Methodenartikel

Partielle Gallengang Ligation in der Maus: eine kontrollierte Modell der lokalisierten obstruktive Cholestase

DOI:

10.3791/56930

⸱

28. März 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Jichi Medical University, 2Department of Surgery, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine, 4Department of Pathology, University of Pittsburgh School of Medicine, 5Pittsburgh Liver Research Center, University of Pittsburgh, 6McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir Ihnen teilweise Gallengang Ligatur als chirurgische Modell der Leberschädigung und Regeneration bei Nagetieren.

Zusammenfassung

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Bei Nagetieren ist komplette Gallengang Ligatur (cBDL) der Hauptgallengang eine etablierte chirurgische Methode zur Untersuchung obstruktiver Cholestase und Gallengang Verbreitung. Langzeitexperimente können jedoch zu erhöhter Morbidität und Mortalität führen. In ausgewählten Mausstämme mit zugrunde liegenden Lebererkrankung können sinnvolle Vergleiche auch mit Ligatur der einer einzelnen Leberlappen, erfolgen die tierischen Verluste und Kosten reduzieren können. Hier beschreiben wir teilweise Gallengang Ligatur (pBDL) in der Maus, in der nur die linken hepatischen Gallengang ligiert ist, verursacht biliären Obstruktion in der linke Lappen aber nicht die restlichen Lappen. Mit sorgfältiger mikrochirurgische Technik können pBDL Experimente kostengünstig sein, da der unligated Lappen als interne Kontrolle, die aufgespaltenen Lappen dient, wenn Sie den gleichen Bedingungen in der selben Tier ausgesetzt. Im Gegensatz zu cBDL ist eine separate Schein betrieben Kontrollgruppe nicht notwendig. pBDL ist sehr nützlich um direkt vergleichen lokalisiert versus systemische Wirkungen von Cholestase und anderen Gewinnrücklagen Galle Komponenten. pBDL kann auch als eine neuartige Methode zu untersuchen, Mechanismen, die im Zusammenhang mit Medikamenten und Zellwanderung verwendet werden.

Einleitung

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Chirurgische Modelle der akuten Leberschädigung und Reparatur, wie teilweise Hepatektomie oder Gallengang Ligatur (cBDL), wurden seit Jahrzehnten bei Nagetieren zur Leberregeneration und Pathobiologie1,2zu studieren. In cBDL ist der Hauptgallengang (die alle Galle in der Leber produziert Kanalisation) ligiert, was obstruktive Cholestase, Entzündung und Fibrose in den ersten 2-3 Wochen nach der Operation, mit eventuellen Progression zur Leberzirrhose3. Gallengang Proliferation, Transdifferenzierung und Induktion von resident Leber Vorläuferzellen sind auch Funktionen von cBDL4,5. Obwohl cBDL spezifische Mechanismen der obstruktiven Cholangiopathy die gut-gekennzeichneten mit reproduzierbaren Ergebnissen in Wildtyp Mäusen und in dieser Stämme mit normalen Leber6,7,8 verdeutlicht, die Verfahren kann in einigen transgenen Mausmodellen von Lebererkrankungen, erfordern mehr Tiere als auf Grund der höheren Morbidität und Mortalität der biliären Obstruktion im Laufe der Zeit zu erwarten technisch anspruchsvoll sein. Diese Technik ist auch vorteilhaft für das Studium transgener Mäuse mit zugrunde liegenden Leber-Krankheit, die den Stress des längere Zeit Kurs Experimente nach cBDL sonst nicht tolerieren könnten.

pBDL bieten eine sinnvolle Alternative zu helfen, diese Herausforderungen zu überwinden. Erste pBDL Studien in Wildtyp Mäusen mit dem Ziel, lokal handelnde und systemische Mediatoren der Entzündung9zu unterscheiden. In pBDL die wichtigsten biliären Zusammenfluss der rechten und linken hepatischen Gallenwege über den Gallengang wird sorgfältig auf die Hilum visualisiert und nur die linken hepatischen Gallenwege ist um eine lokalisierte obstruktive Cholestase generieren ligiert. pBDL bietet mehrere Vorteile, cBDL. In pBDL dient der unligated Rechte Lappen als identisch übereinstimmenden interne Kontrolle für die aufgespaltenen linke Lappen, die gleichen systemische Effekte, wie Ernährungszustand oder zirkulierenden Faktoren ausgesetzt. Obwohl systemische Pro-inflammatorischen Mediatoren anwesend waren, Osawa Et Al. beobachtet weniger Fibrose und Nekrose in der unligated Lappen, aber erhöhte Entzündungszellen und transformierende Wachstumsfaktor β Ausdruck in der aufgespaltenen Lappen-9.

In jüngerer Zeit, umdefiniert pBDL, um Leber parenchymal einbehaltene Galle10zu untersuchen. Mithilfe der gleichen Tier für interne Kontrolle (unligated "Schein") und Versuchsgruppen halbiert pBDL effektiv die Anzahl der Tiere pro Experiment, welches wiederum kostengünstiger ist. Die Mäuse vertragen die Auswirkungen der pBDL viel besser, so dass der ideale Zeitpunkt Kurs experimentieren (≥2 Wochen) in der aufgespaltenen Lappen erreicht werden können. Vor allem pBDL direkte intrahepatischen Auswirkungen der obstruktiven Cholestase unterscheiden kann und Galle Komponenten in der aufgespaltenen Lappen, im Vergleich zu der unligated Kontrolle Lappen beibehalten. Insgesamt ist die pBDL eine attraktive Methode, Lappen-spezifische Effekte der lokalisierten Cholestase in der Leber zu studieren.

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Protokoll

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Alle Verfahren wurden im Einklang mit ethischen Richtlinien des institutionellen Animal Care und Verwendung von der University of Pittsburgh durchgeführt.

1. grundlegende Techniken und gemeinsame Verfahren

  1. Autoklav alle mikrochirurgische Ausrüstung vor dem Gebrauch.
  2. Um zu vermeiden, die Maus zu töten, indem Anästhesie, prüfen Sie sorgfältig ihre Atmung.
  3. Tippen Sie auf Organe und Darm möglichst wenig schädigen Organe und verursacht Blutungen zu vermeiden. Drücken Sie blutende Punkte mit feuchten Wattestäbchen oder Gaze Schwämme.
  4. Verwenden Sie nasse Wattestäbchen für sanfte Manipulation der Organe. Nass, Vlies-Gaze Schwämme sind in zwei Größen verwendet, 3,5 × 3,5 cm und 6,0 × 6,0 cm. verwenden Sie die kleinere ganze Leber zurückziehen. Verwenden Sie den größeren, um den kleinen und großen Darm zu wickeln.

(2) präoperativen Vorbereitung

  1. Verwenden Sie männliche c57/b6 Mäuse 8-12 Wochen alt (wenn Körpergewicht ist ca. 20-35 g) für teilweise Gallengang Ligatur.
  2. Erlauben Sie die Mäuse freien Zugang zu Wasser und Nahrung bis zum Induktion der Anästhesie.

3. teilweise Gallengang-Ligatur-Operation

  1. Die Maus zu betäuben, indem man das Tier in eine Induktion-Kammer mit einer Mischung aus 1,5-2,0 % Isofluran und 1 L/min Sauerstoff. Überwachen Sie das Tier durch die Beobachtung der Atemfrequenz sorgfältig. Wenn die Atmung des Tieres einem Atemzug pro Sekunde beträgt, ist die Maus gut betäubt. Da vorderen Gliedmaßen Rückzug Reflex schneller verschwindet, ziehen Sie die hinteren Gliedmaßen Fuß sowie um völlige Fehlen der Reflex-Entzug zu bestätigen zu. Augen sollten mit einem ophthalmologischen Schmier Mittel zu Hornhautgeschwüren geschmiert werden. Beachten Sie die erste Dosis Schmerzmittel kann präoperativ gegeben werden, zur Stimulation der Schmerz-Rezeptoren zu verhindern.
  2. Rasieren Sie die Bauchdecke mit Haarschneidemaschinen, und platzieren Sie den Mauszeiger auf dem OP-Tisch unter dem Operationsmikroskop. Fixieren Sie alle Glieder an den Tisch mit Klebeband. Verwenden Sie Isofluran Inhalation zur Wartung der Maus unter Vollnarkose.
    1. Anpassen des Verdampfers Isoflurane und 2,0-3,0 % Isofluran für Induktion.
  3. Verwendung von sterilen Tupfer desinfizieren die Bauchwand zuerst mit 0,3-0,5 mL Povidon-Jod angewendet topisch, gefolgt von 70 % Ethanol. Tier sollte mit einem sterilen Tuch abgedeckt werden.
  4. Machen Sie einen langen Mittellinie Bauchschnitt aus dem Xiphoid um das Schambein mit der Schere und Adson Pinzette. Nachdem Sie haben den Bauchschnitt, reduzieren Isofluran auf 0,8-1,0 % für die Wartung.
  5. Setzen Sie die Bauchhöhle mit einem Micro-Retraktor aus. Das Xiphoid mit Moskito-Zange halten und in Richtung zum Kopf der Maus einfahren. Fixieren Sie die Moskito-Zange mit weichem Ton.
  6. Einzuflößen 1-2 mL erwärmten (37 ° C) sterilisiert Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die Bauchhöhle, nicht zu verletzen, Bauchorgane. Halten Sie den Dünndarm mit feuchten Wattestäbchen und ziehen sie sanft in Richtung zum Kopf der Maus. Schneiden Sie die Bänder zwischen den kleinen Därmen und Retroperitoneum, nicht zu verletzen, den Dünndarm (Abbildung 1A).
  7. Wickeln Sie den kleinen und großen Darm mit einem Schwamm nass, Vlies-Gaze. Legen Sie sie auf den kaudalen Teil der Bauchhöhle. Steril drapiert Feld zur Vermeidung von Kontaminationen können Darm verpackt in sterile Gaze auferlegt werden.
  8. Sanft Einfahren der gesamten Leber in Richtung der Xiphoid mithilfe einen kleinen nassen Vlies Gaze-Schwamm, setzen die hepatische Hilum und Hepato-Zwölffingerdarm Ligament (Abbildung 1 b).
  9. Überprüfen Sie die Anatomie des hepatischen Hilum bestätigen. Hauptgallengang befindet sich auf der Bauchseite der Pfortader. Standorte der rechten und linken hepatischen Gallenwege, die in den wichtigsten biliären Zusammenfluss bei der hepatischen Hilum entwässern zu bestätigen.
  10. Identifizieren Sie der linken hepatischen Gallenwege die Kanalisation den linken Lappen, und umschließen Sie es mit einer 10-0-Nylon-Naht mit der stumpfen Seite einer Naht-Nadel (Abbildung 2A). Nicht zu verletzen, der Pfortader, der Leberarterie und Leber Oberfläche.
  11. Verbinden Sie den linken Gallengang mit 10: 0 Nylon. (Abb. 2 b).
  12. Legen Sie den kleinen und großen Darm in der gleichen Position wie vor der Operation mit feuchten Wattestäbchen.
  13. Bestätigen Sie, dass es keine Darm Torsion und intraabdominellen Blutung, dann schließen Sie den Muskel und die Haut in zwei Schichten mit 4-0 Vicryl. Geflochtene Naht (Vicryl) diente zur Schließung der Haut, aber Monofilament wird bevorzugt, um die Wahrscheinlichkeit einer Infektion zu verringern.
    Hinweis: Schließen Sie Faszie durch kontinuierliche Naht von Xiphoid bis Schambein und die Haut durch kontinuierliche Naht vom Schambein zum Xiphoid.
  14. Narkose nach dem Schließen des Schnittes zu stoppen.

4. postoperative Behandlung und Nachsorge

  1. Gerade nach der Operation, kneifen die Rückenhaut der Maus und Spritzen Buprenex (0,1 mg/kg) und Cefazolin (100 mg/kg) subkutan, gefolgt von Buprenex Injektion alle 12 h für 3 Tage und Cefazolin alle 24 h für 3 Tage bzw.11,12 ,13. Beachten Sie die erste Dosis Schmerzmittel kann präoperativ gegeben werden, zur Stimulation der Schmerz-Rezeptoren zu verhindern. Cefazolin und andere perioperative Antibiotika sind nur für Immunsystem unterdrückt Tiere, wie Sie in Transplantation Studien notwendig.
    Hinweis: Wenn die Operation erfolgreich durchgeführt wird, die Maus in der Regel erholt sich innerhalb von 30 min. Aktivität der Mäuse werden fast identisch mit dem präoperativen Zustand.
  2. Überprüfen Sie die Mäuse täglich für alle Zeichen der Bedrängnisses.
    1. Die Mäuse durch zervikale Dislokation unter Vollnarkose für die Beschaffung von Leber und anderen Gewebeproben zu definierten Zeitpunkten (d. h., 7, 14, 21 Tage) nach pBDL zu opfern.

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Ergebnisse

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Für dieses typische Experiment war pBDL in dreifacher Ausfertigung PiZ transgenen Mäusen durchgeführt, die die menschliche Leber Krankheit gefunden (A1AT) Alpha1-Antitrypsin-Mangel zu rekapitulieren. Die PiZ-Maus overexpresses ein Transgen, bestehend aus mehreren genomische Fragmente von DNA, die kodierenden Bereiche des menschlichen A1AT Mutation und Förderer zusammen mit Introns und ~ 2 Kilobases der vor- und nachgelagerten flankierenden Regionen14enthalten,...

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Diskussion

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Obwohl cBDL die häufigste experimentelle Technik für obstruktive Cholestase ist, kann es mehrere Herausforderungen bei Nagetieren präsentieren. Abhängig von der Anzahl der postoperativen Tage benötigt, um einen Endpunkt zu erreichen können die Tiere erhebliche Morbidität und Mortalität mit fortschreitender Zeit erleben. Der Grad der Gewebeverletzung und biliären Nekrose wird weiter verschärft, bei der Arbeit mit einigen transgenen Mausmodellen der Lebererkrankung, die abnorme Leberparenchym und Funktion zu Studienbeginn ...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Angaben.

Danksagungen

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Dr. Khan bestätigt Zuschüsse aus NIH/NICHD K12HD052892, Alpha-1-Stiftung, Stiftung Hillman und Pittsburgh Leber Research Center. Dr. Michalopoulos erkennt Zuschüsse aus NIH/NIDDK P01DK096990. Wir freuen uns über die hervorragende und großzügige technische Hilfe von Anne Orr. Wir sind auch für den Zugriff auf die Transplantation/Nagetier Mikrochirurgie-Labor Dr. David A. Geller dankbar.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Mikroskop-Leica Wild M650, 6– 40 mal; VergrößerungLeica Microsystemsn/a
Tec 3 Isofluran TrichterfüllverdampferAnästhesiedienstleistungenn/a
Stevens TenotomiescherePräzise chirurgische & Scientific Instruments CorporationASSI.9193
Adson-PinzetteFeine wissenschaftliche Werkzeuge11006-12
Mosquito Classic zarte hämostatische PinzetteCodman30-4472
Mikro-RetraktorMurdock; Roboz Chirurgisches InstrumentRS-6550
Vlies-MullschwämmeFisherband870-PC-DBL
Puritan 6" Kleines Wattestäbchen mit HolzgriffPuritan Medical Products Company868-WCS
Dumont SS Pinzette - Standardspitzen/Gerade/Inox/13,5 cmFeinwissenschaftliche Werkzeuge11203-23
Dumont SS Pinzette - Standardspitzen/Abgewinkelt 45 Grad/Inox/13,5 cmFeinwissenschaftliche Werkzeuge11203-25
Vannas Federschere - 3 mm SchneidkanteFeinwissenschaftliche Werkzeuge15000-00
MikronadelhalterAesculap Surgical InstrumentsFD231R
Micro AROSuture, steriles 10-0 Nylonnahtmaterial, 70 & Mikro; m, TAPpoints AROSurgical Instruments CorporationT4A10N07
4-0 VicrylEthiconJ662H
5-ml-SpritzeBD309646
Falcon Gewebekulturschale, 60 &; 15 mmCorning353002
Isofluran, United States Pharmacopeia (USP) Flüssigkeit zur Inhalation, 250 mlPiramal HealthcareNDC 66794-017-25
Buprenex injizierbar (Buprenorphinhydrochlorid)Reckitt Benckiser PharmaceuticalsNDC 12496-0757-1
Cefazolin zur Injektion, USPAPP PharmaceuticalsNDC 63323-238-61
PVP-Peelinglösung (Povidon– Jod 7,5%)MedlineNDC 12496-0757-1
70% EthanolDecon Labs2716
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Kalzium oder MagnesiumLONZA17-516F
Sirius RedSigma365548
HämatolxylinFisher (Richard-Allan Scientific)22-050-111 (7211)
EosinAnatech (Fisher)832 (NC9686037)
FormalinFischerSF100-20
Allgemeine

Referenzen

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LebergallengangLeberregenerationchirurgische TechnikMausmodellLebersch digungGallengangproliferationlokalisierte Obstruktion

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