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Methodenartikel

Enzymatische Kaskade Reaktionen für die Synthese von chirale Alkohole Aminosäure L-Lysin

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DOI:

10.3791/56926

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16. Februar 2018

 ,  , 
1Génomique Métabolique, Genoscope, Institut François Jacob, CEA, CNRS, Univ Evry, Univ Paris-Saclay

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Chirale Amino-Alkohole sind vielseitige Moleküle für den Einsatz als Gerüste in der organischen Synthese. Ausgehend von L-Lysin, synthetisieren wir amino Alkohole durch eine enzymatische Kaskade Reaktion kombiniert Diastereoselective C-H-Oxidation katalysiert durch Dioxygenase gefolgt von Spaltung der Carbonsäure glyko-der entsprechenden Hydroxyl Aminosäure durch eine Decarboxylase.

Zusammenfassung

Amino-Alkohole sind vielseitige Verbindungen mit einer Vielzahl von Anwendungen. Beispielsweise haben sie als chirale Gerüste in der organischen Synthese eingesetzt. Ihre Synthese von herkömmlichen organischen Chemie erfordert oft mühsame mehrstufigen Syntheseverfahren mit schwierigen Steuerung der stereochemischen Ausgang. Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll zum enzymatisch Programmbenutzer Amino-Alkohole leicht verfügbaren L-Lysin in 48 h ab. Dieses Protokoll verbindet zwei chemische Reaktionen, die sehr schwer von herkömmlichen organischen Synthese durchzuführen sind. Bei der ersten Schritt, der Regio und Diastereoselective Oxidation von einer nicht aktivierten C-H-Bindung der Lysin ist-Seitenkette durch ein Dioxygenase katalysiert; eine zweite Regio und Diastereoselective Oxidation, katalysiert durch ein Regiodivergent-Dioxygenase führt zur Bildung von 1,2-Diole. Im letzten Schritt ist die carboxylic Gruppe der alpha Aminosäure durch eine Pyridoxal-Phosphat (PLP)-Decarboxylase (DC) abgespalten. Dieser decarboxylative Schritt betrifft nur die alpha Kohlenstoff der Aminosäure, Beibehaltung der Hydroxyl ersetzt Stereogenic Mitte in der Beta/Gamma-Lage. Die daraus resultierende Amino-Alkohole sind daher optisch bereichert. Das Protokoll wurde auf der Semipreparative-Skala-Synthese von vier Amino-Alkohole erfolgreich angewendet. Überwachung der Reaktionen wurde durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) nach Derivatisierung von 1-Fluor-2,4-Dinitrobenzene durchgeführt. Einfache Reinigung durch Festphasen-Extraktion (SPE) gewährt die Amino-Alkohole mit sehr guten Ausbeuten (93 %, > 95 %).

Einleitung

Trotz der Vorteile der Biokatalyse bleibt die Integration der biokatalytische Schritte in synthetischen Wege oder total biokatalytische Routen meist auf enzymatische kinetische Entschließungen beschränkt. Diese Routen haben weithin als ein erster Schritt in asymmetrischen Chemo-enzymatische Synthese, sondern Biokatalyse bietet viel mehr Möglichkeiten in der Funktionsgruppe Interconversions mit hoher Stereoselektivität1,2,3 . Darüber hinaus da biokatalytische Reaktionen unter ähnlichen Bedingungen durchgeführt werden, ist es daher möglich, Kaskade Reaktionen in einem ein-Topf-Mode4,5durchführen.

Chirale Amino-Alkohole sind vielseitige Moleküle für den Einsatz als Hilfsstoffe oder Gerüste in organische Synthese6. Die amino Alkohol glyko-wird häufig in sekundären Pflanzenstoffen und pharmazeutische Wirkstoffe (API) gefunden. Primären β-amino Alkohole sind leicht zugänglich von der entsprechenden α-Aminosäuren durch konventionelle chemische Synthese, sondern Zugang zu chirale Alkohole γ-amino oder sekundäre amino Alkohole erfordert oft mühsame synthetischen Wege zusammen mit empfindlichen Kontrolle über die Stereochemie7,8,9,10. Aufgrund seiner hohen Stereoselektivität vorsehen Biokatalyse eine überlegene Syntheseweg auf diese chirale Bausteine11,12,13,14.

Wir haben bereits berichtet, die Synthese von Mono - und di-hydroxy-L-Lysines durch enzymatische Hydroxylierung Diastereoselective katalysiert durch Dioxygenases des Eisens (II) / α-Ketoacid-abhängigen Cyclooxygenase Familie (αKAO) (Abbildung 1)15. Vor allem ausgehend von L-Lysin, KDO1 Dioxygenase katalysiert die Bildung von (3S) - hydroxy-Derivat (1), während (4R) - Derivat (2) entsteht durch die Reaktion mit KDO2 Dioxygenase. Aufeinanderfolgenden Regiodivergent Hydroxylations KDO1 und KDO2 führen zur Bildung von (3R, 4R) - Dihydroxy - L-Lysin (3) in optisch reinen Form. Jedoch behindert Bereich begrenzt Substrat dieser Enzyme ihre große Auslastung in der chemischen Synthese, vor allem in die Hydroxylierung von einfachen Aminen, da eine Carbonsäure glyko-in der α-Position der amino-Gruppe für Aktivität16unverzichtbar ist.

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Abbildung 1: biokatalytische Umbauten von L-Lysin. Umwandlung in (3S) - hydroxy - L-Lysin (1) katalysiert durch KDO1 Dioxygenase; (4R) - hydroxy - L-Lysin (2) katalysiert durch KDO2 Dioxygenase; und 3R, 4R- Dihydroxy - L-Lysin (3) durch Kaskade Reaktion katalysiert sukzessive durch KDO1 und KDO2 Dioxygenases. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Decarboxylierung ist eine häufige Reaktion im Stoffwechsel17. Insbesondere Aminosäure DCs (EG 4.1.1) sind Kofaktor-frei (Pyruvoyl-abhängig) oder PLP-abhängige Enzyme und katalysieren die Decarboxylierung von Aminosäuren in den entsprechenden Polyamine in Bakterien und höheren Organismen18,19 , 20 , 21 , 22. die Mono - Dihydroxy Verbindungen (Abbildung 3) 4–7, 10–11 entsprechen hydroxylierten Cadaverin, das Diamin durch Decarboxylierung von L-Lysin erhalten. Cadaverin ist ein wichtiger Baustein für die chemische Industrie, speziell eine Komponente von Polyamid und Polyurethan Polymere. Daher biobasierte Herstellung von diesem Diamin aus nachwachsenden Rohstoffen hat Aufmerksamkeit als Alternative zum Erdöl-basierten Weg, und verschiedene Mikroorganismen haben für diesen Zweck entwickelt worden. In diese Stoffwechselwege ist Lysin DC (LDC) das Schlüsselenzym. LDC ist ein PLP-abhängige Enzym, Alanin Racemase (AR) strukturelle Familie23angehören. PLP-Abhängige DCs (PLP-DCs) sind dafür bekannt, hochspezifische Substrat sein. Jedoch wenige Enzyme besitzen die Fähigkeit, leichten Promiskuität, aktiv in Richtung L-Ornithin und L-Lysin Aminosäuren, wie zum Beispiel das LDC aus Selenomonas Rumirantium (LDCSrum), die hat ähnlicher kinetische Konstanten für Lysin und Ornithin zu Decarboxylierung24,25. Dieses erweiterte Substrat Spezifität macht dieses Enzym einen guten Kandidat für die Decarboxylierung von Mono - und di-hydroxy-L-Lysin. Darüber hinaus untersucht, um DCs aktiv in Richtung der Hydroxyl-Derivate von Lysin finden, wir die genomische Kontext der Gene kodieren die αKAO Enzyme. In der Tat sind in prokaryotischen Genomen die Genen Codierung an der gleichen biosynthetische Bahn beteiligten Enzyme in der Regel in gen-Cluster Co lokalisiert. Gens KDO2 (von Chitinophaga Pinensis) fand man zusammen mit einem Gen Kodierung vermeintliche PLP-DC (Abbildung 2) lokalisiert. Im Gegensatz dazu ist keine gen-Codierung für DC gefunden worden, bei der Analyse von genomischen Rahmen KDO1 Dioxygenase. Das PLP-DC-Protein aus C. Pinensis (DCCpin) wurde daher als ein viel versprechender Kandidat ausgewählt, um die Decarboxylierung Schritt der Kaskade Reaktion katalysieren.

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Abbildung 2: genomische Kontext des KDO2-Gens in C. Pinensis. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Infolgedessen haben wir entwickelt enzymatische Kaskade Reaktionen, Dioxygenases und DCs, die Synthese von aliphatischen chiralen β - und γ-amino Alkohole aus Aminosäuren (Abbildung 3) zu erreichen. Wie bereits berichtet führt die C-H-Oxidation, katalysiert durch die αKAO die Hydroxyl ersetzt Stereogenic Mitte mit insgesamt Diastereoselectivity; die Cβ/γ Chiralität erhalten im decarboxylative Schritt betrifft nur das Cα Carbon der Aminosäure glyko-16.

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Abbildung 3: Analyse der retrosynthetischen. (A) Retrosynthesis β - und γ-amino Alkohole (R) - 1,5 - Diaminopentan-2-Ol (4) (5R) - hydroxy - L-Lysin, und (S) - 1,5 - Diaminopentan-2-Ol (5) und 1,5-Diaminopentan-3-Ol (6) aus L-Lysin. (B) Retrosynthesis β, γ und δ-amino Diole (2S, 3S) β - 1,5 - Diaminopentane-2,3-Diol (10) und (2R, 4S) - 1,5 - Diaminopentane-2,4-Diol (11) ab (5R)- Hydroxy-L-Lysin, und 2R, 3R- 1,5 - Diaminopentane-2,3-Diol (7) ab L-Lysin. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

L-Lysin und seine (5R) ab-hydroxy-Derivat, berichten wir hierin eine zwei/drei Schritt, einen Topf, enzymatischen Verfahren, die Kombination von Dioxygenases und PLP-DCs, das Ziel Amino-Alkohole zu erhalten. Vor der Synthese im Labormaßstab der Zielmoleküle, die Methode wurde entwickelt auf der analytischen Ebene Anpassung der Reaktionsbedingungen, z.B., die Enzymkonzentrationen erforderlich, um vollständige Umwandlung der Ausgangsstoffe; ermöglichen Wir präsentieren dieses Verfahrens sowie.

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Protokoll

(1) Enzympräparat

  1. Express und Proteine als zuvor beschriebenen26zu reinigen.
    Hinweis: Rekombinante Proteine wurden mit den folgenden Endkonzentrationen erhalten: αKAO von Catenulispora Acidiphila, UniProtKB-ID: C7QJ42 (KDO1), 1,35 mg/mL; ΑKAO von C. Pinensis, UniProtKB-ID: C7PLM6 (KDO2), 2,29 mg/mL; PLP-DCs von S. Rumirantium, UniProtKB-ID: O50657 (LDCSrum), freie Zelle extrahieren mit insgesamt Enzym 12,44 mg/ml; PLP-DC von C. Pinensis, UniProtKB-ID: C7PLM7 (DC-Cpin), 2,62 mg/mL.

2. Vorbereitung der Lösungen

Hinweis: Die folgenden Lösungen sind in entionisiertem Wasser bereit.

  1. Bereiten Sie 1 M HEPES-Puffer, pH 7,5; mit 5 M NaOH einstellen.
    Hinweis: Während der pH-Wert Einstellung Schritt tragen Sie Schutzhandschuhe, Schutzkleidung, Augenschutz und Gesichtsschutz (P280). Spülen Sie bei Berührung mit den Augen (P305 P351, P338) vorsichtig mit Wasser mehrere min. entfernen Kontaktlinsen wenn möglich. Weiter spülen und rufen Sie sofort einen poison Center oder Arzt (P310). Der P-Code bezieht sich auf den Sicherheitshinweis (Gefahrenklasse und Kategorie; siehe, z.B., pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/).
  2. Bereiten Sie 100 mM L-Lysin, 100 mM (5S) - hydroxy - L-Lysin, 150 mM α-Ketoglutaric Säure, 100 mM Natrium Ascorbat, 10 mM Ammonium Eisen(II) Sulfat Hexahydrat (Mohr Salz), 100 mM Pyridoxal-5-Phosphat (PLP) und 100 mM Dithiothreitol (DTT).
  3. Bereiten Sie 1 M, 2M und 6M Salzsäure (HCl) von einem 37 % HCl Lösung (ca. 12 M), Anschluss an die gleichen Sicherheitshinweise wie in 2.1 beschriebenen vor.
    Hinweis: Die Lösungen der α-Ketoglutaric Säure, Natrium-Ascorbat und Ammonium Eisen(II) Sulfat Hexahydrat müssen frisch am Tag der Benutzung erfolgen. Die Lysin-Lösung kann für mehrere Monate bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. Die PLP-Lösung kann für einen Monat bei 4 ° c aufbewahrt werden Die DVB-t-Lösung kann für einen Monat bei-20 ° c gelagert werden

3. analytische Waage Reaktionen

  1. Methodenentwicklung für die Decarboxylierung Reaktion (5R) - hydroxy - L-Lysin
    1. Fügen Sie 11 µL 1 M Lösung von HEPES-Puffer pH 7,5 (Endkonzentration 50 mM) zu einem 2 mL Reaktionscup. Fügen Sie 22 µL 100 mm (5S) - hydroxy - L-Lysin (Endkonzentration 10 mM), 2.2 µL 100 mm PLP (Endkonzentration 1 mM), und 2.2 µL 100 mm DTT (Endkonzentration 1 mM).
      Hinweis: Bei Reaktion mit LDCSrumist die Zugabe von DVB-t nicht erforderlich.
    2. Fügen Sie die gereinigte PLP-DC (Endkonzentration 0,1 mg/mL). Komplett mit H2O für ein Endvolumen von 220 µL.
    3. Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur mit einem geöffnetem Deckel im Freien, bei 300 u/min für 3 h.
      Hinweis: Schütteln das Reaktionsgemisch mit offenen Deckel unter freiem Himmel sorgt für eine gute Sauerstoffversorgung der Reaktionsmedien. Es entfällt daher Sauerstoff in den Reaktionsmedien Blasen wirft.
    4. Sammle 10 µL des Reaktionsgemisches nach der Reaktion-monitoring-Verfahren in Schritt 6 beschrieben analysiert werden. Die Proben sind vorzugsweise derivatisiert und unmittelbar nach der Probenahme analysiert.
  2. Methodenentwicklung für die enzymatische Kaskade Reaktion verbindet eine Hydroxylierung Schritt katalysiert durch αKAO mit Decarboxylierung katalysiert durch PLP-DC
    1. Fügen Sie 11 µL 1 m HEPES-Puffer pH 7,5 (Endkonzentration 50 mM) zu einem 2 mL Reaktionscup. Fügen Sie 22 µL 150 mm von α-Ketoglutaric Säure (Endkonzentration 15 mM), 5,5 µL von 100 mM von Natrium-Ascorbat (Endkonzentration 2,5 mM), 22 µL 10 mM von Mohr-Salz (Endkonzentration 1 mM), und 22 µL 100 mm L-Lysin (Endkonzentration 10 mM).
    2. Komplett mit H2O für ein Endvolumen von 220 µL, unter Berücksichtigung der Volumen der Enzymlösung in Schritt 3.2.3 hinzugefügt werden.
    3. Fügen Sie die erforderlichen gereinigten αKAO Enzym nach der gezielten Regioselectivity: KDO1 für Hydroxylierung in Position c-3 oder KDO2 für Position c-4 L-Lysin. Die Endkonzentration des gereinigten Enzyms (0,05-0,5 mg/mL) wurde festgestellt, um eine komplette Umwandlung in ca. 3 h zu ermöglichen.
    4. Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur mit einem geöffnetem Deckel im Freien, bei 300 u/min für 3 h.
    5. 2.2 µL von 100 mM von PLP hinzufügen (Endkonzentration ~ 1 mM) und 2.2 µL von 100 mM von DVB-t (Endkonzentration ~ 1 mM).
      Hinweis: Bei Reaktion mit LDCSrumist die Zugabe von DVB-t nicht erforderlich.
    6. Fügen Sie die gereinigte PLP-DC in einer Konzentration ermöglicht vollständige Umwandlung in 18 h: LDCSrum auf eine ungefähre Endkonzentration von 0,1 mg/mL für die Kaskade Reaktion mit KDO1 und DCCpin auf eine ungefähre Endkonzentration von 0,5 mg/mL für die Kaskade-Reaktion mit KDO2.
    7. Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur mit einem geöffnetem Deckel im Freien bei 300 u/min für 18 h.
    8. Führen Sie ein monitoring-Verfahren wie in Schritt 3.1.4.
  3. Methodenentwicklung für die enzymatische Kaskade Reaktion verbindet zwei Hydroxylierung Schritte katalysiert durch αKAOs mit Decarboxylierung katalysiert durch PLP-DC
    1. Führen Sie Schritte 3.2.1-3.2.2.
    2. Fügen Sie KDO1 auf eine Endkonzentration von 0,05 mg/mL. Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur mit einem geöffnetem Deckel im Freien, bei 300 u/min für 3h.
    3. Eine ungefähre Endkonzentration von 0,5 mg/mL, anhand der ursprünglichen Reaktionsvolumen fügen Sie KDO2 hinzu. Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur mit einem geöffnetem Deckel im Freien, bei 300 u/min für 18 h.
    4. 3.2.5 Schritt ausführen.
    5. Fügen Sie die gereinigten PLP-DC-DC-Cpin am eine ungefähre Endkonzentration von 0,5 mg/mL, mit der ursprünglichen Reaktionsvolumen berechnet. Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur mit einem geöffnetem Deckel im Freien, bei 300 u/min für 18 h.
    6. Führen Sie das monitoring-Verfahren wie in Schritt 3.1.4.

4. semi-präparative Eintopfreaktion biokatalytische

Hinweis: Die enzymatische Reaktionen erfolgen auf 0,1 Mmol L-Lysin in einer Open-Air-250 mL Glas Erlenmeyerkolben für ein Gesamtvolumen von 10 mL.

  1. Synthese von Monohydroxylated-Derivaten
    1. Fügen Sie 0,5 mL 1 M HEPES-Puffer, pH 7,5 (Endkonzentration 50 mM) in den Kolben. Fügen Sie 1 mL 100 mM L-Lysin (Endkonzentration 10 mM), 1 mL 150 mM α-Ketoglutaric Säure (Endkonzentration 15 mM), 0,25 mL 100 mM Natrium Ascorbat (Endkonzentration 2,5 mM), und 1 mL 10 mM Mohr-Salz (Endkonzentration 1 mM).
    2. Komplett mit H2O für ein Endvolumen von 10 mL, unter Berücksichtigung der Volumen der Enzymlösung in Schritt 4.1.3 hinzugefügt werden.
    3. Fügen Sie die erforderlichen gereinigten αKAO Enzym nach der gezielten Regioselectivity: KDO1 auf eine Endkonzentration von 0,075 mg/mL für Hydroxylierung in Position c-3 oder KDO2 auf eine Endkonzentration von 0,5 mg/mL für Position c-4 L-Lysin. Die Endkonzentration des gereinigten Enzyms war entschlossen, eine komplette Umwandlung in ca. 3 h zu ermöglichen.
    4. Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur bei 300 u/min, für die entsprechende Dauer. Wenn die Reaktionskontrolle zeigt eine abgeschlossene Hydroxylierung Reaktion (führen Sie die Schritte, die in Schritt 6 für die Reaktion, die Überwachung Protokoll detailliert), fahren Sie mit Schritt 4.1.5. Eine typische Reaktionszeit ist 3 h.
    5. Das Reaktionsgemisch αKAO 100 µL 100 mm PLP hinzufügen (Endkonzentration ~ 1 mM). Fügen Sie 100 µL 100 mm DTT (Endkonzentration ~ 1 mM), außer bei Verwendung von LDCSrum.
    6. Fügen Sie gereinigtes PLP-DC: LDCSrum auf eine ungefähre Endkonzentration von 0,05 mg/mL für die Kaskade Reaktion mit KDO1 oder DCCpin auf eine ungefähre Endkonzentration von 0,5 mg/mL für die Kaskade-Reaktion mit KDO2.
    7. Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur, 300 u/min, 18 h und direkt im Schritt 4.3 beschriebenen Schritte weiter.
  2. Synthese der Dihydroxylated Ableitung
    1. Fügen Sie 0,5 mL 1 M HEPES-Puffer, pH 7,5 (Endkonzentration 50 mM), 1 mL 100 mM L-Lysin (Endkonzentration 10 mM), 1 mL 150 mM α-Ketoglutaric Säure (Endkonzentration 15 mM), 0,25 mL 100 mM Natrium Ascorbat (Endkonzentration 2,5 mM) , und 1 mL 10 mM Mohr-Salz (Endkonzentration 1 mM). Komplett mit H2O für ein Endvolumen von 10 mL, unter Berücksichtigung der Volumen der Enzymlösung in Schritt 4.2.2 hinzugefügt werden.
    2. Eine Endkonzentration von 0,075 mg/mL KDO1 hinzufügen. Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur, bei 300 u/min für die entsprechende Dauer.
    3. Wenn die Reaktionskontrolle zeigt eine abgeschlossene Hydroxylierung Reaktion (siehe Schritt 6 für die Reaktion, die Überwachung Protokoll), fahren Sie mit Schritt 4.2.5. Eine typische Reaktionszeit ist 3 h.
    4. Fügen Sie 1 mL 150 mM α-Ketoglutaric Säure (Endkonzentration 15 mM), 0,25 mL 100 mM Natrium Ascorbat (Endkonzentration 2,5 mM), und 1 mL 10 mM Mohr-Salz (Endkonzentration 1 mM).
    5. Eine ungefähre Endkonzentration von 0,5 mg/mL, anhand der ursprünglichen Reaktionsvolumen fügen Sie KDO2 hinzu. Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur bei 300 u/min für 18 h.
    6. Wenn die Reaktionskontrolle zeigt eine abgeschlossene Dihydroxylation Reaktion (siehe Schritt 6 für die Reaktion, die Überwachung Protokoll), fahren Sie mit Schritt 4.2.7. Eine typische Reaktionszeit beträgt 18 h.
    7. Hinzufügen von 100 mM von DVB-t 100 µL (Endkonzentration ~ 1 mM), außer bei Verwendung der LDC-Srum.
    8. Fügen Sie die gereinigten DCCpin am eine ungefähre Endkonzentration von 0,5 mg/mL, mit der ursprünglichen Reaktionsvolumen berechnet.
    9. Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur bei 300 u/min für 18 h.
  3. Abschrecken
    1. Das Reaktionsgemisch indem man das Glas 250 mL Erlenmeyerkolben im Eisbad abkühlen.
    2. Fügen Sie sorgfältig über ca. 1 min., 0,25 mL 6 M HCl durch das abgekühlte Reaktionsgemisch manuell sanft schütteln. Befolgen Sie die gleichen Sicherheitshinweise wie in Schritt 2.1 beschrieben.
    3. Übertragung der saure Mischung in ein 50 mL konischen Boden Zentrifuge tube mit einem Glas Pasteurpipette ausgestattet mit einer Glühbirne, dann auf 1.680 x g und 4 ° C für 15 min zentrifugieren.
    4. Zurückziehen des Überstands und in einem 250 mL Rundboden Kolben beiseite stellen.
    5. Die konischen Boden Zentrifugenröhrchen mit Pellet fügen Sie 10 mL entionisiertem Wasser hinzu. Wirbel, die Pellets wieder auszusetzen.
    6. Zentrifuge bei 1.680 x g, 4 ° C für 15 Minuten.
    7. Zurückziehen des Überstands und fügen Sie es in der 250 mL Rundboden Kolben mit der ersten überstand (Schritt 4.3.4).
    8. Frieren Sie der gesammelten Überstände durch Eintauchen des Kolbens in flüssigem Stickstoff mit konstanter Hand wirbeln ein, und übertragen Sie die Flasche sofort auf vielfältige Benchtop Einfrieren-Trockner zu verhindern, dass das Material Auftauen.
    9. Nach Abschluss der Gefriertrocknung (über Nacht), entfernen Sie die Flasche aus der Freeze-Trockner.

5. Reinigung der Amino-Alkohole aus Rohöl enzymatische Reaktionsmischung

  1. Ionenaustausch-Harz
    1. Das gefriergetrocknete Produkt in den Mindestbetrag von wässrigen 0,1 M HCl (ca. 4 mL) auflösen bis feste Partikel nicht mehr für das nackte Auge sichtbar sind.
    2. Zustand eine Sulfonsäure Funktionsgruppe Kationenaustauschermembran Harz, in eine Glassäule (20 x 250 mm) 200-400 Mesh von eluierenden bei atmosphärischem Druck 1 M HCl (4 Spalte Bände) gefolgt von 0,1 M HCl (4 Spalte Bände; Spalte Volumen = 10 mL).
    3. Laden Sie die Probe sorgfältig an der Spitze des Harzes an den Wänden der Glassäule mit einer Mikropipette 1.000 µL. Spülen Sie die konischen Boden Zentrifugenröhrchen, die das Rohprodukt enthalten dreimal mit 1 mL 0,1 M HCl wässrigen Lösung pro waschen und die daraus resultierende spülen Volumes auf die Säule in der gleichen Weise zu laden.
    4. Eluieren mit einer nicht-linearen Farbverlauf: 4 Spalte Volumen von 0,1 M HCl, 4 Spalte Volumen Wasser, 4 Spalte Volumen von 5 % NH4OH, 4 Spalte Volumen von 10 % NH4OH, 4 Spalte Volumen von 15 % NH4OH, 4 Spalte Volumen von 20 % NH4OH , 4 Spalte Volumen von 25 % NH4OH und schließlich 4 Spalte Volumen von 28 % NH4OH.
    5. Die Reinigung mittels HPLC zu überwachen (siehe Schritt 6).
    6. Bündeln Sie die Fraktionen mit der Verbindung (NH4OH 20-28 %) und Gefriertrocknen Sie beschriebenen Schritte 4.3.8-4.3.9.
      Hinweis: Die Ionenaustausch Spalte kann nach der Elution mit entionisiertem Wasser zur Neutralisation der Elution Wasser (ca. 50 mL) gefolgt von Aufarbeitung von eluierenden mit 50 mL 1 M HCl wiederverwendet werden.
  2. SPE
    1. Lösen Sie die gefriergetrocknete Substanz in ca. 2 mL H3PO4/water (20 µL/mL).
    2. Statt einer gemischten Modus Kationenaustausch SPE 6 mL-Patrone auf eine Extraktion Verteiler angeschlossen ist eine Wasserpumpe. Zustand der Patrone durch Zeichnung durch 4 mL Methanol unter vermindertem Druck von dem Verteiler zur Verfügung gestellt. Equilibrate die Patrone von Zeichnung bis 4 mL H3PO4/water (20 µL/mL).
    3. Laden Sie die Probe auf die Patrone mit einem 1.000 µL Mikropipette an der Spitze des Harzes an den Wänden der Glassäule und spülen Sie das Fläschchen mit dem Produkt dreimal mit 0,75 mL H3PO4/water (20 µL/mL) pro Waschgang. Laden Sie die resultierende spülen-Lautstärke auf die Säule auf die gleiche Weise.
    4. Waschen Sie die Patrone mit der eluierenden unter vermindertem Druck, bereitgestellt durch das mannigfaltige, 4 mL 2 % HCOOH in Wasser, dann mit 4 mL Wasser. Eluieren mit einem Gefälle von NH4OH im Wasser (4 mL für jede Elution, ab 4 % NH4OH: 10 %, 15 %, 15 %, 20 % und 28 %).
    5. Überwachen Sie die Reinigung mittels HPLC analysiert jede Fraktion nach der Reaktion, die Überwachung Protokoll in Schritt 6 beschrieben. Halten Sie alle Fraktionen, die mit reinen gewünschte Ableitung nach ultravioletter (UV)-Chromatogramm und fahren Sie mit Schritt 5.2.6.
    6. Pool der Fraktionen mit der gewünschten Verbindung in eine 100 mL Runde untere Kolben, spülen Sie die Rohre mit den Fraktionen mit Wasser und 100 mL Spülung Volume hinzufügen runden unteren Kolben.
    7. Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck mit Drehverdampfer ausgestattet mit einem Thermostat Bad Wasserkocher bei 40 ° C und verbunden mit einer Vakuumpumpe auf 10 Mbar eingestellt.
    8. Lösen Sie der Feststoff in eine Mindestmenge an Wasser und übertragen Sie die Lösung in einer gewogenen 25 mL Runde untere Kolben. Spülen Sie die Flasche mit einem Mindestvolumen von Wasser, 25 mL Flasche spülen Volumen hinzu, und fahren Sie mit Schritt 5.2.9.
    9. Wiegen Sie das gereinigte Produkt und berechnen Sie die Ausbeute.
    10. Lösen Sie das gereinigte Produkt in das Mindestvolumen von 2M HCl auf, bis feste Partikel nicht mehr für das nackte Auge sichtbar sind und Gefriertrocknen Sie beschriebenen Schritte 4.3.8-4.3.9.
      Hinweis: Die Amino-Alkohole sind sensible Verbindungen und als deren Hydrochlorid Salze erhalten bleiben.

6. Reaktionskontrolle und Produktanalyse

  1. Derivatisierung der Substrate und Produkte vor der HPLC-Analytik
    Hinweis: Die Substrate und Produkte müssen als aromatische Derivate zu erhöhen Sie ihre UV chromatographische Ansprechempfindlichkeit derivatisiert. Wir haben 1-Fluor-2,4-Dinitrobenzene (DNFB). Jede Probe wurde unmittelbar nach Derivatisierung in der HPLC injiziert.
    1. Nehmen Sie 10 µL der enzymatischen Reaktion und Transfer nach einer 1,5 mL Reaktionscup. Fügen Sie 10 µL von 0,25 M Nahco33 wässrige Lösung, 100 µL Ethanol und 30 µL von 2,5 mg/mL DNFB-Lösung in Ethanol.
    2. Schließen Sie die Reaktionscup und schütteln Sie die resultierende Lösung für 1 h bei 65 ° C, bei 1.000 u/min. Stillen mit 10 µL 1 M HCl.
    3. Filtern Sie über einen 4 mm Durchmesser nicht sterile Spritze Filter mit einer 0,22 µm Pore Größe hydrophilen Polyvinylidene Fluorid (PVDF) Membran mit einer 1 mL Luer-Spritze.
  2. Nachverfolgung der Dioxygenase Reaktion mit jedem System in der Lage, derivatisierte Aminosäuren zu trennen. Dieses Protokoll beinhaltet UV-Detektion von Aminosäuren, die von den Dinitrobenzene (DNB) Chromophor Gruppe27derivatisiert.
    1. Passen Sie die HPLC mit C18 mit einer Trimethyl Silyl Endcapping reversed-Phase Säule (5 µm, 3 x 150 mm).
    2. Equilibrate die C18-Säule mit Laufmittel (30: 70) B (MeCN + 0,1 % TFA), Laufmittel A (H2O + 0,1 % TFA) bei einer Durchflussmenge von 1 mL/min und 35 ° C für 15 Minuten (entsprechend etwa 20 Spalte Bände).
    3. 10 µL der derivatisierte Reaktionsmischung zu injizieren (siehe Punkt 6.1) auf die HPLC C18-Säule. Verwenden Sie eine Mischung von MeCN, 0,1 % TFA/H2O und 0,1 % TFA als Eluent mit einem linearen Farbverlauf (Verhältnis 30: 70, 70: 30 in 9 min., Temperatur 35 ° C, fließen 1 mL/min).
    4. Verwenden UV-Detektion setzen bei 400 nm, die Produkte auf der chromatographischen Säule eluiert zu analysieren. DNB-Lysin elutes in der Regel rund 6,5 min, hydroxylierten DNB-Lysin ca. 5,5 min Dihydroxylated DNB-Lysin rund 4,2 min und DNB-Aminodiol rund 5,3 min.

(7) NMR-Analyse des gereinigten Amino-Alkohole

  1. Gereinigte Amino-Alkohole in D2O auflösen (700 µL) und die Lösung auf einem Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Rohr übertragen.
  2. Erwerben Sie 1H und 13C-NMR-Spektren nach entsprechenden NMR-Anlage Protokolle28.

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Ergebnisse

Wir haben bereits berichtet, die Synthese von Mono - und di-hydroxy-L-Lysines durch enzymatische Hydroxylierung Diastereoselective katalysiert durch Dioxygenases des Eisens (II) / αKAO Familie (Abbildung 1)16. Um das Protokoll der gesamten Kaskaden das hier vorgestellte zu optimieren, die ein oder zwei Hydroxylierung Schritte katalysiert durch ein αKAO gefolgt von einer Decarboxylierung Schritt katalysiert durch ein PLP-DC verbinden, w...

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Diskussion

Chirale Alkohole Aminosäuren und Derivate haben eine breite Palette von Anwendungen, von chiralen Hilfsmittel für die organische Synthese zur medikamentösen Therapie. Mehrstufigen Synthese zur Herstellung von Amino-Alkohole durch herkömmliche organische Synthese sind zahlreich, aber möglicherweise nicht immer effizient durch mühsame Schutz/Deprotection Schritte zusammen mit eine feinfühlige Steuerung der Stereochemie16. Ein biokatalytische Ansatz, der die Schutz/Deprotection Schritte verzichtet un...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren danken Véronique de Berardinis für fruchtbare Diskussionen und Alain Perret, Christine Pellé und Peggy Sirvain für den technischen Support.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
HEPESSigma AldrichH3375
L-LysinhydrochloridSigma AldrichL5626
(5S)-hydroxy-L-lysinSigma AldrichGPS NONHOut sourcing
α--KetoglutarsäureSigma Aldrich75892
NatriumascorbatSigma AldrichA7631
Ammoniumeisen(II)-sulfat-HexahydratAcros201370250
Pyridoxalphosphat (PLP)Sigma Aldrich82870
3,4-Dimercaptobutan-1,2-diol (DTT)Sigma AldrichD0632
1-Fluor-2,4-dinitrobenzol (DNFB)Sigma AldrichD1529
EthanolVWR20825.290
Natrium HydrogencarbonatSigma Aldrich71631
HCl 37%Sigma Aldrich435570
HCl 0.1MFluka35335
Acetonitril HiPerSolv CHROMANORM für LC-MSVWR83640.320
2,2,2-TrifluoressigsäureVWR153112E Ammoniak
28%VWR21182.294
Methanol HiPerSolv CHROMANORM für LC-MSVWR83638.32
AmeisensäureAcros270480010
Phosphorsäure 85%Acros201145000
DeuteriumoxidAcros320,710,075
NaOHSigma AldrichS5881
C18 HPLC-SäulePhenomenex00F-4601-Y0
Accela UHPLC SystemThermoFisher Scientific
Accela PDA DetektorThermoFisher Scientific
4mm Spritzenfilter - 0,22µ m - PVDFMerckSLGVR04NL
Einweg-Tuberkulinspritze mit ml-Graduierung, Luer-SpitzeVWRHSWA5010.200V0
Kationenaustauschharz 100-200  mesh Sigma Aldrich217506
Mixed-Mode-Kationenaustauscher-Festphasen-Extraktionspatrone 6 mLWasser186000776
ExtraktionsverteilerWässerWAT200609
RotationsverdampferBü chi531-0103
Lyophilisator alpha 1-2 LDplusChristL083302
Mikropipette 20 & Mikro; LEppendorf3121000031
Mikropipette 100 &Mikro; LEppendorf3121000074
Mikropipette 500 &Mikro; LEppendorf3121000112
Mikropipette 1000 & Mikro; LEppendorf3121000120
300 MHz SpektrometerBruker
2 mL MikroröhrchenCLEARLineCL20.002.0500
50 mL Zentrifugenröhrchen mit konischem BodenFischer Scientific05-539-8
25 mL Rundkolben 14/23Fischer Scientific10353331
100 mL Rundkolben 29/32Fischer Scientific11786183
250 mL Rundkolben 29/32Fischer Scientific11786183
250 mL ErlenmeyerkolbenFischerbrand15496143

Referenzen

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