Summary
-トランス・シスによる活性化と Notch 受容体の阻害の区別が困難な体内システムの複雑さ-配位子、それぞれ。ここでは、トランスにショウジョウバエノッチのバインディングの定性・半定量評価のための in vitro細胞凝集アッセイに基づくプロトコルを提案する-配位子 vs cis-配位子。
Abstract
Notch シグナルは、動物の開発および成人のメンテナンスに幅広く使用されて進化的に保存された細胞間コミュニケーション システムです。隣接セルからのリガンドと Notch 受容体の相互作用を誘導するシグナル伝達経路の活性化 (トランス-活性化)、同じ細胞から配位子との相互作用を阻害するシグナル伝達 (cis-抑制)。トランスとの間の適切なバランス-活性化とcis-抑制は、ノッチは動物の開発時にいくつかのコンテキストにおけるシグナル伝達の最適なレベルを確立するのに役立ちます。ノッチと多くの細胞タイプの有機配位子の重複式ドメインとフィードバック機構の存在のためトランス-シス対に与えられた翻訳後修飾の効果の研究-ノッチの相互作用とその配位子生体内で困難です。ここでは、ノッチのトランスとcis各リガンドへのバインドをノッチ経路修飾子をノックダウンの効果を評価する細胞凝集アッセイでショウジョウバエS2 細胞を使用するためのプロトコルについて述べる。S2 細胞安定または一過性発現するノッチ表現のベクトル (S2 デルタまたは S2 鋸歯) 各ノッチ リガンドを発現する細胞と混在しています。トランス-リガンドと受容体の結合は異型細胞集塊の形成に結果し、成る mL あたりの集計の数の点では測定 > 6 セル。Cisの抑制効果を検討する-配位子、ノッチとそれぞれの ligand の共発現 S2 細胞が S2 デルタまたは S2 鋸歯状細胞混在、集計数は上記のように定量化します。Cisの存在のため集計数の相対的な減少-配位子によりcis-リガンド-トランスの阻害を介した-バインド。これらの簡単な試その配位子にノッチのバインディングの遺伝的または薬理学的操作の効果の半定量的なデータを提供できるし、の生体内で効果の基礎となる分子メカニズムの解明に役立つことができます。Notch シグナルのような操作。
Introduction
正規 Notch シグナルは、隣接するノッチの受容体とそのリガンド1間の相互作用を促進する細胞の物理的な接触を必要とする短距離の細胞コミュニケーション メカニズムです。(信号受信細胞の表面上に存在) Notch 受容体リガンドとの相互作用 (信号送信の表面に細胞) Notch シグナルを開始し、トランスとして知られている-活性化2。その一方で、ノッチと同じセル内とそのリガンドの相互作用のノッチ経路の阻害につながるし、 cisとして知られている-抑制3。トランス- とcisのバランス-相互作用が最適なリガンド依存性 Notch4をシグナルのために必要です。ショウジョウバエは 4 ノッチの受容体と 5 配位子を持つ哺乳類とは異なり (デルタと Serrate) 2 つの配位子 1 つのノッチの受容体を持ちます [ジャグ 1 (JAG1)、JAG2、デルタのような 1 (DLL1) DLL3 および DLL4]5。このシンプルさを持つショウジョウバエモデルはノッチ-リガンド相互作用とその後 Notch シグナル経路の修飾子の効果の分析・研究に使いやすさを提供しています。(ショウジョウバエの翼の開発を含む)、動物の開発時に特定のコンテキストで両方cis- および-適切な Notch シグナルを達成し、運命1,6 セルの相互作用が関与しています。.シス-トランス対にこれらのコンテキストでノッチ経路の修飾子の効果を区別することが重要だ-ノッチとそのリガンドとの相互作用。
当社グループは、ショウジョウバエのノッチにキシロースを否定的と呼ばれる炭水化物残留物の添加が翼開発7を含む、特定のコンテキストで Notch シグナルを調節することを報告しました。シャムスの損失 (酵素、xylosylates ノッチ)「翼の静脈の損失」表現型7に 。最近では、クローン解析と遺伝子投与実験は、シャムスの損失がデルタ介したノッチ名指しを強化することを使用されました。シャムス変異体で強化された Notch シグナルが減少したcisの結果かどうかを区別するために-抑制または増加トランス-活性化、幼虫翅成虫原基におけるノッチ ligands の異所性発現の研究dpp GAL4ドライバーを使用して行われました。これらの実験は証拠を示唆シャムスがトランスを調節することを提供-ノッチcisに影響を与えずにデルタでノッチの活性化-8配位子による抑制。ただし、フィード バック規制と内因性リガンドの作用の異所性発現研究1,6,9の解釈を複雑にします。
ショウジョウバエS2 細胞10を用いて, この問題を解決するには、ノッチ-リガンド相互作用研究11,12の簡単な生体外でシステムが得られます。S2 細胞しない内因性 Notch 受容体とデルタ リガンド11を表現し、鋸歯状の13ノッチ リガンド凝集実験8に影響しない低レベルを表現します。したがって、S2 細胞をノッチおよび/または個々 の配位子 (デルタまたは Serrate) 専ら Notch 受容体またはその配位子の 1 つを表すセルを生成するまたはそれらの組み合わせによって、その安定または一過性を導入することができます。S2 のノッチを表現する細胞の受容体リガンド結合11,12,14を介した血液凝集体の形成に配位子を表現する S2 細胞結果を混ぜてください。集計の形成の定量化は、トランスの測定を提供します-ノッチとその配位子15 (図 1) との結合します。同様に、S2 細胞が cotransfected ノッチとデルタまたは Serrate 配位子とすることができます (すなわち cis-配位子)。Cis-これらのノッチ表現 S2 細胞における配位子はトランスとノッチのバインディングを破棄する-配位子との結果集計形成8,12,14を減少しました。Cisによる会合体形成の相対的な減少-配位子は、 cisの抑制効果の測定を提供します-ノッチとトランス間のバインディングに配位子-配位子 (図 2)。したがって、細胞凝集アッセイが活かされて -トランス・シスの xylosylation の損失の影響を調べるためのノッチとそのリガンドの相互作用。
ここでは、提案する詳細なプロトコル細胞凝集アッセイはトランスとノッチの結合を評価する目的のため-配位子とcisによるその阻害-ショウジョウバエS2 細胞を用いた配位子。例として、我々 はノッチ xylosylation のノッチとトランス間のバインディングへの影響を判断できるようにデータを提供-デルタ8。これらの簡単な試金はノッチ-リガンド相互作用の in vitroの半定量的評価を提供し、ノッチ経路修飾子の生体内での効果発現の分子機構を調べる。
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Protocol
1.シャムスノックダウンのため二重鎖 RNA (dsRNA) の準備
- Pcr の製品の
- DsRNA の合成に使用される DNA のフラグメントを増幅するのにテンプレート、次のプライマーのペアとして野生型黄色白(y w) ゲノム DNA とpAc5.1 EGFPを使用します。次の PCR の熱プロファイルを使用: 変性 (95 ° C、30 s)、焼鈍 (58 ° C、30 s) と拡張子 (72 ° C、1 分)。
緑色蛍光タンパク質を強化(EGFP) dsRNA のプライマー (5' 3')-
前方プライマー GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
逆プライマー GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG
シャムスdsRNA のプライマー (5' 3')-
前方プライマー TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
逆プライマー TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA
注: EGFP dsRNA はネガティブ コントロールとして使用されます。
- DsRNA の合成に使用される DNA のフラグメントを増幅するのにテンプレート、次のプライマーのペアとして野生型黄色白(y w) ゲノム DNA とpAc5.1 EGFPを使用します。次の PCR の熱プロファイルを使用: 変性 (95 ° C、30 s)、焼鈍 (58 ° C、30 s) と拡張子 (72 ° C、1 分)。
- ゲル - 製造元のプロトコルに従って商業ゲル精製キットを使用してポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) の製品を浄化します。
- 製造元のプロトコルに従って T7 プロモーターから転写できる商品を使用しての in vitro転写を実行します。
- 製造元のプロトコルに従って RNA 精製キットを使用して dsRNA を浄化し、-80 ° C で保存
- 次の手順 (1.5.1-1.5.5) を使用して、シャムスノックダウンの効率を評価します。
- 6 の各ウェルにも検定とプレート 5 x 105 S2 セルを使用して手動でセル 1 mL/シュナイダーの中のプレートを添加した 10% 胎仔ウシ血清 (FBS)、100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシンの数。
- 各ウェルにEGFP- またはシャムスdsRNA の 7.5 μ g を追加し、25 ° C 24 時間インキュベートします。
- 収穫制御 (EGFP dsRNA 処理) と 25 ° C で 5 分間 1,000 x g とによると RNA 抽出キットを使用しての RNA の隔離のためのプロセスでの遠心分離によってダウン ペレット化が続く穏やかなピペッティングによるシャムスdsRNA 扱われる S2 細胞製造元のプロトコル。
- 分光光度計およびプロセス 100 使用して RNA を定量化する商業 qPCR 試薬とプライマー ・ プローブと次の PCR の温度プロファイルを使用してステップ 1 qRT PCR のために RNA の ng: 変性 (95 ° C、15 s) と焼鈍/拡張 (60 ° C、1 分)。
注: は、プライマー ・ プローブ セットでこれらの研究でshams さんとコントロールの qRT PCR 実験用計測器については材料の表を参照してください。 - 2-16ΔΔCTメソッドを使用して相対シャムスの mRNA のレベルを計算します。
2. Notch 受容体とトランス間のバインドの評価-配位子
- 信号受信セル (Notch 受容体を発現する S2 細胞) を準備します。
- 診断を使用して手動でのセルをカウントし、FBS と 100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン 10% を添加したプレート 5 x 105 S2 とシュナイダーの中よく/1 mL で 6 ウェル プレートの各ウェルに安定した S2 ノッチ細胞。
注: S2 ノッチ細胞、ショウジョウバエゲノム リソース センター (DGRC) から利用可能なメディアで 200 nM メトトレキサートを追加します。0.5 mM メトトレキサート ストック溶液を調製するには、最初 1 M NaOH の 250 μ L の 20 mM メトトレキサート ソリューションを準備します。次に、このソリューションを 0.5 mM 1 M リン酸バッファー生理食塩水、-20 ° C でストアを希釈します。S2 ノッチ細胞にノッチ蛋白質の表現はpMTベクトルでショウジョウバエのメタロチオネインのプロモーターの制御下です。 - 各ウェルに dsRNA の 7.5 μ g を追加し、25 ° C 24 時間インキュベートします。
- 0.7 mM CuSO4ノッチの発現を誘導し、, 25 ° C で 3 日間を追加します。
メモ: CuSO4は、メタロチオネインのプロモーターによって制御タンパク質の発現を誘導するために使用されます。
- 診断を使用して手動でのセルをカウントし、FBS と 100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン 10% を添加したプレート 5 x 105 S2 とシュナイダーの中よく/1 mL で 6 ウェル プレートの各ウェルに安定した S2 ノッチ細胞。
- 信号を送る細胞 (S2 セル デルタまたは Serrate 配位子を表現する) を準備します。
- 106安定した S2 デルタまたは S2 鋸歯トムセル 1 mL で 6 ウェル プレートの各ウェルに x の検定とプレート 〜 5 を使用して手動でのセルをカウント/シュナイダーの中の井戸 10% 添加した FBS と 100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン。
注: は、メディアで S2 デルタ細胞の 200 nM メトトレキサートと S2 鋸歯トム細胞の 100 μ g/mL hygromycin を追加します。デルタと鋸歯状トムの式-鋸歯状12トマト タグ付きで機能的なバージョン- pMTベクトルでショウジョウバエメタロチオネインのプロモーター下にあります。 - 0.7 mM CuSO4リガンドの発現を誘導し、, 3 h の 25 ° C でを追加します。
- 106安定した S2 デルタまたは S2 鋸歯トムセル 1 mL で 6 ウェル プレートの各ウェルに x の検定とプレート 〜 5 を使用して手動でのセルをカウント/シュナイダーの中の井戸 10% 添加した FBS と 100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン。
- 信号の送信と受信の細胞間の集約を実行します。
- DsRNA 扱われる S2 を収穫 (コントロール) と穏やかなピペッティングしてプレート 2.5 x 10 の5細胞/ウェルで検定による手動カウント後 24 ウェル プレート S2 ノッチ細胞。
- シュナイダーの媒体の 200 μ L の総ボリュームで 5 × 105安定した S2 デルタまたは S2 鋸歯トムのセルを追加 (FBS、100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン 10% を添加した)。
注: 処理 (めっき、誘導、dsRNA の処理) を含むすべての S2 セルは、バイオ セーフティ キャビネットの下で行われていた。 - 150 rpm (942.48 rad/分) で軌道シェーカーにプレートを配置します。
- 1 分後、各ウェルの内容を混合し、集計の数を数えるために 20 μ L を取る。
- 同時に 10 倍の倍率 (PLL 10/0.25 目標) を使用して逆の化合物の顕微鏡下での代表的な画像を取る。
- 手動で集計をカウント (> 6 細胞) 診断。
- シェーカーにプレートを配置します。
- 画像の取得と 5 分後と 15 分間集計のカウントを繰り返します。
- トランスの定量化を実行-バインド。
- バック グラウンド コントロールとして S2 細胞と S2 デルタまたは S2 鋸歯トムと mL あたりの集計の数を計算します。
- S2 ノッチと S2 デルタまたは S2 鋸歯トムセル間の mL あたりの集計の数を計算 (トランスの大きさ-バインディング)。
3。ノッチとトランス間の結合阻害の評価- Cisによって配位子の配位子
- 信号受信セルを準備します。
- シュナイダーの中よく/1 mL で 6 ウェル プレートの各ウェルのプレート 5 x 105 S2 セルは、FBS と 100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン 10% を添加しました。
- 各ウェルに dsRNA の 7.5 μ g を追加し、25 ° C 24 時間インキュベートします。
- 共同 transfect dsRNA 処理細胞pBluescriptとpMT ノッチ11 (DGRC) だけで、 pMT ノッチとpMT デルタ11 (DGRC) またはpMT 鋸歯状の合計172 μ g/ウェルを使用して製造元のプロトコルに従って商業トランスフェクション試薬の濃度は DNA。
メモ: pBluescriptは、コントロールとして使用されます。共同 transfected セルは S2 ノッチと呼ばれる、& デルタ過渡または S2 ノッチ & 以下一時的な細胞を鋸歯状します。 - 25 ° C 24 時間で一過性トランスフェクション S2 細胞を孵化させなさい。
- 0.7 mM CuSO4ノッチとリガンドの発現を誘導し、, 25 ° C で 3 日間を追加します。
- 2.2 で説明されているように信号を送る細胞を準備します。
- セクション 2.3 で説明した信号を送信して信号受信セル間の集約を実行します。
- トランスの阻害を定量化- cisによってバインド-配位子。
- バック グラウンド コントロールとして S2 細胞と S2 デルタまたは S2 鋸歯と mL あたりの集計の数を計算します。
- Cisによって抑制の大きさを定量化-次のように配位子。
- S2 ノッチ過渡と S2 デルタ セルの集計の数としてAを定義します。
- S2 セル間集計数なノッチとデルタで一過性 co transfected Bを定義 (S2 ノッチ & デルタ過渡) と S2 デルタ細胞。
- 相対的な集合Cを計算 (B x 100) =/A
- Cis- 100 としてリガンド (デルタまたは Serrate) – によって抑制の大きさを計算するC。
注: 例として、相対的な集計が 45%、 cisの場合-配位子はトランスを阻害すると考えられている-55% によるバインドします。
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Representative Results
私たちの生体内観察提案、Notch シグナルによる利得の xylosyltransferase 遺伝子のシャムス結果の損失増加デルタ介したトランス-シスに影響を与えずにノッチの活性化-の抑制配位子8ノッチ。この概念をテストするための in vitro細胞凝集アッセイを行った。まず、S2 細胞におけるシャムス発現ノックダウンされたシャムスdsRNA を使用します。EGFP dsRNA は制御として使用されました。ノックダウン (KD) の効率は、リアルタイム PCR を用いて、808よりも大きいことが示されました。トランスと Notch 受容体の結合、-シャムス凝集アッセイを使用して KD を調べた時にデルタ。S2 ノッチと S2 デルタの細胞間の集約をそれらを混合後様々 な時点で調べた。普通 S2 細胞と S2 デルタと集計はバック グラウンド コントロールとして取られました。図 3番組別で形成された集計の数を示すグラフは時間混合後ポイント (1、5、15、30 分)。急激な増加は集計遅い速度で 30 分まで増加し続けた数 1 と 5 分、その後の集計の数が観察されました。したがって、1、5、15 分でイメージを作成した集計の形成、集計数が 5 分間混合後定量化されました。
図 4 a画像を示しています代表的な細胞の凝集アッセイシャムスNotch 受容体とトランス間のバインドの KD の効果を評価するために安定した S2 ノッチと S2 デルタ セル間のデルタ。画像は、3 時点 (1、5、15 分) で集計を表示します。バック グラウンド コントロール プレーン S2 細胞 (シャムスdsRNA) S2 デルタ細胞と混合。EGFP dsRNA 扱われる S2 ノッチ セルは、S2 デルタの細胞は、時間数の増加と集計を形作った。対照的に、シャムスdsRNA 処理 S2 ノッチ細胞形成、高速集計と集計を大きくされ (図 4 b) コントロールのものよりも数が大きい。これはシャムス レベルの高いトランスを高めると示される-デルタ8ノッチのバインディングします。
調べるかどうかシャムス調節cisの抑制効果-ノッチとトランス間のバインディングに配位子-デルタ、我々 は最初に信号受信ノッチとデルタの共同式を設立された細胞は、細胞の凝集を減らすことができますノッチとトランスを介する-デルタ。図 5 aは、S2 デルタと S2 ノッチ間形成する集合体の数を示すグラフを表示 & cisの量が異なると一時的な細胞をデルタ-デルタ。S2 細胞に均等に切り込みとデルタ式の構成を大幅に株これら細胞と S2 デルタと形成する集合体の数が減少します。また、 cisの量を減少させる-デルタ結果集計、数の増加、切欠きの範囲で示す/cis-これらのアッセイは、 cis 諸国で使用されるデルタ比-デルタはノッチの結合を阻害することができますとトランス-用量依存的にデルタ。S2 ノッチ以来 & デルタ一過性細胞表現ノッチとデルタ、S2 デルタ細胞とは独立してエネルギー集計を形成する可能性があります。酵母の形成を S2 ノッチ間集計する場合を調べる & デルタ一時的な細胞は、 cisの交絡要因をすることができます-阻害アッセイは、図 5 aに示すように、我々 は S2 細胞にこれらの細胞を混合し、定量化、集計します。図 5B S2 切欠きをもつ S2 細胞を混合後に形成された集計の数が表示されます & 様々 なノッチを表現するデルタ過渡セル/cis-デルタの比。図 5 aに示すように有性集計と比較してエネルギー集計の幾分小さい数が観察されました。これらの凝集アッセイが忠実にcisの影響を測定を終えて-ノッチとトランス間のバインディングにデルタ-デルタ。
シャムス cisの抑制能力に KD の次に検討-デルタ。この最後、S2 デルタと S2 ノッチ間の集約 & デルタ一時的な細胞を調べた。図 6A S2 デルタ細胞と S2 ノッチ過渡(コントロール) または S2 ノッチ間集計の代表的なイメージを示しています & デルタ一時的な細胞。S2 デルタ、 EGFP dsRNA 扱わ S2 ノッチ一過性細胞形成集計、時間、S2 デルタと安定した S2 ノッチ細胞 (図 4) の集計と同様に数が増えます。特に、S2 デルタと S2 ノッチを混合 & と等しい量でノッチとデルタ発現プラスミドの co transfected デルタ一過性細胞形成EGFP KD とシャムスKD、その減少を示唆している両方に以下の集計シャムスのレベルにcisの機能は影響しません-ノッチをブロックするデルタ/トランス-デルタ バインディング。良いシャムスKD 活動にcisの効果を評価するために-デルタ、 cisによって抑制の大きさ-デルタはノッチの範囲で相対集計割合を計算することによって測定した/cis-デルタ比セクション 3.4.2 で説明しました。相対的な凝集の定量化は、 EGFPとシャムスの dsRNA の治療 (図 6 b) に集計の匹敵する抑制を示した。一緒に、これらの観察は強く xylosylation の損失がトランスを促進することお勧め- cisに影響を与えずにバインド-抑制8、シャムスにみられる翼静脈損失の表現型の分子機構を提供して変異体。
細胞凝集試験トランスの模式図図 1:-バインド。0.7 mm CuSO4(S2 デルタまたは S2 鋸歯状) の表現する S2 細胞受容体 (S2 切り欠き) と配位子の誘導を示す図。両方 S2 細胞の誘導が続きます混合、集計をする傾向があります。これらの集計 (> 6 セル) イメージは、定量化します。この図の拡大版を表示するのには、ここをクリックしてください。
図 2: Cisを評価する細胞凝集アッセイの模式図-抑制。S2 細胞がpMT ノッチ(S2 N過渡)、 pMT ノッチ pMT デルタを導入させた一過性 (S2 ノッチ & デルタ過渡)、またはpMT ノッチとpMT 鋸歯(S2 ノッチ &鋸歯状過渡)。0.7 mM CuSO4と S2 デルタ細胞との混合による誘導後、集計 (> 6 セル) が量を示されます。Cisによる阻害-配位子はそれぞれのcisの有無で相対的な集計の割合の面で測定-配位子。Cisの効果-ノッチとトランス間のバインディングに配位子-鋸歯状 (図示せず) S2 鋸歯トム細胞一過性トランスフェクション細胞を混合することによって決定することができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: S2 ノッチと S2 または異なる時点で S2 デルタ細胞間集計します。グラフは、セルの指定された型の異なる時点 (1、5、15、30 分) で 1 mL あたりの集計の数を示しています。誤差範囲は、3 つの複製の平均 (SEM) の標準エラーを示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 細胞凝集によるノッチとトランス-デルタ。(A) イメージは異なる時点 (1、5、15 分) で集計を表示します。シャムスdsRNA 扱われる普通 S2 細胞と S2 デルタと集計はバック グラウンド コントロールとして取られました。シャムス- dsRNA 扱われる S2 ノッチ細胞数の増加を表示、集計のサイズに比べてEGFP dsRNA 処理 (制御) S2 ノッチ細胞 S2 デルタ細胞と混合した後。スケールバー = 100 μ m セル数 (B) 数量集計 6 セルより大きい集計の 5 分後。誤差範囲を示す SEM. * P < 0.01 (一方向の分散分析 (ANOVA))。独立した 3 つの繰り返しで 3 つの複製が行われました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: Cis-デルタはノッチとトランスによる細胞集合形成による阻害する-用量依存的にデルタ。(A) ノッチとcisの表現のベクトルの異なる比率で一過性トランスフェクション S2 デルタ細胞と S2 と (集計/mL の数) 集計を示しています-デルタ (1:0、1:1、もの 5、1:0.2 ともの 1)。誤差範囲を示す SEM. * P < 0.01 (一元)。独立した 3 つの繰り返しで 3 つの複製が行われました。Cisのレベルを減少させることに注意してください-デルタ減少cisの可能性が高いため、集計の増加の結果-抑制。一過性 S2 細胞内エネルギー集約 (1 mL あたりの集計の数) を示す (B) グラフはノッチとデルタ (1:0、1:1、もの 5、1:0.2 ともの 1) の異なる比率でトランスフェクションし、プレーン S2 細胞と混合します。誤差範囲を示す SEM. 集計数は有性集計 S2 デルタと S2 ノッチ間に形成される数よりもはるかに小さい & デルタ一時的な細胞。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6:シャムスのノックダウンにcisの阻害活性は影響しません-デルタ。(A) 表示、シャムス cisの KD の効果の代表的なイメージ-デルタ-ノッチ細胞凝集の阻害を介した/トランス-デルタ バインディング。画像は、異なる時点 (1、5、15 分) で集計を表示します。シャムスdsRNA 扱われる普通 S2 細胞と S2 デルタと集計はバック グラウンド コントロールとして取られました。安定発現に似て S2 ノッチ細胞、シャムスKD S2 デルタと S2 ノッチ コントロール (EGFP dsRNA 処理) と比較すると一時的な細胞の集合体の数の増加。Cisの共発現-1:1 の比率で切欠きをもつデルタシャムス扱わ dsRNA 細胞など同様コントロール (EGFP dsRNA 処理) の集計数に匹敵する減少につながった。スケールバー = 100 μ m の範囲 (B) グラフは、一時的なノッチとcisの示された比率 (1:0、1:1、もの 5、1:0.2 ともの 1) と co transfected S2 デルタ細胞と S2 と相対的な集計を示しています-デルタ。EGFPとシャムスの dsRNA 治療各ノッチで集計に匹敵する減少を表示/cis-デルタの比。ここで表示されるデータは、3 つの独立実験の代表です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
正規 Notch シグナルは、Notch 受容体とそのリガンド5間の相互作用に依存します。ノッチのパスに関するほとんどの研究は、主にノッチと隣接セル (トランス) の配位子の結合を検討、ノッチと同じ細胞リガンドが影響しあうか、およびこれらのいわゆるcis-ノッチの抑制的役割を果たす相互作用3,4をシグナリングします。したがって、正規の notch シグナルに及ぼす修飾子の基になるメカニズムを解読するノッチ-リガンド相互作用 (トランス・シス) の両方のタイプを確認する適切なです。ただし、動物の開発の間に多くの状況で、これらの相互作用とそのフィードバック調節の両方の関与は生体内研究1,6を複雑になります。この議定書でトランス配位子・ cisによるその阻害と Notch 受容体の結合を評価するショウジョウバエS2 細胞を用いた細胞凝集アッセイの in vitroの詳細な方法論を提供します。配位子。(Xylosyltransferase シャムス7,8) の受容体リガンド結合シグナリング ノッチの遺伝的修飾の効果を評価する方法論の活用を提案しました。
まず、安定した S2 デルタとEGFPまたはシャムスdsRNA 処理安定した S2 ノッチ セルのシャムスKD がトランスに及ぼす影響を検討する凝集アッセイを行った-バインド。シャムスdsRNA 処理普通 S2 細胞と S2 デルタ細胞の凝集は、バック グラウンド コントロールとして取られました。シャムスKD は、S2 ノッチとコントロールと比較して S2 デルタ セルの集計を強化されています。トランスに平行にプレーン S2 細胞とリガンドを運ぶ S2 と背景実験的コントロールの集計を行うことが重要です-実験をバインドします。内因性 Notch 受容体とデルタ リガンド11ショウジョウバエS2 細胞を表明しない、にもかかわらず、Serrate の低レベルの表現は S2 細胞13で報告されます。これを考慮し普通 S2 細胞細胞凝集アッセイでバック グラウンド コントロールとして使用されました。これらの細胞は、すべての集計 (図 5 b) を表示されませんでした。診断を使用して手動で集計をカウントします。集計数量の整合性を確保するため、混合セル人口の 10-20 μ L は、カウント用の井戸あたりに少なくとも 3 つの異なる領域からうち戻ことができます。これらのアッセイは、健康な成長 S2 細胞を必要とします。S2 の半付着性の性質を考慮した穏やかなのセル、セルを集めながらピペッティングおよび凝集アッセイ中揺れ定数は重要です。
私たちと他の人がトランス17,18,19、受容体リガンド結合の定量的評価の確立、水溶性リガンド-受容体結合の試金を使用している以前に、20. ノッチ リガンドトランスシャムスKD の影響を調べるため凝集アッセイは半定量的なので水溶性リガンド結合アッセイを行ったまた-バインド。凝集アッセイ8から得られた観測結果をトレンドに類似していた。これはトランスとノッチのバインディングの忠実な評価を証明-配位子細胞集合の試金を使用して。粒の形成は受容体リガンドの読み出しが、Notch 受容体とそのリガンドの表面の表現は、特定の修飾子によって影響を受ける場合それは複雑なすることができます。これは、集計フォーメーションの変更が変更された受容体リガンド結合のため表面発現の変化か区別できない、細胞凝集アッセイの制限を示しています。したがって、凝集アッセイに並行して、各修飾子のノッチとリガンドの発現に及ぼす必要があります S2 細胞でテストされます。私たちの研究においては、表面レベルのノッチとデルタだったシャムスdsRNA 扱われる S2 セル8では影響を受けません。
トランスの抑制を検討する- cisの添加により結合-S2 デルタ細胞とEGFP シャムスのリガンド、凝集アッセイを行った dsRNA 扱われる S2 ノッチ & デルタ一時的な細胞.これらの細胞間に形成される集計の数は、S2 デルタ細胞と非定常S2 ノッチと形成する集合体の数と比較されました。集計数の相対的な減少の計算し、 cisによって抑制の大きさの指標として使用される-デルタ。制御実験を示したそのcis-配位子を示すノッチの堅牢かつ用量依存性の抑制/トランス- cisにノッチのやや広い範囲上のデルタ結合-配位子の比率 (1 に 1:1) 8(図 5 a).1:1 の比率は、 cisの最強程度の結果-抑制とcisの相対レベルを下げる-デルタは、 cisを弱体化-抑制。したがって、この比の範囲の内で KD 実験を行った。注記のうち、Notch 受容体の量と transfected DNA の合計量は、すべての実験で一定を保たれました。これは粒の形成はcisの活動によって主に影響を受けることにより、-配位子によって変わらない細胞にノッチ式のレベルと。
ノッチとcisの共同式以前示された-S2 細胞における配位子がエネルギー集計14の形成につながることができます。似ているかどうかを調べる S2 ノッチ間のエネルギー集計 & デルタ過渡または S2 ノッチ & 鋸歯状一時的な細胞は、 cis 諸国における集計数量の解釈を妥協できる-配位子研究S2 ノッチ間コントロール凝集アッセイを行った & デルタ過渡とプレーンの S2 細胞。これらの実験で使用される S2 細胞数はcis 諸国で使用されている S2 デルタ細胞と同じ-デルタ実験。いくつかの酵母凝集が観察されたが、定量化結果集計貢献 S2 ノッチ間有性の集計と比較して総集計の割合が低いことを示した & 細胞 (デルタ過渡と S2 デルタ図 5 b)。Cis 諸国における集計の数の変化を終えて-リガンドの試金、主に、 cisの抑制効果-ノッチとトランス間のバインディングに配位子-デルタ。
要約すると、このプロトコルで凝集アッセイトランス-シスの半定量評価のための簡単でわかりやすい方法を提供する-Notch 受容体とそのリガンドとの相互作用。これらの試ノッチ リガンド結合の in vitro遺伝的または薬理学的切り込み経路の修飾子の効果を検討するため、したがって、これらの修飾子の体内影響ワンランク上の基になるメカニズムを解明を助けることができます。シグナリング。
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Disclosures
著者は利害の対立があります。
Acknowledgments
著者は NIH/日の出からのサポートを認める (HJN、R01GM084135) 水谷糖質科学 (HJN にグラント #110071) トム V. Lee を議論と、アッセイの提案に感謝している財団と Spyros Artavanis-Tsakonas、ヒューゴ ・ Bellenロバート ・ フレミング、ケン アーバイン校とプラスミドのセルラインショウジョウバエゲノム リソース センター (DGRC)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified | Lonza | 04-351Q | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare lifescience | SV30010 | |
| CELLSTAR 6 well plate | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| CELLSTAR 24 well plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| VWR mini shaker | Marshell Sceintific | 12520-956 | |
| Hemocytometer | Fisher Sceintific | 267110 | |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| MEGAscrip T7 Transcription Kit | Ambion | AM1334 | |
| Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit) | Zymo Research | R1054 | |
| VistaVision Inverted microscope | VWR | ||
| 9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software | AmScope | MU-900 | Image acquisition using ToupView software |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | |
| Fetal Bovine Serum | GenDepot | F0600-050 | |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | HY068-L6 | |
| Copper sulphate | Macron Fine Chemicals | 4448-02 | |
| S2 cells | Invitrogen | R69007 | |
| S2-SerrateTom cells | Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013) | ||
| S2-Delta cells | DGRC | 152 | |
| S2-Notch cells | DGRC | 154 | |
| pMT-Delta vector | DGRC | 1021 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pMT-Serrate vector | Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003) | ||
| pMT-Notch vector | DGRC | 1022 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pAc5.1-EGFP | Gift from Hugo Bellen | ||
| TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit | Applied Biosystem | 1611091 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams) | Applied Biosystem | Dm02144576_g1 | with FAM-MGB dye |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32) | Applied Biosystem | Dm02151827_g1 | with FAM-MGB dye |
| Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystem | 4351405 | 96-well Block module |
References
- de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing. Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).
- Fortini, M. E. Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation. Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).
- del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling. Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).
- Sprinzak, D., et al. Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states. Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).
- Kopan, R., Ilagan, M. X. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
- Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis. Development. 124 (17), 3283-3291 (1997).
- Lee, T. V., et al. Negative regulation of notch signaling by xylose. PLoS Genet. 9 (6), e1003547 (2013).
- Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila. PLoS Genet. 13 (4), e1006723 (2017).
- Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila. Development. 125 (22), 4531-4540 (1998).
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27 (2), 353-365 (1972).
- Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
- Fleming, R. J., et al. An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling. Development. 140 (9), 2039-2049 (2013).
- Saj, A., et al. A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network. Dev Cell. 18 (5), 862-876 (2010).
- Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila. Dev Dyn. 239 (3), 798-805 (2010).
- Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling. J Cell Biol. 167 (6), 1217-1229 (2004).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe. J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).
- Acar, M., et al. Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling. Cell. 132 (2), 247-258 (2008).
- Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions. Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).
- Yamamoto, S., et al. A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands. Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).
