Methodenartikel

Isolierung und Charakterisierung von Neutrophilen abgeleitet Mikropartikel für funktionelle Studien

DOI:

10.3791/56949

⸱

2. März 2018

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neue Protokolle werden hier beschrieben, zu isolieren und zu charakterisieren Mikropartikel abgeleitet von Mensch und Maus Neutrophile. Diese Protokolle nutzen Ultrazentrifugation, Durchflusszytometrie und Immunoblotting Techniken Mikropartikel Inhalte zu analysieren, und sie können zur Untersuchung der Rolle von Mikropartikeln aus verschiedenen Zelltypen in zelluläre Funktion abgeleitet.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polymorphkernigen Neutrophilen abgeleitet Mikropartikel (PMN)-m/s) sind Lipid Bilayer, sphärische Microvesicles mit Größen von 50 – 1.000 nm im Durchmesser. M/s sind eine sich neu entwickelnden, wichtiger Bestandteil der Zell-Zell-Kommunikation und Signalisierung Maschinen. Wegen ihrer Größe und der Art ihrer Freisetzung wurde bis vor kurzem MP Existenz übersehen. Allerdings ist ihre Funktion in Gesundheit und Krankheit mit verbesserter Technik und analytischen Methoden jetzt entstehen. Die hier vorgestellten Protokolle richten sich an Isolierung und Charakterisierung von PMN-MPs durch Durchflusszytometrie und Immunoblotting. Darüber hinaus sind einige Umsetzungsbeispiele gegeben. Diese Protokolle für MP Isolierung sind schnelle, kostengünstige und nicht den Einsatz von teuren Kits erfordern. Darüber hinaus sorgen sie für die Kennzeichnung von MPs nach Isolierung, sowie Pre-Kennzeichnung der Quellzellen vor MP Version mit einem Membran-spezifische Fluoreszenzfarbstoff zur Visualisierung und Analyse von Durchflusszytometrie. Diese Methoden haben jedoch mehrere Einschränkungen einschließlich Reinheit von PMNs und m/s und die Notwendigkeit für anspruchsvolle analytische Instrumentierung. Ein High-End-Durchflusszytometer muss zuverlässig analysieren MPs und minimieren falsche positive liest wegen Lärm oder Auto-Fluoreszenz. Die beschriebenen Protokolle können verwendet werden, zu isolieren und MP Biogenese definieren und charakterisieren ihre Markierungen und Variation der Zusammensetzung unter anderen stimulierenden Bedingungen. Größe Heterogenität kann ausgenutzt werden, um zu untersuchen, ob der Inhalt der Membran Partikel versus Exosomen anders ist, und ob sie unterschiedliche Rollen im Gewebe Homöostase zu erfüllen. Zu guter Letzt können folgende Isolierung und Charakterisierung von MPs, ihre Funktion im zellulären Reaktionen und verschiedenen Krankheitsmodelle (einschließlich, PMN-assoziierten entzündlichen Erkrankungen, wie z. B. entzündliche Darmerkrankungen oder akuten Lungenversagen) erkundet werden.

Einleitung

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Vor kurzem, "Mikropartikel/Microvesicles" aus dem Zytosol der Zelle oder Plasmamembran geworden von großem wissenschaftlichen Interesse, da neue Daten deuten darauf hin, dass diese Strukturen, angefangen bei 50-1.000 nm im Durchmesser, biologische Informationen enthalten können und als eine nicht-kanonische Methode der zellulären Kommunikation dienen. Immune Zelle abgeleitet MPs und besonders die von polymorphkernigen Neutrophilen (PMNs) sind von großem Interesse angesichts der wichtigen Rolle von PMNs in Host Verteidigung1,2, Entzündungsreaktionen3und Wundheilung 4. faszinierend, so weit, haben zahlreiche Berichte Pro-inflammatorischen und Anti-inflammatory Funktionen von PMN-MPs5, was auf einen möglichen Kontext-, Krankheit - Arten- und Organ-spezifischen Rolle des m/s gezeigt.

In dieser Mitteilung beschriebenen Protokolle bieten eine kostengünstige, innovative und flexible Methode, um die Funktion des MPs in Gesundheit und Krankheit zu untersuchen. Sie sind auf vielen Modellorganismen, Organe und Stimulation Bedingungen anwendbar. Sie ermöglichen die Identifizierung von mehreren Arten von m/s und können in Zukunft verwendet werden, um ihre Pro-inflammatorischen und Anti-inflammatory Funktionen. Als ein Beispiel beschrieben hier ist, wie man die Funktion von PMN-MPs in epithelialen Wunde heilen in Vitro und in Vivozu untersuchen. Die vorgestellten Protokoll zur Isolierung der Maus Knochenmark stammenden PMNs wurde mit einigen Änderungen von einem zuvor beschriebenen Methode6angepasst.

Darüber hinaus Protokolle in dieser Studie beschriebenen ermöglichen die Erkennung und Charakterisierung von spezifischen Marker, die auf PMN-MPs durch zwei komplementäre Methoden finden: Western blot und flow Cytometry. Wir finden, dass Immunoblotting der MPs mit Standardprotokollen5 ist einfach und zuverlässig, jüngste Fortschritte in der Empfindlichkeit der Flow Cytometry Instrumente und verbesserte Rauschsignal-Verhältnis jetzt können jedoch zur weiteren Analyse des MPs mit dieser Methode. Die beschriebenen Protokolle in dieser Studie zu integrieren, die jüngsten Fortschritte und Empfehlungen von original Forschungsartikel, einschließlich Änderungen an Zentrifugation Geschwindigkeit und Zeit, die Zugabe von Probe Filter- und Einfrieren/Lagerung Bedingungen7 , 8, und wie man das "Hintergrundrauschen" reduzieren, verbessern die Nachweisgrenze von PMN-MPs und unterscheiden können zwischen verschiedenen Größen der MPs.

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Protokoll

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Alle tierische Arbeit wurde von der nordwestlichen IACUC genehmigt. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung und die Einhaltung aller relevanten rechtlichen und institutionellen Richtlinien abgeschlossen. Für Probanden Blut zu Spenden wurde eine Einverständniserklärung vorgelegt und unterzeichnet; Darüber hinaus wurden alle Probanden in dieser Studie nach den institutionellen und Bundesrepublik Leitlinien für menschliches Wohlergehen behandelt.

Hinweis: Die Protokoll-Schritte sind unter den folgenden Abschnitten aufgeführt: (i) Maus Knochenmark Zelle isoliert; (Ii) PMN Isolation aus Maus Knochenmark; (Iii) PMN Isolation aus menschlichem Blut; (iv) MP Isolation von PMN Überstände (durch Ultrazentrifugation); (V) Charakterisierung der MPs durch Western Blot; (vi) Charakterisierung der MPs durch Durchflusszytometrie; (Viii) Anwendung der isolierten MPs auf Studie Wundheilung

1. Maus Knochenmark Zelle isoliert

  1. Dissektion des Femur und Tibia von den Hinterbeinen Maus
    1. Inhalation der Narkose eine Euthanasie-Box (z.B., ein Tipp-Feld leer 1 mL) vorbereiten. Fügen Sie ein paar Tropfen 100 % Isofluran auf ein steriles Tuch, mit Klebeband an der Innenseite der Deckel Kunststoff-Box. Gemäss neuen IACUC Richtlinien sollten Tiere nicht kommen in direkten Kontakt mit Isofluran, somit die Platzhalter ein Tipp zwischen Maus und die Gaze mit der Isofluran.
      Hinweis: Isofluran ist eine leistungsstarke inhalativer Anästhetikum und sollte mit äußerster Vorsicht in einer Dampfhaube gehandhabt werden.
    2. Einschläfern Sie Mäuse gemäß IACUC Empfehlung. Legen Sie eine Maus in der Euthanasie-Box im Schritt 1.1.1 für 1 – 5 min beschrieben, bis es nicht atmen mehr. Tod des Tieres durch Ausführen einer zervikalen Dislokation zu gewährleisten.
    3. Heben Sie die Verwendung von Edelstahl, 12 cm gebogen, Bauchhaut 0,17 mm X 0,1 mm Pinzette und schneiden Sie die Haut auf halbem Weg zwischen der oberen und unteren Extremitäten. Schälen Sie die Haut von hier aus zu den distalsten Teil der Maus Körper einschließlich der unteren Extremitäten. Mit 10 cm lang gerade Präparierscheren, entfernen Sie die Muskeln von den Hinterbeinen und verrücken Sie des Hüftgelenks Femur Kopf intakt.
    4. Mit einer Schere sezieren die Muskeln von Femur und Tibia und Femur von der Tibia zu trennen. Stellen Sie sicher, dass die Enden der Knochen intakt bleiben, da sie erhebliche Mengen an Knochenmark enthalten.
    5. Entfernen Sie alle verbleibenden Fleisch durch Walzen die Knochen in einem Papiertuch. Legen Sie die sauberen Knochen in einer Petrischale mit serumfreien Medium (SFM, d.h.Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) ohne Serum oder Antibiotika).
    6. Spülen Sie die Knochen in 70 % igem Ethanol und dann in SFM.
    7. 50 mL SFM in einem 50 mL konische Röhrchen vorzubereiten. In einer 10 mL Spritze laden Sie 10 mL SFM und verbinden Sie es mit einem 25 und 5/8 Zoll-Gauge-Nadel.
    8. Schneiden Sie das Ende der Knochen mit einer Schere, bis eine Öffnung an das Knochenmark (rötliche Farbe) sichtbar ist.
    9. Spülen Sie die Knochenmarkzellen in eine neue 50 mL Tube. Verwenden Sie eine 10 mL Spritze mit einer 26 und 5/8 Zoll-Gauge-Nadel mit ca. 3 mL/Knochen von SFM. Wenn fertig, Spülung, Aufschwemmen der Zellen in der Röhre durch Pipettieren (Verwendung Einweg 1 mL Kunststoff-Tipps) Zelle Aggregate zu brechen.

(2) PMN Isolation aus Maus Knochenmark

  1. Lyse der Erythrozyten
    1. Pellet-gesammelten Knochenmarks durch Zentrifugieren bei 350 X g für 8 min bei 4 ° C.
    2. Aufschwemmen der Zelle-Pellets in 20 mL 0,2 % NaCl für ca. 20-30 s zur lyse des Erythrozyten-Anteil. Nicht mehr als 30 s als das PMN-Lyse führen. Geben Sie 20 mL von 1,6 % NaCl, Osmolalität wiederherzustellen.
      Hinweis: Dieser Schritt kann zu sehr wenig PMN Aktivierung führen.
    3. Waschen Sie die Zellen mit 2 mL PBS und Zentrifuge wie in Schritt 2.1.1 oben. Den Überstand zu entfernen.
    4. Fahren Sie mit isolierenden PMNs durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung.
  2. Isolierung der Neutrophilen durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung
    1. Warme Polysucrose und Natrium Diatrizoate Lösungen, mit dichten 1,119 g/mL und 1,077 g/mL (siehe Tabelle der Materialien), auf Raumtemperatur (RT) vor dem Gebrauch.
    2. Bereiten Sie Polysucrose und Natrium Diatrizoate Gradienten frisch, unmittelbar vor dem Knochenmark Zelle durch langsam Schichtung 3 mL der 1,077 g/mL Dichte Lösung über 3 mL der Lösung 1,119 g/mL Dichte in 15 mL konische Röhrchen vor.
      Hinweis: Vorbereitung der gradient Lösung zu weit im Voraus wird in Vermischung der Schichten und schlechte Neutrophilenzahl Reinheit und Erholung führen.
    3. Das Knochenmark Zelle Pellet in 1 mL eiskaltem PBS Aufschwemmen und überlagern die resultierende Zellsuspension auf die Polysucrose und Natrium Diatrizoate gradient (langsam, um zu vermeiden, Mischen der Schichten).
    4. Zentrifuge für 30 min bei 850 X g bei 25 ° C bei RT, ohne Bremse. Halten Sie die Reagenzien bei RT für wirksame Trennung von der Neutrophilen aus anderen Zellen im Knochenmark. Festlegen der Zentrifuge bei langsam Verzögerung für den Farbverlauf effizient gebildet und nach dem Zentrifugieren Schritt gewartet werden.
    5. Suchen Sie visuell mononukleären Zellschicht an der Schnittstelle von PBS und 1,077 g/mL Dichte Lösung (obere Schicht). Entfernen Sie diese Schicht und der Rest der Dichte Lösung ohne zu stören die PMN-Band.
    6. Sammeln Sie eine ganze PMN-Ebene und einige der zugrunde liegenden Polysucrose und Natrium Diatrizoate 1,119 g/mL Lösung in 15 mL Röhrchen mit einer Transferpipette.
      Hinweis: Eine vollständige Entfernung der obersten Hautschicht wird die Reinheit der isolierten PMNs abhängen.
    7. Top die Rohre mit gefilterten PBS (gefiltert durch einen 0,1 µm Pore Größe Filter) und Zentrifuge bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C.
    8. Waschen Sie die gebeizte PMNs mit 2 mL PBS mit Zentrifugation Bedingungen wie in Schritt 2.2.7.
    9. In 1 mL der gefilterten PBS Aufschwemmen und isolierten PMNs von Hemocytometer zählen.
      Hinweis: Für diese Isolierung-Methode, die sich daraus ergebenden PMN Reinheit beläuft sich auf ~ 85-90 %, wie Durchflusszytometrie bewertet wurde. Die übrigen Fraktionen verunreinigen besteht hauptsächlich aus mononukleären Lymphozyten.
  3. PMN Stimulation induzieren MP Version
    Hinweis: PMNs können freizugebende MPs mit diversen aktivierende Bedingungen, einschließlich N-formyl-l-methionyl-leucyl-l-phenylalanine (fMLF), Phorbol-12-Myristate-13-Acetat (PMA) oder Interferon-Gamma (IFNγ) angeregt werden. Wichtig ist, sollte vor der Simulation, PMNs auf Eis zu allen Zeiten gehalten werden.
    1. Pellet PMNs (300 x g, 5 min, 4 ° C) und in 0,1 µm Aufschwemmen gefiltert Hank es ausgewogene Lösung (HBSS) Salzlösung, enthält das stimulierende Mittel der Wahl. Verwenden Sie für optimale Stimulation 100 µL Stimulation Lösung pro 10 Millionen PMNs für 20-30 min bei 37 ° C in 15 mL-Tuben.
      Hinweis: Die folgenden Konzentrationen von Aktivatoren wurden erfolgreich im Einsatz in unserer bisherigen Arbeit: fMLF (0,5-1 µM für Mensch und von 2-5 µM für Maus PMNs), PMA (200 nM), und IFNγ (100 ng/mL). Wenn die Freigabe der vorher markierten MPs gewünscht wird, brüten unstimulierte PMNs (1-5 x 106) mit N-(2-aminoethyl) Maleimide-FITC (siehe Tabelle der Materialien) (1 µM in 100 µL HBSS, 15 min, 37 ° C). Führen Sie Schritte 2.3.1-2.3.3.
    2. Spin-down bei 850 X g für 5 min bei 4 ° C, entfernen PMNs und zellfreie Überstände auf neue 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen übertragen.
    3. Fahren Sie für MP-Isolation von zellfreien Überstände mit Schritt 4.2.

3. PMN Isolation aus menschlichem Blut

  1. Gesunde Probanden für Blut Extraktion nach institutionellen IRB Richtlinien zu rekrutieren.
    1. Sammeln Sie Blut aus dem Unterarm eines gesunden Freiwilligen in handelsüblichen 5 mL Natriumcitrat-haltige Rohre (siehe Tabelle der Materialien).
    2. Pipette 5 mL Dextran und Natrium-Diatrizoate-Lösung (Dichte von 1,113 g/mL, siehe Tabelle of Materials) in sterilen 15 mL-Tuben und langsam Schicht 5 mL frisch isolierte periphere Menschenblut oben drauf.
    3. Zentrifugieren Sie die Rohre für 50 min bei 400 x g bei RT (25 ° C) mit geringer Beschleunigung und keine Bremse.
    4. Am Ende der Zentrifugation entnehmen Sie Plasma und mononukleären Zellen (obere Schicht) mit einer sterilen Kunststoff Saug Pipette.
    5. Übertragen Sie die Unterschicht (PMNs) in eine neue sterile 50 mL konische Rohr.
    6. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 0,45 % NaCl, PMNs (Mischung gut und sanft durch das Rohr drehen).
    7. Zentrifuge für 10 min bei 400 X g bei 25 ° C.
  2. Lyse der Erythrozyten
    1. Gebeizte Zellen für 45 10 mL eiskaltem, sterilen Wasser hinzufügen s gefolgt von 10 mL eiskaltes sterile 1,8 % NaCl, Osmolalität wiederherzustellen.
      Hinweis: Alle folgenden Schritte für PMN Isolierung sollte auf dem Eis zur Vermeidung von PMN Aktivierung und vorzeitige MP Version durchgeführt werden. Die Lyse Schritt selbst führt zu kleinen, aber nicht signifikant PMN-Aktivierung, jedoch ist es wichtig für die Isolierung von einer reinen PMN Bevölkerung für funktionelle Assays.
    2. Zentrifugieren Sie die Zellen für 10 min bei 250 X g bei 4 ° C mit weich abbremsen.
    3. Wiederholen Sie 3.2.1 und 3.2.2.
    4. Aufschwemmen PMNs in 5 mL eiskaltes HBSS ohne Kalzium und Magnesium. Insgesamt lebenden Zellen zu zählen (verwenden Sie einen Hemocytometer und Lebensfähigkeit Färbung bei 1:2 Verdünnung, siehe Tabelle of Materials) vor der Stimulation.
      Hinweis: Isolierte PMNs sollte für Stimulation oder andere Experimente innerhalb 2 h nach Isolierung verwendet werden, um funktionelle und zellulären Veränderungen und Zelltod zu vermeiden.

4. MP Isolation von aktivierte PMN Überstände

Hinweis: Ein ähnliches Protokoll wird für die Isolierung von MPs von murinen und menschlichen PMNs verwendet.

  1. Pellet PMNs (300 x g, 5 min, 4 ° C) und in 0,1 µm Aufschwemmen gefiltert HBSS Lösung enthält das stimulierende Mittel der Wahl (für Beispiel 1 µM fMLF, siehe Hinweis: 2.3.1). Verwenden Sie für optimale Stimulation 100 µL Stimulation Lösung pro 10 Millionen PMNs für 20-30 min bei 37 ° C in 15 mL-Tuben.
  2. Folgenden Stimulation, spin-down aktivierten PMNs 600 X g für 5 min bei 4 ° C und zellfreie Überstände auf neue 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen übertragen.
  3. Zentrifugieren des PMN geclearte Überstands bei 13.000 x g, 10 min, 4 ° C Zelle Schutt zu entfernen und den geräumten Überstand in ein neues Ultrazentrifugen Rohr übertragen.
  4. Zentrifuge für 1 h bei 100.000 x g bei 4 ° C. Überstände vor MP Speicher zu entfernen. Je nach Bedarf, pelleted Store MPs in Paraffin versiegelt Ultrazentrifugen Rohre bei-80 ° C bis zur Verwendung in Experimenten.

5. Prüfung der PMN-MPs durch westliche Beflecken

  1. Fügen Sie 1 % SDS Puffers (50-200 µL mit 100 mM Tris pH: 7,4), MPs pellet (aus Schritt 4.4), Transfer zum neuen 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und lysierten MPs für 5 min kochen.
    Hinweis: Die Anzahl der Abgeordneten und der Lyse Puffervolumen muss angepasst und optimiert für jedes Protein des Interesses.
  2. Laden Sie gleiche Mengen von PMN-m/s pro Lane im Ladepuffer enthalten 10 % β-Mercapto-Ethanol.
    Hinweis: Mit unserer Methode laden wir MPs, die aus der gleichen Anzahl von stimulierten PMNs isoliert wurden.
    1. Trennen der Lysates durch SDS-PAGE auf 10 % Polyacrylamid-Gel (verwenden Sie 50-100 V für 1-1,5 h) und total Proteinen auf Nitrocellulose-Membranen als beschriebenen9übertragen.
  3. Membranen für 1 h mit 5 % fettfreie Milch in 0,05 % Tween-20 Tris gepufferte Kochsalzlösung zu blockieren, und mit einer entsprechenden primären (über Nacht bei 4 ° C), gefolgt von HRP-konjugierten Sekundärantikörper inkubieren.
  4. Visualisieren Sie die Bänder durch die Membran und der Exposition gegenüber einem Röntgenfilm in einem lichtdichten Kassette (1-24 h) Chemoluminescence-Lösung hinzufügen.

6. Prüfung von PMN-MPs durch Durchflusszytometrie

  1. Verdünnen Sie für Antikörper Färbung Antikörper entsprechend in FACS Puffer (PBS mit 0,1 mM EDTA, 0,1 % Natriumazid). Aufschwemmen pelleted PMN-MPs (abgeleitet von 1-3 x 106 PMNs/Zustand) in 100 µL Antikörper-Lösung.
    1. Wenn Annexin v Färbung, Aufschwemmen Sie gebeizte PMN-MPs in Annexin V-Puffer mit 5 µL FITC konjugiert Annexin V. Wenn mit Antikörpern Co Färbung, die gewünschten Antikörper (für ein Beispiel siehe Tabelle of Materials) direkt die Annexin V Projektmappe hinzufügen. Fügen Sie fluoreszierende Lipid Farbstoff, N-(2-aminoethyl) Maleimide (siehe Tabelle der Materialien), bei 1 µM-Konzentration in 100 µL der FACS-Puffer zu kennzeichnen und identifizieren von MPs.
  2. MPs in Färbelösung für mindestens 20 min bei 4 ° c inkubieren
  3. Waschen der MPs durch Ultrazentrifugation (1 h bei 100.000 x g bei 4 ° C); verwerfen Sie den überstand.
  4. Im FACS Puffer Aufschwemmen und laufen die Proben auf einem ausgewiesenen Durchflusszytometer, ausgestattet mit einer aktualisierten elektronischen Einheit für erhöhte Empfindlichkeit (siehe Tabelle der Materialien).

7. Anträge auf isolierte PMN-MPs, PMN-Funktion bei der Wundheilung zu studieren

  1. In Vivo Verabreichung von PMN-MPs an Kolon Wunden
    1. Betäuben Sie Mäuse durch eine intraperitoneale Injektion einer Mischung von Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (5 mg/kg). Bestätigen Sie Betäubung durch Pedal Reflex (feste Zehe Prise) und passen Sie bei Bedarf.
    2. Platzieren Sie den Mauszeiger auf dem Bauch und mit 28 cm Biopsiezangen und ein Endoskop mit einer hochauflösenden Kamera ausgestattet (z. B. ein Veterinär Endoskop für die Verwendung von kleinen Tieren, siehe Tabelle der Materialien), generieren von 3-5 oberflächliche Wunden an der dorsalen Seite des die Kolon. Nach Abschluss der Verwundung Rückkehr Mäuse zu einem Käfig platziert auf einer kontrollierter Temperatur (37 ° C) Matte bis erholt.
    3. Mäuse (wie in Schritt 7.1.1) zu betäuben. Verwenden Sie ein Endoskop Bilder zugefügten Wunden 24 h (Tag 1) Post-Verwundung zu erwerben. Mäuse wie in Schritt 7.1.2 erholen zu lassen.
    4. Zur gleichen Zeit (24 h nach Verwundung) verabreichen Sie murinen PMN-m/s 2 x 106 PMNs in 100 µL HBSS + direkt in jede Wunde mit einer Koloskopie-basierte Mikroinjektion System (Verwendung einer 29-G-Nadel)9abgeleitet. Drei Tage später (4. Tag nach Verwundung) Mäuse (wie in Schritt 7.1.1) zu betäuben und verwenden Sie ein Endoskop, um Bilder der Wundheilung zurückzukaufen. Mäuse wie in Schritt 7.1.2 erholen zu lassen.
    5. Bevorzugte Bildanalyse-Software zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien), sichtbare Wunde Gliederungsbereiche im erworbenen Bilder, Maßnahme der Bereich der gleichen Wunde an Tag 1 und 4 nach Verwundung und berechnen den Prozentsatz der Wundverschluss.
  2. Menschliche epithelialen Zellen in Vitro Wundheilung
    1. Graf Caco-2 BBe oder T84, menschlichen intestinalen Epithelzellen durch Hemocytometer und Samen 5 x 105 Zellen/gut in Kultur 24-Well-Platten. Inkubieren Sie die Zellen in einer Kammer standard Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2. Caco-2 BBe oder T84 erreichen Konfluenz innerhalb 48 h9. Zu Kultur Epithelzellen, DMEM und DMEM-F12 (50: 50) mit Ergänzungen wie zuvor beschrieben,9.
    2. Mechanische kratzen Wunden in der Monolage mit einer Pipettenspitze generieren und niedrige Saugleistung wie oben beschrieben4,9. Abrufen von Bildern der Wunde Bereiche unmittelbar nach Kratzen mit einem invertierten Phasenkontrast-differential Interferenz Mikroskop (Einsatz 5 X oder 10 X Ziele), verwendet werden als eine Zeit = 0 Bezugspunkt.
    3. Zerkratzt-verwundet Epithelzelle Monolagen Abgeordneten (abgeleitet von 2-4 X 106 PMNs) hinzu, und inkubieren Sie für weitere 24 h (48 h nach Verwundung, bei 37 ° C mit 5 % CO2). Zu diesem Zeitpunkt neu erwerben Sie Bilder von Grund auf neu-Wunden.
    4. Bevorzugte Bildanalyse-Software zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien) messen Wunde Bereiche bei t = 0 und t = 48 h. berechnen den Prozentsatz der Wundverschluss durch die Bestimmung des Unterschied im Wundbereich zu ausgewählten Zeitpunkten.

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Ergebnisse

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Repräsentative durchflusszytometrischen Analyse von MPs, das wurden isoliert von Mensch und Maus PMNs sind in Abbildung 1dargestellt. Die Größe Heterogenität der PMN-MPs im Vergleich zu bekannten großen Perlen wie in Abbildung 1A, B für menschliche MPs. Note bewertet werden kann, wurden keine signifikanten Unterschiede in Größe Heterogenität zwischen Maus und Mensch MPs beobachtet. Ebenso kann mit Durchflusszytom...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolle für die Isolierung und Charakterisierung von PMN-abgeleitete MPs werden in dieser Mitteilung beschrieben. Mehrere wichtige kritische Punkte müssen für den Erfolg des Verfahrens berücksichtigt werden. Erstens muss PMNs frisch isoliert und in Experimenten innerhalb 2 h der Isolation verwendet, um zu verhindern, dass die spontane Aktivierung und Degranulation. Alle Behandlung der PMNs während Isolierung und bis zu dem Punkt der Stimulation muss auf Eis, Aktivierung und vorzeitige MP Version12

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt jeglicher Art im Zusammenhang mit dieser Mitteilung

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir sind dankbar für die technische Hilfeleistung des Dr. Suchitra Swaminathan, die den nordwestlichen Feinberg School der Medizin Flow Cytometry Kern läuft. Finanzierung sorgte (NIH) DK101675.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEMCorning10-041-CV
Fötales Rinderserum (hitzeinaktiviert)Atlanta BiologicsS11150
Penicillin/Streptomycin (10.000 Einheiten Penicillin / 10.000 mg/ml Streptomycin)GIBCO15140
0,5 M EDTAFisherBP2482
NatriumchloridSigmaS9888Steril und gefiltert durch eine 0,1 Mikron-Filtereinheit
Sterilfiltriert Histopaque 1077Sigma10771
Steril filtriert Histopaque 1119Sigma11191Dichte 1.119 g/ml.  Lösung von Polysaccharose und  Natriumdiatrizoat.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne Calcium und MagnesiumCellgro210-40-CV
Ethylalkohol (200 Proof)Decon labs2701
HBBSCorning21-022-CV
Trypanblau-Lösung, 0,4%SigmaT8154  SIGMAVerdünnt 1:2 für die Zählung der Zellviabilität
IsofluranAbbot50033
Anti-humanes CD11b-APC konjugiertBiolegend301350Klon ICRD44 (Endkonzentration: 1 & Mikro; g/mL)
BODIPY FLInvitrogenB10250N-(2-aminoethyl)maleimid 
Annexin V Binding BufferBiolegend422201
Kalibrierungskügelchen für die DurchflusszytometrieBioCytex7803
FITC Annexin VBiolegend640906
PolymorphprepAxis-Shield PoC ASNatriumdiatrizoat/Dextran 500, Dichte 1,113 g/ml
C57BL/6 MäuseJackson Labs
15 ml Zentrifuge RöhrchenCorning430053
50 ml ZentrifugenröhrchenBD Falcon352070
25 ml serologische PipettenCelltreat229225B
10 ml serologische PipettenCelltreat229210B
5 ml serologische PipettenCelltreat229205B
Pasteurpipetten BD Falcon357575
25 G x 5/8 Zoll Nadeln (Präzisions-Gleitnadeln)BD305122
100 µ m ZellsiebeCelltreat229485
Vacutainer-RöhrchenBD367251
Equipment
LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP)BD(SORP)
SchwingschaufelzentrifugeThermoFisher Scientific75007210
UltrazentrifugeBeckman(L8-80 M)
MikrozentrifugeThermoFisher Scientific  VV-17703-15 (Fresco 17)
SchwingzentrifugeThermoFisher Scientific 75004503 (Megafuge 40R)
Biopsiezange, 28 cmStorz27071zj
Software
Image JNational Institute of HealthOpen source 
auf Raumtemperatur bringen

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Neutrophil MicroparticlesMicroparticle IsolationFlow CytometryImmunoblottingDensity Gradient CentrifugationUltracentrifugationCell Debris RemovalFluorescent LabelingWound Healing AssayInflammatory Markers

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