und Auftauen führt eine 10-20 % Verlust in funktionale Titer zu unterwerfen.

5. Konzentration der Viruspartikel durch Ultrazentrifugation

Hinweis: Wir nutzen eine Doppel-Saccharose-Methode der Reinigung, die zwei Schritte beinhaltet: eine Saccharose Farbverlauf und ein Saccharose Kissen Schritt (Abbildung 2).

  1. Laden Sie die konische Ultrazentrifugation Röhren in der folgenden Reihenfolge zum Erstellen eines Farbverlaufs Saccharose: 0,5 mL 70 % Saccharose (1 X PBS aufgelöst), 0,5 mL 60 % Saccharose (aufgelöst in DMEM), 1 mL 30 % Saccharose (aufgelöst in DMEM) und 2 mL 20 % Saccharose (aufgelöst in 1 X PBS).
  2. Fügen Sie den Virus enthaltende überstand sorgfältig auf den Farbverlauf. Da das Gesamtvolumen der Überstand von vier 15 cm Platten 100 mL ist, verwenden Sie sechs Ultrazentrifugation Rohre pro Spin Verarbeitung des vollen Umfangs des Virus überstand.
    1. Jedes Ultrazentrifugation Rohr verwendet für diesen Schritt hat ein Fassungsvermögen von bis zu 30 mL (einschließlich des Volumes von Saccharose), virale überstand gleichmäßig auf Rohre, so dass mindestens 10 % verteilen Headspace um auslaufen zu verhindern.
    2. Die Lautstärke Kultur bis ~ 20-22 mL pro Platte bei der Verwendung von mehr als vier 15 cm Platten für jedes Experiment, so dass der letzte Band der gepoolten virale überstand innerhalb sechs Ultrazentrifugation Rohre problemlos untergebracht werden kann.
    3. Füllung Ultrazentrifugation Rohre bis mindestens drei Viertel ihrer Eigenschaft Gesamtvolumen, sonst Bruch der Rohre bei der Zentrifugation, mögliche Verlust von Probe und/oder Ausrüstung Schäden auftreten kann.
  3. Gleichgewicht der Rohre mit 1 x PBS und Zentrifuge Proben bei 70.000 x g 2 h bei 17 ° C (siehe Tabelle der Materialien für Rotor Details).
    Hinweis: Zur Vermeidung von Störungen der Saccharose Schicht während der Beschleunigung einstellen der Ultrazentrifuge langsam den Rotor auf 200 u/min während der ersten 3 min von der Spin zu beschleunigen. Ebenso festgelegt Ultrazentrifugen langsam den Rotor von 200 u/min, 0 u/min über 3 min am Ende der Drehung gebremst.
  4. Sammeln Sie 30-60 % Saccharose Fraktionen sorgfältig in saubere Rohre (Abbildung 2). Fügen Sie Kälte 1 x PBS der gepoolten Fraktionen und bringen Sie die Lautstärke auf 100 mL; Mischen Sie, indem Sie nach oben und unten mehrmals pipettieren.
  5. Fahren Sie mit der Saccharose Kissen Schritt durch sorgfältig Schichtung der viralen Vorbereitung auf einem Kissen von Saccharose. Hierzu fügen Sie 4 mL 20 % Saccharose (mit 1 X PBS-Puffer) am Rohr, gefolgt von ~ 20-25 mL der viralen Lösung pro Röhre. Wenn Rohre weniger als drei Viertel sind voll, steril 1 X PBS nachfüllen.
  6. Vorsichtig balancieren Sie und Zentrifugieren Sie die Proben bei 70.000 x g 2 h bei 17 ° C, wie zuvor. Der Überstand abgießen und lassen die restlichen Flüssigkeit durch invertieren Röhren auf Küchenpapier abtropfen lassen.
  7. Aspirieren Sie verbleibende Tropfen um alle Flüssigkeit aus den Pellets zu entfernen. Bei diesem Schritt sollten die Virus-haltigen Pellets als kleine durchscheinende Flecken kaum sichtbar.
  8. Aufschwemmen Sie Pellets, indem Sie die erste Röhre und gründlich Pipettieren der Aufhängungs, anschließend die Aussetzung auf den nächsten Schlauch übertragen und mischen wie fortfahren, bis alle Pellets Nukleinsäuretablette sind 70 µL 1 X PBS hinzufügen.
  9. Spülen Sie die Rohre mit einer zusätzlichen 50 µL Kälte 1 x PBS und Mischung wie zuvor. Sicherzustellen Sie, dass das Gesamtvolumen der endgültigen Aufhebung ~ 120 µL, und leicht milchig erscheint; klar, dass es durch Zentrifugation bei 10.000 x g für 30 s auf eine Tischplatte Microcentrifuge.
  10. Übertragen Sie den Überstand auf ein frisches Microfuge Rohr, 10 µL-Aliquots, und speichern Sie diese bei-80 ° C.
    Hinweis: Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Wechseln auf die Lentivirale Proben durchführen. Außer wenn Zentrifugierung erforderlich ist sollten Bemühungen unternommen, um die verbleibenden Schritte in Gewebekultur Hauben durchzuführen oder bezeichnet Gewebekultur Räume mit geeigneten biologischen Maßnahmen (siehe Diskussion).

6. Abschätzung der viralen Titer

  1. p24 -Enzym-Immunosorbentprobe Assay (ELISA) Methode verknüpft
    Hinweis: Der Test erfolgt mit hoher Bindung 96-Well-Platten, wie gemäß den Anweisungen des Programms NIH AIDS-Impfstoff für HIV-1 p24 Antigen-Capture-Assay Kit (siehe Tabelle der Materialien), mit Änderungen29.
    1. Am nächsten Tag waschen die Brunnen dreimal mit 200 µL 0,05 % Tween 20 in kaltem PBS (PBS-T-Lösung). Bestreichen Sie die Platte mit 100 µL monoklonalen Anti-p24 Antikörper bei einer Verdünnung von 1:1500 mit 1 X PBS-Puffer und über Nacht bei 4 ° c inkubieren
    2. Unspezifische Bindung zu beseitigen, blockieren Sie die Platte mit 200 µL 1 % BSA mit PBS-Puffer; waschen dreimal mit 200 µL 0,05 % Tween 20 in kaltem PBS (PBS-T-Lösung) für mindestens 1 h bei Raumtemperatur.
    3. Proben vorbereiten: 1 µL der Probe verdünnen für konzentrierte Vektor Vorbereitungen, 100fach durch Zugabe von 89 µL von Dd-H20 und 10 µL des Triton x-100 (Endkonzentration von 10 %). -Konzentrierte Zubereitungen bereiten Sie um das Zehnfache verdünnten Proben (80 µL von Dd-H20 und 10 µL des Triton x-100 (Endkonzentration von 10 %) zu 10 µL der Probe hinzufügen vor).
      Hinweis: Proben können bei-20 ° C bei diesem Schritt für einen längeren Zeitraum zur späteren Verwendung gespeichert werden.
    4. Bereiten Sie HIV-1-Standards durch die Anwendung einer 2-fold serielle Verdünnung (mit einem Start Konzentration 5 ng/mL).
    5. Verdünnen von konzentrierten Proben (von 1: 100 vorverdünnt Bestände) RPMI 1640 ergänzt mit 0,2 % Tween 20 und 1 % BSA herstellen 01:10, 000, 01:50, 000 und 1:250,000 Verdünnungen. -Konzentrierte Proben zu verdünnen (von 01:10 Aktien Pre verdünnt) RPMI 1640 ergänzt mit 0,2 % Tween 20 und 1 % BSA, Verdünnungen von 1: 500, 1:2500 und 1:12,500 zu etablieren.
    6. Proben auf der Platte im Triplicates auftragen und über Nacht bei 4 ° c inkubieren
    7. Am nächsten Tag waschen die Brunnen sechsmal und Inkubation bei 37 ° C für 4 h mit 100 µL polyklonale Kaninchen Anti-p24 Antikörper, verdünnt 1: 1000 in RPMI 1640, 10 % FBS, 0,25 % BSA und 2 % normale Maus Serum (NMS).
    8. Sechs Mal wie oben beschrieben waschen und Inkubation bei 37 ° C für 1 h mit Ziege-Anti-Kaninchen-Meerrettich-Peroxidase IgG verdünnt 1: 10.000 RPMI 1640 ergänzt mit normalem Ziegenserum 5 %, 2 % NMS, 0,25 % BSA und 0,01 % Tween 20.
    9. Waschen Sie die Platte, wie oben beschrieben, und mit TMB-Substrat Peroxidase bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren.
    10. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 100 µL 1 N HCL. Messen der Probe Extinktion bei 450 nm unter Verwendung der Extinktion Platte Leser.
  2. Messung der Intensität der Fluoreszenz-reporter
    1. FACS-Methode
      Hinweis: Das Ausmaß der GFP Signal Erschöpfung in den Zellen genau abgeschätzt werden durch die Messung der mittleren Fluoreszenzintensität der transduced Zellen über Durchflusszytometrie. Entnehmen Sie bitte der aktuellen Papier 28 für FACS Analyse, Darstellung und Interpretation. Das Protokoll wird im folgenden beschrieben.
      1. Machen Sie eine zehnfache serielle Verdünnung von der Herstellung (von 10-1 bis 10-5) der viralen Zubereitung mit 1 X PBS-Puffer.
      2. Samen Sie ca. 5 x 105 293T Zellen in jede Vertiefung eine 6-Well-Platte in einem Endvolumen von 2 mL pro Bohrloch. Die Zellen 10 µL der einzelnen viralen Verdünnung hinzu und inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C für 48 h.
      3. Ernten von Zellen für FACS Analyse wie folgt: 200 µL 0,05 % Trypsin-EDTA-Lösung hinzufügen und inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C für 5 min. Add 2 mL einer kompletten DMEM-Medien und sammeln Sie Proben in 15 mL konische Röhrchen.
      4. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 400 X g bei 4 ° C, und das Pellet in 500 µL PBS kalt 1 X Aufschwemmen.
      5. Zur Fixierung dieser Suspension ein gleiches Volumen von 4 % Formaldehyd-Lösung hinzufügen und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
      6. Pellet-feste Zellen und in 1 mL 1 X PBS aufzuwirbeln. GFP-Ausdruck mit einem FACS-Instrument zu analysieren, wie in Ortinski Et Al. beschrieben 28 kurz, mithilfe der folgenden Formel funktionale Virustiter ermitteln:
        figure-protocol-2
        Hinweis: Hier Tg = Anzahl der GFP-positiven Zellen gezählt; TN = Gesamtzahl der Zellen gezählt; N = Gesamtzahl der Zellen ausgestrahlt; V = Volumen (in µL) für die Transduktion verwendet. Zum Beispiel: Wenn 1 x 106 Zellen mit 10 µL des Virus ausgestrahlt wurden, waren 2 x 104 Zellen gezählt und 5 x 103 waren GFP-positiven, basierend auf der obigen Gleichung die funktionale Titer wäre:
        figure-protocol-3
    2. GFP-positiven Zellen zählen
      1. Berechnen Sie die Multiplizität der Infektion (MOI) für die Transduktion verwendet. Testen Sie eine breite Palette von MOIs (1-10), mit zunehmender MOIs, was zu einer höheren Effizienz der Transduktion.
      2. Samen Sie vor Transfektion eine 6-Well-Platte mit ca. 3-4 x 105 Zellen pro Bohrloch. Sobald die Zellen erreichen > 90 % Konfluenz (in der Regel innerhalb von 24 h), transduzieren mit dem gereinigten Virus an vorher festgelegten MOIs.
      3. 1-7 Tage für Veränderungen der GFP Signal inkubieren Sie Platte bei 37 ° C mit 5 % CO2 in einer standard Gewebekultur und Monitor Zellen in regelmäßigen Abständen.
      4. Die Anzahl der GFP-positiven Zellen mit einem Fluoreszenz-Mikroskop (PLAN 4 X Objektiv, 0,1 N.A 40 X Vergrößerung) mit einer GLP-Filter-Set (Erregung Wellenlänge 470 nm, Emission Wellenlänge-525 nm), ausgestattet mit naiv (UN-transduced) Zellen, die Bevölkerung der GFP-Negative und positive Zellen.
      5. Schätzen Sie die endgültige Titer durch Anpassen der Verdünnungsfaktor und die Lautstärke, mit der folgenden Formel:
        figure-protocol-4
        Hinweis: Hier, N = Anzahl der GFP-positiven Zellen, D = Verdünnungsfaktor, M = Vergrößerungsfaktor (in der Regel 20 X), V = Volumen des Virus für die Transduktion verwendet. Zum Beispiel für 20 GFP-positiven Zellen (N) gezählt bei einer Verdünnung von 10-4 (01:10, 000) in einer 10 µL Probe (V) bei 20 X Vergrößerung (M) (D) ergäbe sich eine funktionale Titer (20 x 10-4) x (20) (10) x (100 *) = 4 x 108 TU/mL.
        (* zur Anpassung an pro mL)

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Ergebnisse

Validierung der Ko-Effizienz der IDLV-CRISPR/Cas9 Vektoren
Die Effizienz von CRISPR/Cas9-vermittelte gen Knockout Validierung verwendet wir GFP exprimierenden 293T Zellen als Modell. GLP +-Zellen wurden durch Transduktion von HEK-293T Zellen mit pLenti-GLP (vBK201a) bei einer MOI von 0,5 (Abb. 3 b, "keine-Virus" Panel) erzeugt. Die SgRNA-GLP/Cas9 all-in-One-Vektor-Kassette wurde in IDLV oder ICLV Partikel verpackt und die Effizienz der Pro...

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Diskussion

IDLVs haben damit begonnen, als das Fahrzeug der Wahl für die in-Vivo -gen-Bearbeitung, vor allem im Zusammenhang mit genetischen Erkrankungen, weitgehend aufgrund des geringen Risikos Mutagenese diese Vektoren im Vergleich zu integrieren Lieferung Plattformen22 zugeordnet entstehen , 28. im aktuellen Manuskript, wollten wir ausführlich das Protokoll verbunden mit der Produktion von der verbesserten all-in-One IDLV-CRISPR/Cas9 System, das vor kurzem in u...

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Offenlegungen

Patent-USC-499-P (1175) wurde von der University of South Carolina in Bezug auf die in diesem Manuskript beschriebenen Arbeiten eingereicht.

Danksagungen

Wir möchten die Abteilung für Neurobiologie, Duke University School of Medicine und Dekanat für Grundlagenforschung, Duke University bedanken. Wir danken auch Mitglieder des Duke viraler Vektor Kerns für Kommentare auf das Manuskript. Plasmid pLenti CRISPRv2 war Geschenk von Feng Zhang (Broad Institute). Die LV-Verpackungssystem einschließlich der Plasmide psPAX2, war VSV-G, pMD2.G und pRSV-Rev eine Art Geschenk von Didier Trono (EPFL, Schweiz). Gewähren Sie finanzieller Unterstützung für diese Arbeit von der University Of South Carolina School Of Medicine, zur Verfügung gestellt wurde, RDF18080-E202 (B.K).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Equipment
Optima XPN-80 UltrazentrifugeBeckman CoulterA99839
Allegra 25R TischzentrifugeBeckman Coulter369434
xMark Microplate Absorbance Plate ReaderBio-Rad1681150
BD FACSBecton Dickinson338960
Inverses FluoreszenzmikroskopLeicaDM IRB2
0,45-μ m Filtereinheit, 500 mLCorning430773
Ultrazentrifugationsröhrchen mit konischem BodenSeton Scientific5067
Konische RöhrchenadapterSeton ScientificPN 4230
SW32Ti SchwingrotorBeckman Coulter369650
15 mL konische ZentrifugenröhrchenCorning430791
50 mL konisch ZentrifugenröhrchenCorning430291
Hochbindende 96-Well-PlattenCorning3366
150 mm TC-behandelte Zellkulturschalen mit 20 mm GitterCorning353025
100 mm TC-behandelte KulturschaleCorning430167
0,22 μ M Filtereinheit, 1 lCorning430513
QIAprep Spin Miniprep Kit (50)Qiagen27104
Gewebekulturpipetten, 5 mLCorning4487
Gewebekulturpipetten, 10 mLCorning4488
Gewebekulturpipetten, 25 mLCorning4489
Hämazytometer mit DeckgläsernCole-ParmerUX-79001-00
Name<>UnternehmenKatalognummerKommentare
<>Zellkulturreagenzien
Menschliche embryonale Nierenzellen 293T (HEK 293T)ATCCCRL-3216
293FT ZellenThermo Fisher ScientificR70007
DMEM, Medien mit hohem GlukosegehaltGibco11965
Cosmic Calf SerumHycloneSH30087.04
Lösung, 100XSigma AldrichA5955-100ML
NatriumpyruvatSigma AldrichS8636-100ML
Nicht-essentielle Aminosäure (NEAA)HycloneSH30087.04
RPMI 1640 MedienThermo Fisher Scientific11875-085
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
Trypsin-EDTA 0,05%Gibco25300054
BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethansulfonsäure)Sigma AldrichB9879 - BES Gelatine
Sigma AldrichG1800-100G
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
>p24 ELISA-Reagenzien
sup>24Antikörper-NIH-AIDS-Forschungs- und Referenzreagenzienprogramm3537
HIV-1-StandardsNIH AIDS Research and Reference Reagent ProgramSP968F
Polyklonales Kaninchen Anti-p24 AntikörperNIH AIDS Research and Reference ReagentProgram SP451T
Ziege Anti-Kaninchen-Meerrettichperoxidase IgGSigma Aldrich12-348Arbeitskonzentration 1:1500
Normales Mausserum, steril, 500mLEquitech-BioSM30-0500
Ziegenserum, steril, 10mLSigmaG9023Arbeitskonzentration 1:1000
TMB Peroxidase-SubstratKPL5120-0076Arbeitskonzentration 1:10.000
Name<>Company<strong>Katalognummer>Kommentare
Plasmide
psPAX2Addgene12260
pMD2.GAddgene12259
pRSV-RevAddgene12253
lentiCRISPR v2Addgene52961
NameCompany KatalognummerComments
Restriktionsenzyme
BsrGINew England BiolabsR0575S
BsmBINew England BiolabsR0580S
EcoRVNew England BiolabsR0195S
KpnINew England BiolabsR0142S
PacINew England BiolabsR0547S
SphINew England BiolabsR0182S
Antibiotisch-antimykotische Monoklonales Anti-p<

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

CRISPR Cas9 Gen Knockoutvirale VektorproduktionReinigung durch UltrazentrifugationSaccharose Gradiententrennungp24 ELISA AssayHEK 293T TransduktionQuantifizierung des VirustitersCalciumphosphat TransfektionKonzentrierung viraler Partikel
Ein Protokoll für die Produktion der Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren für CRISPR/Cas9-vermittelte Gen Knockout in teilenden Zellen
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