Wir beschreiben die Produktionsstrategie der Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren (IDLVs) als Vehikel für Zellen CRISPR/Cas9 bereitzustellen. Mit der Fähigkeit, schnell und robust Gene in Zellen bearbeiten zu vermitteln IDLVs präsentieren ein sicherer und ebenso wirksame Vektor Plattform für gen-Lieferung im Vergleich zu Integrase-kompetente Vektoren.
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Methodenartikel
Ein Protokoll für die Produktion der Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren für CRISPR/Cas9-vermittelte Gen Knockout in teilenden Zellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Lentivirale Vektoren sind eine ideale Wahl für die Bereitstellung von gen-Bearbeiten von Komponenten auf Zellen aufgrund ihrer Fähigkeit zur stabil transducing einen breiten Bereich von Zellen und hohe Stufen der Genexpression zu vermitteln. Jedoch ihre Fähigkeit zur Integration in das Wirtsgenom Zelle erhöht das Risiko der insertional Mutagenität und damit Sicherheit Bedenken und schränkt ihre Verwendung in klinischen Umgebungen. Weiter, geliefert der anhaltenden Ausdruck der gen-Bearbeiten von Komponenten durch diese Integration zuständigen Lentivirale Vektoren (ICLVs) erhöht die Wahrscheinlichkeit von promiscuous Gene targeting. Als Alternative hat eine neue Generation von Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren (IDLVs) entwickelt, die viele dieser Bedenken befasst. Hier Produktionsprotokoll einer neuen und verbesserten IDLV-Plattform für CRISPR-vermittelten gen bearbeiten und Liste der Schritte bei der Reinigung und Konzentration von solchen Vektoren beschrieben und deren Transduktion und gen-Bearbeitung Effizienz mit HEK-293T Zellen zeigte. Dieses Protokoll ist leicht skalierbar und kann verwendet werden, um hohe Titer IDLVs generieren, die in der Lage, transducing Zellen in Vitro und in Vivo. Darüber hinaus kann dieses Protokoll für die Herstellung von ICLVs leicht angepasst werden.
Einleitung
Gen präzise Bearbeitung bildet den Grundstein biomedizinische Fortschritte, die die Entwicklung neuer Strategien zur Bekämpfung genetischer Krankheiten betreffen. An die Spitze der gen-Bearbeitungs-Technologien ist die Methode unter Berufung auf die Nutzung der clustered rregelmässig -IchNterspaced sHort pAlindromic REpeats (CRISPR) / Cas9-System, das zunächst identifiziert wurde als Bestandteil des bakteriellen Immunität gegen die Invasion der viralen Erbsubstanz (rezensiert in Referenzen1,2). Ein wesentlicher Vorteil des CRISPR/Cas9-Systems gegenüber ande....
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Protokoll
(1) Kultivierung HEK-293T Zellen und Aussaat zur Transfektion
Hinweis: Menschliche embryonale Nieren 293T (HEK-293T) Zellen wachsen in DMEM, hohe Glukose Medien mit 10 % bovine Kälberserum ergänzt mit Eisen und Wachstum Promotoren und 1 x Antibiotikum antimykotische Lösung ergänzt (100 X Lösung enthält 10.000 Einheiten Penicillin 10 mg Streptomycin und 25 µg Amphotericin B pro mL). Die Medien ist auch mit 1 X Natrium Pyruvat, 1 X nicht-essentielle Aminosäure-Mix und 2 mM L-Glutamin ergänzt (Lager 200 mM L-Alanyl-L-Glutamin Dipeptid in 0,85 % NaCl). Zellen sind in 100 mm Gewebekultur Platten kultiviert (ungefähre Wachstum Fläche beträgt 55 cm ....
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Ergebnisse
Validierung der Ko-Effizienz der IDLV-CRISPR/Cas9 Vektoren
Die Effizienz von CRISPR/Cas9-vermittelte gen Knockout Validierung verwendet wir GFP exprimierenden 293T Zellen als Modell. GLP +-Zellen wurden durch Transduktion von HEK-293T Zellen mit pLenti-GLP (vBK201a) bei einer MOI von 0,5 (Abb. 3 b, "keine-Virus" Panel) erzeugt. Die SgRNA-GLP/Cas9 all-in-One-Vektor-Kassette wurde in IDLV oder ICLV Partikel verpackt und die Effizienz der Pro.......
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Diskussion
IDLVs haben damit begonnen, als das Fahrzeug der Wahl für die in-Vivo -gen-Bearbeitung, vor allem im Zusammenhang mit genetischen Erkrankungen, weitgehend aufgrund des geringen Risikos Mutagenese diese Vektoren im Vergleich zu integrieren Lieferung Plattformen22 zugeordnet entstehen , 28. im aktuellen Manuskript, wollten wir ausführlich das Protokoll verbunden mit der Produktion von der verbesserten all-in-One IDLV-CRISPR/Cas9 System, das vor kurzem in u.......
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Offenlegungen
Patent-USC-499-P (1175) wurde von der University of South Carolina in Bezug auf die in diesem Manuskript beschriebenen Arbeiten eingereicht.
Danksagungen
Wir möchten die Abteilung für Neurobiologie, Duke University School of Medicine und Dekanat für Grundlagenforschung, Duke University bedanken. Wir danken auch Mitglieder des Duke viraler Vektor Kerns für Kommentare auf das Manuskript. Plasmid pLenti CRISPRv2 war Geschenk von Feng Zhang (Broad Institute). Die LV-Verpackungssystem einschließlich der Plasmide psPAX2, war VSV-G, pMD2.G und pRSV-Rev eine Art Geschenk von Didier Trono (EPFL, Schweiz). Gewähren Sie finanzieller Unterstützung für diese Arbeit von der University Of South Carolina School Of Medicine, zur Verfügung gestellt wurde, RDF18080-E202 (B.K).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Optima XPN-80 Ultrazentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | |
| Allegra 25R Tischzentrifuge | Beckman Coulter | 369434 | |
| xMark Microplate Absorbance Plate Reader | Bio-Rad | 1681150 | |
| BD FACS | Becton Dickinson | 338960 | |
| Inverses Fluoreszenzmikroskop | Leica | DM IRB2 | |
| 0,45-μ m Filtereinheit, 500 mL | Corning | 430773 | |
| Ultrazentrifugationsröhrchen mit konischem Boden | Seton Scientific | 5067 | |
| Konische Röhrchenadapter | Seton Scientific | PN 4230 | |
| SW32Ti Schwingrotor | Beckman Coulter | 369650 | |
| 15 mL konische Zentrifugenröhrchen | Corning | 430791 | |
| 50 mL konisch Zentrifugenröhrchen | Corning | 430291 | |
| Hochbindende 96-Well-Platten | Corning | 3366 | |
| 150 mm TC-behandelte Zellkulturschalen mit 20 mm Gitter | Corning | 353025 | |
| 100 mm TC-behandelte Kulturschale | Corning | 430167 | |
| 0,22 μ M Filtereinheit, 1 l | Corning | 430513 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (50) | Qiagen | 27104 | |
| Gewebekulturpipetten, 5 mL | Corning | 4487 | |
| Gewebekulturpipetten, 10 mL | Corning | 4488 | |
| Gewebekulturpipetten, 25 mL | Corning | 4489 | |
| Hämazytometer mit Deckgläsern | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| Name< | >Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
| <>Zellkulturreagenzien | |||
| Menschliche embryonale Nierenzellen 293T (HEK 293T) | ATCC | CRL-3216 | |
| 293FT Zellen | Thermo Fisher Scientific | R70007 | |
| DMEM, Medien mit hohem Glukosegehalt | Gibco | 11965 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04 | |
| Lösung, 100X | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| Natriumpyruvat | Sigma Aldrich | S8636-100ML | |
| Nicht-essentielle Aminosäure (NEAA) | Hyclone | SH30087.04 | |
| RPMI 1640 Medien | Thermo Fisher Scientific | 11875-085 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% | Gibco | 25300054 | |
| BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethansulfonsäure) | Sigma Aldrich | B9879 - BES Gelatine | |
| Sigma Aldrich | G1800-100G | ||
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
| >p24 ELISA-Reagenzien | |||
| sup>24 | Antikörper-NIH-AIDS-Forschungs- und Referenzreagenzienprogramm | 3537 | |
| HIV-1-Standards | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP968F | |
| Polyklonales Kaninchen Anti-p24 Antikörper | NIH AIDS Research and Reference Reagent | Program SP451T | |
| Ziege Anti-Kaninchen-Meerrettichperoxidase IgG | Sigma Aldrich | 12-348 | Arbeitskonzentration 1:1500 |
| Normales Mausserum, steril, 500mL | Equitech-Bio | SM30-0500 | |
| Ziegenserum, steril, 10mL | Sigma | G9023 | Arbeitskonzentration 1:1000 |
| TMB Peroxidase-Substrat | KPL | 5120-0076 | Arbeitskonzentration 1:10.000 |
| Name | <>Company< | strong>Katalognummer | >Kommentare |
| Plasmide | |||
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| lentiCRISPR v2 | Addgene | 52961 | |
| Name | Company | Katalognummer | Comments |
| Restriktionsenzyme | |||
| BsrGI | New England Biolabs | R0575S | |
| BsmBI | New England Biolabs | R0580S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | |
| PacI | New England Biolabs | R0547S | |
| SphI | New England Biolabs | R0182S |
Referenzen
- Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
- Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nat Rev Genet. 11 (3), 1....
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Nachdrucke und Genehmigungen
