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Methodenartikel

Vergleichbare Decellularization von fetalen und adulten Herzgewebe Explantaten als 3D-ähnliche Plattformen für In-vitro-Studien

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DOI:

10.3791/56924

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21. März 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 2INEB - Instituto de Engenharia Biomédica, Universidade do Porto, 3Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar (ICBAS), Universidade do Porto, 4Gladstone Institute of Cardiovascular Disease, 5Faculty of Medicine, University of Porto, 6University of California San Francisco

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Erratum-Hinweis

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Zusammenfassung

Die kardiale extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein komplexes Netzwerk von Molekülen, die Schlüsselprozesse in Geweben und Organen zu orchestrieren, während dauerhafte physiologische Umbau lebenslang. Standardisierte Decellularization der fetalen und adulten Herzen ermöglicht vergleichende experimentelle Studien der beiden Gewebe in einem 3D Kontext durch die Erfassung von native Architektur und biomechanischen Eigenschaften.

Zusammenfassung

Aktuelle Kenntnisse der extrazellulären Matrix (ECM)-Zell-Kommunikation führt zu großen zweidimensionalen (2D) in-vitro-Kultur Studien wo ECM-Komponenten als eine Oberflächenbeschichtung präsentiert werden. Diese Kultur-Systeme bilden eine Vereinfachung der komplexen Natur des Gewebes ECM, die biochemische Zusammensetzung, Struktur und mechanischen Eigenschaften umfasst. Um die Gestaltung der kardialen Mikroumgebung ECM-Zell-Kommunikation besser zu emulieren, entwickelten wir ein Protokoll, das für die Decellularization des gesamten fetalen Herzens ermöglicht und Erwachsenen linke Herzkammer Gewebe explants gleichzeitig für vergleichende Studien. Das Protokoll kombiniert die Verwendung von hypotone Puffer, ein Waschmittel von anionischen Tensiden Eigenschaften und DNase-Behandlung, ohne spezielle Fähigkeiten oder Ausrüstung. Die Anwendung der gleichen Decellularization Strategie in Gewebeproben von Themen der unterschiedlichen Alters ist ein alternativer Ansatz zur vergleichende Studien durchführen. Dieses Protokoll ermöglicht die Identifikation von einzigartigen strukturelle Unterschiede in fetalen und adulten kardiale ECM Mesh und biologische zelluläre Reaktionen. Darüber hinaus die hierin Methodik zeigt eine breitere Anwendung erfolgreich in anderen Geweben und Arten mit kleineren Anpassungen, wie z. B. im menschlichen Darm Biopsien und Maus Lungenkrebs angewendet.

Einleitung

Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein dynamisches Netzwerk von Molekülen, die wichtige zelluläre Prozesse, nämlich Schicksal-Entscheidung, Proliferation und Differenzierung1,2zu regulieren. Die Untersuchung der Zelle-ECM Interaktionen trat hauptsächlich in zweidimensionale (2D) in-vitro-Kulturen beschichtet mit ECM-Komponenten, die darstellen, einer Vereinfachung der native ECM Unterkünfte gefunden in Vivo. Decellularization erzeugt azellulärer 3D-wie ECM-Bioscaffolds, die die extrazelluläre Architektur und Zusammensetzung des nativen Gewebe und Organe3,4weitgehend zu bewahren. Neben seiner Tätigkeit als bioaktive Scaffolds für das Tissue Engineering, entstehen decellularized 3D ECM Biomaterialien als neuartige Plattformen Zelle-ECM Biologie zu bewerten, dass Parallel der in-vivo-Umgebung.

Bewertung der differenziellen Rolle der ECM-Komponenten unterschiedliche Gewebe, Organe und Alter profitieren mit dem Einsatz von ähnliche Protokolle native Bioscaffolds zu erzeugen. Im Herzen entwickelten wir ein vielseitiges Protokoll für Decellularization der fetalen und Erwachsenen stammenden Proben als ein alternativer Ansatz zur vergleichende Studien über die Orgel Mikroumgebung durchführen. Mit dieser Methodik, wir erfasst die native kardiale Mikroumgebung und zeigte, dass fetale ECM Wiederbesiedlung Mehrertrag von Herzzellen5fördert. Decellularization legte weitere Identifizierung ansässigen struktureller Unterschiede zwischen embryonalen und adulten ECM auf der Ebene der Keller Lamina und Pericellular Matrix-Netz-Anordnung und Faser Zusammensetzung5. Vor dieser Arbeit wurde Direktvergleich der Gewebe in den verschiedenen ontogenic Phasen mit dem gleichen Decellularization Ansatz nur für Rhesus-Affen Nieren und Nagetier Herzen berichtet. Eine begrenzte Anzahl von Studien berichten darüber hinaus fetalen Gewebe/Organ Decellularization per se5,6,7. Dies wurde erreicht mit SDS als einen einzigartigen Decellularization-Agent; Allerdings dienten verschiedene SDS-Konzentrationen für die Decellularization von fetalen und adulten Herzgewebe7,8. SDS ist eines der effektivsten Ionischen Reinigungsmittel für die Abfertigung der zytoplasmatischen und nuklearem Material, und am meisten benutzt in den Decellularization der verschiedenen Gewebe und Proben9,10. Lösungen mit hohen Konzentrationen von SDS und längere Exposition wurde mit Protein-Denaturierung, Glykosaminoglykan (GAGs) Verlust und Störung der Kollagen Fibrillen10,11, korreliert und somit eine Gleichgewicht zwischen Erhaltung und Zelle entfernen ECM ist notwendig. Um das gleiche Verfahren auf fetalen und adulten Herzgewebe anzuwenden, das Protokoll beschriebenen gliedert sich in drei aufeinander folgenden Schritten: Zell-Lyse durch osmotischen Schock (hypotone Puffer); Solubilisierung von Lipid-Protein und DNA-Protein-Protein-Protein Interaktionen (0,2 % SDS); und nuklearen Materialabtrag (DNase-Behandlung).

Unser Protokoll zeigt mehrere Vorteile: ich) die Möglichkeit, gleichwertige Decellularization der altersspezifischen kardialen Gewebe durch die Anwendung der gleichen Decellularization-Strategie; (II) keine Anforderungen für spezielle Methoden oder Geräte; (III) Anpassung an andere Gewebe und Arten bereit, wie sie erfolgreich mit geringfügigen Änderungen im menschlichen Darm Biopsien12 und Maus Lunge13angewendet wurde; und vor allem iv) ECM biomechanische Eigenschaften und ermöglicht die Montage von 3D-ähnliche organotypischen Kulturen, dass mehr genau die molekularen Eigenschaften der nativen Gewebe Mikroumgebung imitieren ansprechen können.

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Protokoll

Alle beschriebenen Methoden wurden genehmigt durch die i3S Tier-Ethik-Kommission und Direção-Geral de Veterinária (DGAV) und sind im Einklang mit dem Europäischen Parlament Richtlinie 2010/63/EU.

1. Vorbereitung der Decellularization Lösungen

Hinweis: Alle Decellularization Lösungen sollten durch einen 0,22-μm-Membranfilter gefiltert und gespeichert für maximal 3 Monate, außer anders angegeben.

  1. Für 1 X PBS: Mix 8 g NaCl, 1,01 g Na2HPO4 KCl, 200 mg und 200 mg KH2PO4 mit 900 mL entionisiertem Wasser (VE-Wasser). Stellen Sie Lösung pH 7,5 und die endgültige Lösung Volumen bis 1 L. Filter, Autoklaven und laden die Lösung bei Raumtemperatur (RT).
  2. Für hypotone Puffer (10 mM Tris, 0,1 % EDTA): 1,21 g TrisBASE und 1 g EDTA in 900 mL entionisiertem Wasser auflösen. Lösung pH bis 7.8 mit NaOH/HCl und das endgültige Lösung Volume 1 L. Filter anpassen, durch Autoklaven sterilisieren und Lagerung bei RT
  3. Für 0,2 % SDS-Lösung (0,2 % SDS, 10 mM Tris): 0,6 g TrisBASE und 1 g Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) in 400 mL DI Wasser hinzufügen und rühren bis zur vollständigen gelösten Auflösung bei 60 ° C. Lassen Sie Lösung auf RT Adjust Lösung pH bis 7,8 und die endgültige Lösung Volumen 500 mL abkühlen. Lösung durch Filtration zu sterilisieren.
    Hinweis: Die SDS-Lösung sollte vor dem Gebrauch vorbereitet werden. Filterlösung erst nach vollständiger SDS Auflösung, sonst werden die SDS unlösliche Partikel den Filter, ändern die Endkonzentration von SDS und folglich beeinflussen Gewebe Decellularization Effizienz sättigen.
  4. Für hypotone Waschpuffer (10 mM Tris): 1,21 g des TrisBASE in DI 900 mL Wasser mischen. Lösung pH bis 7,8 und der letzte Band, 1 L. Filter anpassen, durch Autoklaven sterilisieren und Lagerung bei RT
  5. Für die DNase-Behandlung (20 mM Tris, 2 mM MgCl2, 50 U/mL DNase): 2,42 g TrisBASE und 2 mL 1 M MgCl2 in 900 mL VE-Wasser auflösen. PH bis 7,8 und die endgültige Lösung Volume 1 L. Filter anpassen und Lösung von Autoklaven sterilisieren. Lösung bei RT hinzufügen DNase speichern ich (50 U/mL) vor dem Gebrauch.
  6. Für DNase Lager ich Lösung: einen DNase-Puffer mit 50 % Glycerin, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM MgCl2, Vorbereitung und Anpassung an eine endgültige Lösung-Volumen von 10 mL mit VE-Wasser. In einem Laminar-Flow-Haube hinzufügen der DNase I Pulver auf die DNase-Puffer und vorsichtig mischen, bis zur vollständigen Auflösung. Lösung durch 0,22-μm-Filter zu sterilisieren. 1 mL Aliquote Vorbereitung und Lagerung bei-20 ° C.

(2) Gewebe Ernte und Kryokonservierung

  1. Schwangere Weibchen 18 Tage der Schwangerschaft (E18 Föten) über CO2 Erstickung einschläfern. Führen Sie einen Kaiserschnitt auf die Weibchen mit einer chirurgischen Schere und sammeln Sie die uterine Hörner tragen die fetalen Mäuse auf eine Petrischale mit eiskalten 1 X PBS zwei gezahnte Pinzette mit gebogenen Spitzen (eine Pinzette zu jedem Horn-Ende).
    1. Öffnen Sie die uterine Hörner und die Fruchtblase, die Föten zu isolieren. Übertragen Sie die Föten auf eine neue Petrischale mit eiskalten 1 X PBS um sie zu betäuben und mit einer Schere zu enthaupten.
    2. Einschläfern Sie ca. 7-8 Wochen alt männliche C57BL/6 Mäusen mit CO2 Erstickung. Führen Sie einen Schnitt auf jeder Maus-Truhe und sammeln Sie Herzen zu.
    3. Kurz spülen Sie fetalen und adulten Herzen mit Eis kalt 1 X PBS.
  2. Entfernen Sie die Vorhöfe des Erwachsenen Herzens mit Hilfe eines Skalpells. Führen Sie einen Schnitt auf der rechten Herzkammer und entfernen Sie ihn mit gerade kleine Schere. Setzen Sie die innere Wand des linken Ventrikels durch das Septum entfernen. In eine neue Petrischale Teilen der linken Herzkammer frei-Wand in Längs-Streifen mit 2 mm Dicke und Entfernen des papillären Muskels mit einem Skalpell und gezahnte Pinzette mit gebogenen Spitzen.
    1. Verbrauchsteuer kleine Gewebe Explantaten mit Hilfe eines Skalpells mit einem 2 x 2 mm-Raster (ausführliche Beschreibung in ergänzende Abbildung 1-5). Kurz spülen Sie Gewebe Explantaten mit 1 X PBS.
  3. Autoklaviert 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen ~ 250 µL optimale Arbeitstemperatur (OCT) Verbindung hinzufügen. Gesamte fetalen Herzen und Erwachsenen kardiale Explantaten auf die Rohre mit 250 µL Okt. übertragen und friere sie mit Trockeneis gekühlt Isopentane und Store bei-80 ° C (bis maximal 6 Monate).
    Hinweis: Die Verwendung von Herzgewebe Explantate für mehr als 6 Monate kryokonserviert werden die Decellularization Effizienz, vor allem in den Erwachsenen Herz Gewebe Explantaten deutlich reduzieren.

(3) Gewebe decellularization

Hinweis: Cardiac Gewebe Decellularization erfolgt in einer Gewebekultur 24-Well-Platte mit einer Probe pro Bohrloch. 1 mL der Lösung jeder Decellularization wird für jeden einzelnen ebenfalls hinzugefügt. Alle Decellularization Maßnahmen sollte mit Agitation bei 165 u/min (Inkubator Shaker mit einem orbital Durchmesser von 20 mm) und bei 25 ° C durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben. Konsultieren Sie für weitere Informationen bitte das Schema auf Abb. 1A. Amphotericin B (z.B. Fungizone) und Gentamicin werden frisch alle Decellularization Lösungen vor Gebrauch, eine Endkonzentration von 2,5 μg/mL und 0,01 μg/mL, bzw. hinzugefügt. Die Menge an DNA in decellularized Geweben, die Probe Masse muss ermittelt werden, bevor Sie beginnen das Decellularization Protokoll beibehalten zu quantifizieren. Das DNA-Quantifizierung Protokoll ist weiter detailliert in Abschnitt 5.1.

  1. TAG 1
    1. -80 ° C Gefrierschrank entnehmen Sie Gewebeproben. Lassen Sie die 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen RT bis OCT teilweise geschmolzen wird. Übertragen Sie den Herzgewebe Block des Office-Anpassungstools noch gefrorenen auf einer Petrischale mit 1 X PBS.
    2. Nachdem das Office-Anpassungstool schmilzt, verschieben Sie das Herzgewebe, eine neue Petrischale mit 1 X PBS. Wash-Proben 1 x PBS und bei 60 u/min mit einem Shaker für 10-15 min. wiederholen mindestens zweimal.
    3. Fügen Sie 1 mL Hypotonische Puffer pro Bohrloch einer sterilen 24-Well-Zellkultur-Platte zu arbeiten. Eine Probe pro Bohrloch mit Hilfe der Zange zu übertragen.
    4. Verschieben Sie die Gewebekultur 24-Well-Platte mit den Proben in einen Inkubator Shaker bei 25 ° C und beginnen Sie 18 h Inkubation mit hypotone Puffer.
  2. TAG 2
    1. Bereiten Sie die 0,2 % SDS-Lösung, wie beschrieben in Abschnitt 1.3.
    2. Aspirieren der hypotone Puffer und die Proben mit PBS 1 X für 1 Stunde wiederholen Sie 3-Mal waschen.
      Hinweis: PAUSENPUNKT: Gewebe unter Decellularization mit 1 X PBS-Puffer bei 4 ° C für 18 h unter statischen Bedingungen gehalten werden.
    3. Entfernen Sie 1 X PBS zu, fügen Sie 1 mL frisch zubereiteten SDS-Lösung (Schritt 1.3) pro Bohrloch und inkubieren Sie Proben für 24 h.
      Hinweis: (CHECK POINT) Post SDS Inkubation, sicherzustellen, dass Proben eine weiße, transluzente aussehen weisen. Bei diesem Schritt SDS behandelt Proben in der DNA, zeigen eine Gelatine-Konsistenz getränkt sind. Entfernen Sie die SDS-Lösung langsam um Probe Adhäsion an der Pipettenspitze zu vermeiden.
  3. TAG 3
    1. Waschen Sie die Proben mit hypotone waschen Puffer (1 mL pro Well) für 20 min. Wiederholen Sie 3-Mal.
      Hinweis: Bei diesem Schritt ist es normal, einen Rückgang der Größe der Stichprobe durch die Entfernung der Zelle Reste zu beobachten. PAUSENPUNKT: Gewebe unter Decellularization kann in hypotone Waschpuffer bei 4 ° C für 18 h unter statischen Bedingungen gehalten werden.
    2. Fügen Sie 1 mL der Lösung der DNase-Behandlung pro Bohrloch und inkubieren die Proben für 3 h bei 37 ° c
    3. Aspirieren Sie die DNase-Behandlung-Lösung und waschen Sie die Proben mit 1 X PBS (1 mL pro Well) für 20 min. Wiederholen Sie 3-Mal. Durchführen Sie eine endgültige waschen mit 1 X PBS (1 mL pro Well) über Nacht bei RT und schütteln bei 60 u/min.
    4. (Checkpoint) Sicherzustellen Sie nach der DNase-Behandlung, dass die decellularized Proben die Gelatine-Konsistenz verloren haben.
      Hinweis: Nach der DNase-Behandlung, entfernen Sie und fügen Sie 1 X PBS sanft hinzu, da Proben leicht gefangen und an der Pipettenspitze befestigt werden.

4. Bewertung der decellularized Zelle Gewebeentnahme

  1. Beheben Sie die Proben in einer 24-Well-Zellkultur-Platte, 1 Exemplar pro Bohrloch, durch Zugabe von 1 mL frisch zubereiteten 10 % Formalin neutral Puffer mit 0,03 % wässrige Eosin für 2,5-3 h bei RT
    Hinweis: Eosin ergänzt das Fixiermittel, das decellularized Gewebe zu beflecken und Probe Visualisierung während schneiden und histologische Färbung zu erleichtern. Die Zugabe von Eosin, die weder mit dem histologischen Flecken noch mit Immunfluoreszenz-Techniken stört. Alternativ kann die Fixierung über Nacht bei 4 ° c durchgeführt werden
  2. Entfernen Sie die Fixativ Lösung, und fügen Sie 1 mL 1 X PBS, die Probe zu waschen.
  3. Kapseln von den festen Bioscaffolds in histologischen Verarbeitung Gel mit einem Einweg-Vinyl Probe Form gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  4. Entfernen Sie die Histologie-Gel mit der Probe vom Schimmel und Transfer zur Biopsie Verarbeitung/Embedding Kassetten mit Deckel eingebettet.
    Hinweis: Eine Alternative zum Gewebe einbetten in Histologie und Verarbeitung Gel ist, jede Probe in zwei Biopsie Schwämme mit kleinen Poren zu verarbeiten. Die Proben sollten in die Mitte der Biopsie Schwämme zur Erkennung aktivieren lokalisiert werden. Der Hinweis können einige Proben schwer zu lokalisieren, mit diesem Ansatz sein.
  5. Die Proben für Paraffin-Einbettung durch aufeinander folgende Inkubationen (30 min pro Lösung) in Reihe von Alkoholkonzentrationen (70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 100 %), isoparaffinische aliphatische Kohlenwasserstoff-Lösung (2 Inkubation Stationen) und Paraffin (2 Inkubation zu verarbeiten Stationen) bei 56 ° C.
  6. Montieren Sie die Proben in einem Paraffinblock.
  7. Schneiden Sie 3 μm dicken Paraffin Abschnitte über ein Mikrotom und sammeln Sie in den Abschnitten auf Glas-Objektträger.
  8. Trockenen Paraffin Abschnitte über Nacht bei 37 ° C.
    Hinweis: (PAUSE Punkt) Paraffin Abschnitte werden bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung gespeichert.
  9. Überprüfen Sie Protokoll Effizienz, durchführen Sie Hematoxilin und Eosin (H & E) und Masson Trichrome Färbung (MT), der decellularized Probe Abschnitte und Teile der nicht manipulierten Gewebe nach Herstellerangaben.
    Hinweis: H & E Färbung Flecken Zelle Kerne blau/lila, Zytoplasma rosa/dunkelrot und Kollagen blass rosa und MT Flecken Kerne schwarz, rot, Zytoplasma und Kollagen und Mucin blau. Effiziente Decellularization ist erreicht, wenn eine poröse Rosa (H & E, MT) und blau (MT) Netzwerk wird beobachtet, in Ermangelung eines nuklearen Flecks.

5. Bewertung der nuklearen Materialabtrag decellularized Gewebe

Hinweis: Die Quantifizierung von der DNA-Gehalt auf decellularized Gewebe muss im Vergleich zu den jeweiligen nicht manipulierten Gewebe durchgeführt werden.

  1. Wiegen Sie vor Decellularization einen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch auf eine hochpräzise digitale Waage. Übertragen Sie das Herzgewebe auf das Rohr, entfernen Sie den überschüssigen Betrag von 1 X PBS und wiegen Sie das Rohr mit den Proben. Berechnen Sie das Frischgewicht der Proben:
    Probieren SieNassgewicht = Gewicht Rohr mit Proben – Gewicht Leerrohr
  2. Decellularize Sie die Proben, wie in Schritt 3 beschrieben.
  3. Nach Decellularization sammeln Sie das decellularized Gewebe in einem Microcentrifuge Schlauch.
    1. Aufgrund der geringen Abmessungen und Masse des kardialen Einzelproben und Kit Spezifikationen, Schwimmbad decellularized Gewebe von jeder Probe Zustand (fetalen Herzens: 5 ganze Herzen; Erwachsene LV Explantaten: 15 Explantate). Führen Sie die gleiche Prozedur mit dem Gewebe nicht manipuliert.
      Bemerkung: (PAUSENPUNKT) der Proben kann bei-20 ° C gelagert, bis DNA-Extraktion und Quantifizierung durchgeführt werden.
  4. Schneiden Sie die nicht manipuliert und decellularized Gewebe in kleinen Explantaten mit Hilfe eines Skalpells in einer sauberen Petrischale.
    Hinweis: Verwenden Sie eine einzelne Skalpell und Petrischale für jede Probe. Mechanische Störungen der Proben mit einem Skalpell erleichtert ihre hinteren enzymatische Verdauung und anschließende DNA-Extraktion.
  5. Verwenden Sie für DNA-Extraktion Spin-Spalte basierend DNA Extraktion Verfahren nach den Anweisungen des Herstellers.
    1. Sammeln Sie die mechanisch getrennten Proben aus der Petrischale mit dem master Verdauung Puffer (Verdauung Puffer und Proteinase K) gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einer breiten Öffnung Pipettenspitze.
      Hinweis: Gewebe Lyse mit Proteinase K-Verdauung ist schneller in decellularized Proben. Um verschiedene Proben gleichzeitig zu verarbeiten, halten Sie lysierten Proben auf Eis, bis alle Proben lysiert werden, um Abbau zu minimieren. Vollständigen Beispielen Lyse wird zwischen 4-6 h erreicht.
    2. Fahren Sie mit dem Protokoll gemäß die Anweisungen des Herstellers.
    3. Um die Erträge der extrahierten DNA von decellularized und nicht decellularized Gewebeproben zu erhöhen, Eluieren Sie die DNA auf 25-50 μL und 100 μL der Elution Puffer bzw.. Sammeln der eluierten DNS und laden Sie die Spin-Spalte. Inkubieren Sie 1 min bei RT. Zentrifuge die Proben nach den Anweisungen des Herstellers.
      Bemerkung: (PAUSE Punkt) der DNA extrahiert aus den Proben kann Shop bei-20 ° C bis zur weiteren Verwendung.
  6. Quantifizieren Sie die extrahierte DNA aus den Proben mit einem fluoreszierenden DsDNA Detection Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
  7. Normalisieren der DNA-Gehalt als Nanogramm DNA pro Milligramm Erstmuster Frischgewicht (vor Decellularization).

6. Decellularized Gerüste Zelle Aussaat

Hinweis: Alle Lösungen/Reagenzien müssen steril sein und das gesamte Verfahren bei sterilen Bedingungen durchgeführt.

  1. Bereiten Sie 1 X DPBS mit 2,5 μg/mL Amphotericin B und 1 % P/S (Penicillin, 100 I.U; Streptomycin 100 µg/mL).
  2. 1 x PBS-Lösung aus der letzten Decellularization Waschschritt (Schritt 3.3.3) entfernen und Hinzufügen von 500 μL pro Well von der frisch zubereiteten 1 x DPBS/2,5 μg/mL Amphotericin B/1% P/S-Lösung. Proben bei 4 ° C von 1-7 Tage zu speichern.
    Hinweis: Lagerung der Proben bei 4 ° C ist wichtig, Sterilität zu erhalten.
  3. Fügen Sie P/S um basale Medien (ohne FBS und Ergänzungen), eine Endkonzentration von 1 % Zelle hinzu.
  4. Aspirieren Sie 1 x DPBS/2,5 μg/mL Amphotericin B/1% P/S-Lösung von den decellularized Proben. 500 μL pro Well der basalen Zelle media/1% P/S und lassen für 1 h bei 37 ° C oder bei 4 ° C für mehr als 1 h equilibrate Proben.
  5. Teilen Sie die Zellen von Interesse und bereiten Sie kleine Aliquote der Zellen an die Zelldichte gewünscht.
    Hinweis: Das decellularized Gewebe seeding muss unter dem stereoskopische Mikroskop und unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Zellkulturmedien sollte 1 % P/S.
  6. Pipette 3-4 μL des DPBS in die Mitte eines Brunnens einer 96-Well-Platte. Dünn und gerade Pinzette, übertragen Sie die decellularized Gerüste bis zum DPBS Tropfen, entfernen Sie die zusätzlichen DPBS durch Absaugen und stellen Sie sicher, dass die Probe nicht gefaltet oder faltig ist. Lassen Sie es trocken an den Rändern an der Oberfläche gut halten werden.
    Hinweis: Freistehende Gerüste haben niedrigeren seeding Effizienz.
  7. Fügen Sie Zellen durch Pipettieren der einzelligen Lösung langsam an den Rändern des Brunnens auf dem Schafott hinzu.
    Hinweis: zum Beispiel sind neonatalen Ratte Herzzellen mit bei einer Dichte von 7.500 Zellen/mm2 und verewigt Maus Lin− Sca-1+ kardialen Vorläuferzellen (iCPCSca-1) bei einer Dichte von 60-1.500 Zellen/mm2ausgesät. Passen Sie Zelldichte nach der experimentellen Logik an.
  8. Fügen Sie DPBS in die benachbarten Vertiefungen um schnelle Medien Verdunstung zu vermeiden.
  9. 24 Stunden post Zelle Aussaat, wenn Zelltyp verwendet die Gewebekultur Polystyrol-Platten (TCPS) eingehalten Bioscaffolds auf einen neuen Brunnen zu übertragen. Andernfalls ersetzen Sie das Medium, um nicht-anhaftende Zellen zu entfernen.
  10. Wechseln Sie sorgfältig das Medium nach spezifischen Anforderungen des Zelltyps.

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Ergebnisse

Die Decellularization Effizienz bewertet werden sollen, durch drei Haupttechniken: makroskopische Beobachtung, Histologie und DNA-Quantifizierung. Das makroskopische Erscheinungsbild der Proben Post-SDS-Behandlung wirkt sich indirekt die Wirksamkeit der Zelle entfernen. Nach der SDS Inkubation sollte Proben so durchscheinend bis weißlich (Abbildung 1) angezeigt werden. Fetal (E18) decellularized Gewebe durch eine stark durchscheinende Struktur auszeichnen, wä...

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Diskussion

Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein äußerst dynamischen und komplexen Geflecht von faserigen und Klebstoff Glykoproteinen, bestehend aus einem Reservoir von zahlreichen bioaktiven Peptiden und eingeschlossene Wachstumsfaktoren. Als die wichtigsten Modulator der Zelladhäsion, Zytoskelett Dynamik, Motilität/Migration, Proliferation, Differenzierung und Apoptose regelt ECM aktiv Zellfunktion und Verhalten. Zu wissen, dass zelluläre Verhalten in 2D und 3D Kulturen unterscheidet, wurden Anstrengungen unternommen, neuartig...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren sind verpflichtet, alle Mitglieder der Pinto Ó Labor für relevante kritische Diskussion. Diese Arbeit wurde unterstützt von Programa MIT-Fundação Para Ciência e Tecnologia (FCT) im Rahmen des Projekts "CARDIOSTEM-Engineered kardialen Gewebe und stammzellbasierte Therapien für Herz-Kreislauf-Anwendungen" (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S ist ein FCT Fellow [SFRH/BD/88780/2012] und M.J.O. ist FCT Fellow (FCT-Investigator 2012).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ausrüstung
Inkubierte TischschüttlerOrbitalschüttlerIKA:3510001Empfohlenes
Fluorimeter-Ausrüstung verfügbar
Digitale Gewichtswaage-Ausrüstung verfügbar
Inverses Mikroskop-Ausrüstung verfügbar
Zellkultur-Inkubator-Ausrüstung verfügbar
Kühlschrank (4º C)--Ausrüstungverfügbar
Tiefkühltruhe (-80 ° Gew.; C)--Ausrüstung verfügbar
Mikrotom--Ausrüstung verfügbar
Zirurgische Instrumente
Vannas Federschere - 2,5 mm CuttingEdge Fine Science Tools5000-08Empfohlen
Dumont 5 Feine Pinzette - Biologie/InoxFine Science Tools11254-20Empfohlen
Dumont 7 PinzetteFine Science Tools11272-30Empfohlene
Präparierschere, gerade-Werkzeug verfügbar
Pinzette, gezahnt, gebogen-Werkzeug verfügbar
Materialien24 Well-Platten
, einzeln verpacktVWR29442-044-
96 Well-Platten, einzeln verpacktVWR71000-078-Steriflip-GV
, 0,22µ m, PVDF, radiosterilisierteMilliporeSE1M179M6-Eppendorff
-Verfügbares Material
15 mL Falcon-RöhrchenFisher Scientific430791-50
mL Falcon-RöhrchenFisher Scientific
-/Einbettungskassetten mit DeckelElektronenmikroskopie Science70075-B-
Fisherbrand Superfrost Plus ObjektträgerThermo Fisher Scientific22-037-246-
Kryokonservierung von Gewebe
Shandon Kryomatrix-EinbettharzThermo Scientific
WASSERFREI 99+% (Isopentan)Sigma-Aldrich277258-1L-Trockeneis
- --
Decellularization
NaClBDH Prolabo27810.364-Na
2HPO4Sigma-AldrichS-31264-KH
sub>2PO4Sigma-AldrichP5379-100g-KCl
Sigma-AldrichP8041-1KG>
TrisBASESigma-AldrichT6066-500G-Natriumdodecylsulfat
Sigma-AldrichL-4390-MgCl
2subMERCK1.05833.1000-DNAse
IAplliChemA3778,0050-Gentamicin
Gibco15710-049-
FungizoneGibco BRL15290-026-Deionisiertes
Wasser (VE-Wasser)--
-Histologie
Prolabo361387P-Eosin
Y WÄSSRIGSurgipath01592EKann durch alkoholisches Eosin ersetzt
werden Richard-Allan Scientific HistoGel Gel für die ProbenverarbeitungThermo Fisher ScientificHG-4000-012-Ethanol
ethilischer Alkohol 99,5% beliebigAga4,006,02,02,00-Deionisiertes
Wasser (DI-Wasser)---Clear
Rite 3Richard-Allan Scientific6915-Shandon
HistoplastThermo Fisher ScientificRAS.6774006-
Kits
PureLink Genomic DNA Mini KitThermo Fisher Scientific
K182001-Quant-iT PicoGreen  dsDNA-KitInvitrogenP11496-
Zellkultur
DPBSVWR
100XLabclinicsL0022-100-Fungizone
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der interessierendenZelle---
430829-Vierkammer-Biopsie-Verarbeitungs 6769006-2-METHYLBUTAN<10 % Formalin-Neutralpuffer 45000-434-Penicillin-Streptomycin-Lösung

Referenzen

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  2. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).
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Nachdrucke und Genehmigungen

Erratum


Formal Correction: Erratum: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies
Posted by JoVE Editors on 4/23/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies.  The affiliations were updated.

The fourth affiliation was corrected from:

Gladstone Institutes, University of California San Francisco

to:

Gladstone Institute of Cardiovascular Disease

An additional affiliation was added for Todd C. McDevitt:

University of California San Francisco

Schlagwörter

Dezellularisierung von Herzgewebef tales Herzgewebelinker Ventrikel eines ErwachsenenBehandlung mit hypotonischem PufferSDS DezellularisationsmethodeDNase BehandlungsprotokollVorbereitung von Gewebest ckenParaffineinbettungsprozesshistologische SchnittanalyseBesiedlung von Zellger sten
Vergleichbare Decellularization von fetalen und adulten Herzgewebe Explantaten als 3D-ähnliche Plattformen für In-vitro-Studien
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