Isolierung und Charakterisierung von Neutrophilen abgeleitet Mikropartikel für funktionelle Studien

Zusammenfassung

Neue Protokolle werden hier beschrieben, zu isolieren und zu charakterisieren Mikropartikel abgeleitet von Mensch und Maus Neutrophile. Diese Protokolle nutzen Ultrazentrifugation, Durchflusszytometrie und Immunoblotting Techniken Mikropartikel Inhalte zu analysieren, und sie können zur Untersuchung der Rolle von Mikropartikeln aus verschiedenen Zelltypen in zelluläre Funktion abgeleitet.

Zusammenfassung

Polymorphkernigen Neutrophilen abgeleitet Mikropartikel (PMN)-m/s) sind Lipid Bilayer, sphärische Microvesicles mit Größen von 50 – 1.000 nm im Durchmesser. M/s sind eine sich neu entwickelnden, wichtiger Bestandteil der Zell-Zell-Kommunikation und Signalisierung Maschinen. Wegen ihrer Größe und der Art ihrer Freisetzung wurde bis vor kurzem MP Existenz übersehen. Allerdings ist ihre Funktion in Gesundheit und Krankheit mit verbesserter Technik und analytischen Methoden jetzt entstehen. Die hier vorgestellten Protokolle richten sich an Isolierung und Charakterisierung von PMN-MPs durch Durchflusszytometrie und Immunoblotting. Darüber hinaus sind einige Umsetzungsbeispiele gegeben. Diese Protokolle für MP Isolierung sind schnelle, kostengünstige und nicht den Einsatz von teuren Kits erfordern. Darüber hinaus sorgen sie für die Kennzeichnung von MPs nach Isolierung, sowie Pre-Kennzeichnung der Quellzellen vor MP Version mit einem Membran-spezifische Fluoreszenzfarbstoff zur Visualisierung und Analyse von Durchflusszytometrie. Diese Methoden haben jedoch mehrere Einschränkungen einschließlich Reinheit von PMNs und m/s und die Notwendigkeit für anspruchsvolle analytische Instrumentierung. Ein High-End-Durchflusszytometer muss zuverlässig analysieren MPs und minimieren falsche positive liest wegen Lärm oder Auto-Fluoreszenz. Die beschriebenen Protokolle können verwendet werden, zu isolieren und MP Biogenese definieren und charakterisieren ihre Markierungen und Variation der Zusammensetzung unter anderen stimulierenden Bedingungen. Größe Heterogenität kann ausgenutzt werden, um zu untersuchen, ob der Inhalt der Membran Partikel versus Exosomen anders ist, und ob sie unterschiedliche Rollen im Gewebe Homöostase zu erfüllen. Zu guter Letzt können folgende Isolierung und Charakterisierung von MPs, ihre Funktion im zellulären Reaktionen und verschiedenen Krankheitsmodelle (einschließlich, PMN-assoziierten entzündlichen Erkrankungen, wie z. B. entzündliche Darmerkrankungen oder akuten Lungenversagen) erkundet werden.

Einleitung

Vor kurzem, "Mikropartikel/Microvesicles" aus dem Zytosol der Zelle oder Plasmamembran geworden von großem wissenschaftlichen Interesse, da neue Daten deuten darauf hin, dass diese Strukturen, angefangen bei 50-1.000 nm im Durchmesser, biologische Informationen enthalten können und als eine nicht-kanonische Methode der zellulären Kommunikation dienen. Immune Zelle abgeleitet MPs und besonders die von polymorphkernigen Neutrophilen (PMNs) sind von großem Interesse angesichts der wichtigen Rolle von PMNs in Host Verteidigung^1,2, Entzündungsreaktionen³und Wundheilung ⁴

Protokoll

Alle tierische Arbeit wurde von der nordwestlichen IACUC genehmigt. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung und die Einhaltung aller relevanten rechtlichen und institutionellen Richtlinien abgeschlossen. Für Probanden Blut zu Spenden wurde eine Einverständniserklärung vorgelegt und unterzeichnet; Darüber hinaus wurden alle Probanden in dieser Studie nach den institutionellen und Bundesrepublik Leitlinien für menschliches Wohlergehen behandelt.

Hinweis: Die Protokoll-Schritte sind unter den folgenden Abschnitten aufgeführt: (i) Maus Knochenmark Zelle isoliert; (Ii) PMN Isolation aus Maus Knochenmark; (Iii) PMN Isolation aus menschlichem B....

Ergebnisse

Repräsentative durchflusszytometrischen Analyse von MPs, das wurden isoliert von Mensch und Maus PMNs sind in Abbildung 1dargestellt. Die Größe Heterogenität der PMN-MPs im Vergleich zu bekannten großen Perlen wie in Abbildung 1A, B für menschliche MPs. Note bewertet werden kann, wurden keine signifikanten Unterschiede in Größe Heterogenität zwischen Maus und Mensch MPs beobachtet. Ebenso kann mit Durchflusszytom.......

Diskussion

Protokolle für die Isolierung und Charakterisierung von PMN-abgeleitete MPs werden in dieser Mitteilung beschrieben. Mehrere wichtige kritische Punkte müssen für den Erfolg des Verfahrens berücksichtigt werden. Erstens muss PMNs frisch isoliert und in Experimenten innerhalb 2 h der Isolation verwendet, um zu verhindern, dass die spontane Aktivierung und Degranulation. Alle Behandlung der PMNs während Isolierung und bis zu dem Punkt der Stimulation muss auf Eis, Aktivierung und vorzeitige MP Version¹²

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM	Corning	10-041-CV
Fötales Rinderserum (hitzeinaktiviert)	Atlanta Biologics	S11150
Penicillin/Streptomycin (10.000 Einheiten Penicillin / 10.000 mg/ml Streptomycin)	GIBCO	15140
0,5 M EDTA	Fisher	BP2482
Natriumchlorid	Sigma	S9888	Steril und gefiltert durch eine 0,1 Mikron-Filtereinheit
Sterilfiltriert Histopaque 1077	Sigma	10771
Steril filtriert Histopaque 1119	Sigma	11191	Dichte 1.119 g/ml.  Lösung von Polysaccharose und  Natriumdiatrizoat.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne Calcium und Magnesium	Cellgro	210-40-CV
Ethylalkohol (200 Proof)	Decon labs	2701
HBBS	Corning	21-022-CV
Trypanblau-Lösung, 0,4%	Sigma	T8154  SIGMA	Verdünnt 1:2 für die Zählung der Zellviabilität
Isofluran	Abbot	50033
Anti-humanes CD11b-APC konjugiert	Biolegend	301350	Klon ICRD44 (Endkonzentration: 1 & Mikro; g/mL)
BODIPY FL	Invitrogen	B10250	N-(2-aminoethyl)maleimid
Annexin V Binding Buffer	Biolegend	422201
Kalibrierungskügelchen für die Durchflusszytometrie	BioCytex	7803
FITC Annexin V	Biolegend	640906
Polymorphprep	Axis-Shield PoC AS		Natriumdiatrizoat/Dextran 500, Dichte 1,113 g/ml
C57BL/6 Mäuse	Jackson Labs
15 ml Zentrifuge Röhrchen	Corning	430053
50 ml Zentrifugenröhrchen	BD Falcon	352070
25 ml serologische Pipetten	Celltreat	229225B
10 ml serologische Pipetten	Celltreat	229210B
5 ml serologische Pipetten	Celltreat	229205B
Pasteurpipetten	BD Falcon	357575
25 G x 5/8 Zoll Nadeln (Präzisions-Gleitnadeln)	BD	305122
100 µ m Zellsiebe	Celltreat	229485
Vacutainer-Röhrchen	BD	367251
Equipment
LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP)	BD(	SORP)
Schwingschaufelzentrifuge	ThermoFisher Scientific	75007210
Ultrazentrifuge	Beckman	(L8-80 M)
Mikrozentrifuge	ThermoFisher Scientific	VV-17703-15 (Fresco 17)
Schwingzentrifuge	ThermoFisher Scientific	75004503 (Megafuge 40R)
Biopsiezange, 28 cm	Storz	27071zj
Software
Image J	National Institute of Health	Open source