Summary
Mitokondrierna innehåller flera flavin-beroende enzymer som kan producera reaktiva syreradikaler (ROS). Övervakning ROS är release från enskilda platser i mitokondrier utmanande på grund av oönskade sidoreaktioner. Vi presenterar en enkel och billig metod för direkt bedömning av inhemska priser för ROS release med hjälp av renat flavoenzymes och mikroplattan fluorometry.
Abstract
Det har rapporterats att mitokondrier kan innehålla upp till 12 enzymatisk källor av reaktiva syreradikaler (ROS). En majoritet av dessa platser inkluderar flavin-beroende respiratoriska komplexen och mellan östradiol och östron som producerar en blandning av superoxid (O2● -) och väteperoxid (H2O2). Exakt kvantifiering av ROS-producerande potentialen hos enskilda platser i isolerade mitokondrier kan vara utmanande på grund av förekomsten av antioxidant försvarssystem och sidoreaktioner som också bildar O2● -h2O2. Användning av ospecifik hämmare som kan störa mitokondriell blockeringar kan också äventyra mätningar genom att ändra ROS release från andra platser i produktion. Här presenterar vi en enkel metod för samtidig mätning av H2O2 release och nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH) produktion av renat flavin-kopplad mellan östradiol och östron. För våra syften här, har vi använt renat pyruvat dehydrogenas komplexet (PDHC) och α-ketoglutarat dehydrogenas komplexa (KGDHC) av svin hjärtat ursprung som exempel. Denna metod möjliggör en korrekt bild av infödda H2O2 release priser av enskilda platser av produktionen genom att eliminera andra potentiella källor av ROS och antioxidativa system. Denna metod möjliggör dessutom en direkt jämförelse av förhållandet mellan H2O2 release och enzymaktivitet och screening av effektiviteten och selektivitet av hämmare för ROS produktion. Sammantaget kan detta tillvägagångssätt för fördjupad bedömning av inhemska priser av ROS release för enskilda enzymer före genomföra mer sofistikerade experiment med isolerade mitokondrier eller permeabilized muskelfiber.
Introduction
Det yttersta målet för näringsämnen metabolism är att göra omvandlingen av adenosintrifosfat (ATP). I däggdjursceller sker detta i mitokondrierna, dubbel-membraned organeller som omvandlar den energi som lagras i kol till ATP. Produktionen av ATP börjar när kol förbränns av mitokondrier bildar två elektron bärare, NADH och flavin-adenin-dinukleotid (Fransson2)1. NADH och Forslund2 sedan oxideras av flera subenhet respiratoriska komplexen I och II, respektive, och de frigjorda elektronerna är flottade till terminal elektron acceptorn molekylära syret (O2) komplex IV1. Thermodynamically gynnsamma ”neråt” överföring av elektroner till O2 i slutet av kedjan är kopplat till export av protoner i intermembrane utrymme av komplex I, III och IV. Detta skapar en transmembrana elektrokemiska gradient av protoner (proton-drivkraft), en tillfällig form av Gibbs fria energi som tappas av komplex V att göra ATP2. Electron överföring reaktioner i mitokondrier är inte perfekt kopplat till ATP produktionen. På olika punkter i Krebs cykel och respiratoriska kedjan, kan elektroner förtidigt interagera med O2 till blankett ROS3. De mest biologiskt relevanta ROS som genereras av mitokondrierna är O2●- och H2O2. Även om O2● - anses ofta vara den proximala ROS som bildas av mitokondrier, är det nu uppenbart att platser av produktionen utgör en blandning av O2●- och H2O2, som är associerad med den fria radikalkemi av flavin prostetiska grupper4,5. Vid höga nivåer, kan ROS vara farligt, skada biologiska beståndsdelar som behövs för cellernas funktion som leder till oxidativ stress6. Men på låga belopp uppfylla mitokondriell ROS vitala signalering funktioner. Exempelvis har H2O2 release från mitokondrier varit inblandade i styrning av T-cells aktivering, stress signalering (t.ex., induktion av Nrf2 signalvägar), induktion av cellproliferation och differentiering, insulin signalering och release, och utfodring beteende7. Avsevärda framsteg har gjorts för att förstå funktionen signalering av ROS. Dock viktiga frågor fortfarande för vilka enzymer i mitokondrierna fungerar som de viktigaste källorna och hur produktionen kontrolleras.
ROS release av en webbplats av produktionen beror på flera faktorer: 1) koncentrationen av den elektron att donera site, 2) redox delstaten electron att skänka platsen, (3) tillgång till syre, och (4) den koncentration och typ av oxidation substrat3, 8 , 9. i mitokondrierna, andra faktorer som koncentrationen av NADH och membran potentiella styrka också påverka ROS produktion8,10. Till exempel, ökar O2● -h2O2 produktionstakten av renat PDHC eller KGDHC med ökande NADH tillgänglighet5,11. I det här fallet flödar elektroner bakåt från NADH till FAD center i den E3 subuniten av PDHC eller KGDHC, webbplatsen för O2● -h2O2 produktion12. Likaså har tillhandahållande av NAD+ motsatt effekt, minskar ROS release från KGDHC12. Således, kontrollerande inresa eller utresa av elektroner från platser av ROS produktion kan ändra hur mycket O2● -h2O2 bildas. Till exempel blockerar den E2 subuniten av PDHC eller KGDHC med CPI-613, en analog, resulterar i en nästan 90% minskning av O2● -h2O2 produktion13liponsyra. Liknande resultat kan erhållas med kemiska S-glutathionylation katalysatorer, diamide och disulfiram, som nästan avskaffa O2● -h2O2 produktion av PDHC eller KGDHC via konjugationen av glutation till E 2 subenhet14. Avvägningen för att blockera elektronflödet genom den E2 subuniten av PDHC och KGDHC är en minskning av NADH produktion vilket minskar ROS bildandet av elektron transportkedjan (t.ex., komplex III). Detta kan också minska ATP produktionen av elektron transportkedjan. Sammantaget kan blockerar elektron inträde till platser av ROS produktion vara ett mycket effektivt sätt att styra O2● -h2O2 produktion.
Mitokondrier kan innehålla upp till 12 potentiella O2● -h2O2 källor6. De flesta av dessa platser är flavin-innehållande enzymer som skapar en blandning av O2●- och H2O2. Användningen av olika substrat och hämmare kombinationer har tillåtet för identifiering som respiratoriska komplexen och mitokondrie mellan östradiol och östron fungera somhög kapacitet O2● -h2O2 bildar platser i olika vävnader3. PDHC och KGDHC har visat sig fungera som hög kapacitet O2● -h2O2 utsändande platser i muskel och lever mitokondrier13,15. Vissa svårigheter kvarstår dock när det gäller undersökningen av O2● -h2O2 utgör potentiella av enskilda webbplatser i mitokondrierna och inverkan som olika substrat och hämmare kombinationer har på verksamheten i enzymerna. Detta på grund av förekomsten av oönskade sidoreaktioner (t.ex., bildandet av O2● -h2O2 av webbplatser än enzymet av intresse), kontaminerande kroppsegna näringsämnen (t.ex.,fettsyror syror) eller organeller (t.ex., peroxisomes som också bildar O2● -h2O2), och användning av hämmare som saknar selektivitet eller användning av föreningar som inte hämmar fullt ROS produktion. Vissa hämmare kan också förändra mitokondriell Bioenergetik och elektron flödesriktning, och detta förändrar ROS release från andra platser i produktion och förvirrar resultat. Absoluta priser för O2●h2O2 frisättning från enskilda platser i mitokondrier är också svåra att kvantifiera på grund av den höga koncentrationen av O2●- och H2O2 eliminera enzymer i matrix och intermembrane rum. Därför, eliminering av eventuella konkurrerande reaktioner som kan störaO2● -h2O2 release mätningar kan vara användbart vid identifiering av hög kapacitet O2● -h2O2 bildar platser.
Här presenterar vi en enkel metod som möjliggör samtidig undersökning av O2● -h2O2 produktion och NADH bildandet av renat flavin-beroende mellan östradiol och östron. Genom att använda renat enzymer, kan oönskade ROS bildar sidoreaktioner och ROS förnedrande enzymer elimineras möjliggör ett mer exakt mått på infödda O2● -h2O2 produktion priser för enskilda flavoenzymes. Denna metod kan användas för att direkt jämföra O2● -h2O2 bildar kapaciteten av olika renat mellan östradiol och östron eller till skärmen potentiella platsspecifika hämmare för O2● -h2O 2 release. Slutligen, mäta O2● -h2O2 och NADH produktion samtidigt kan medge en realtid bedömning av förhållandet mellan enzymaktivitet och ROS release kapacitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kemikalier och renade enzymer
- Upphandlar följande material: PDHC och KGDHC svin hjärtat ursprung (eller en annan renat mitokondriella flavoenzyme); H2O2 (30% lösning), pyruvat, α-ketoglutarat, NAD+, NADH, CoASH, tiamin pyrofosfat (TPP), mannitol, HEPES, sackaros, EGTA, 3-metyl-2-oxo Valerian syra (KMV), superoxiddismutas (SOD), pepparrotsperoxidas (HRP), 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine reagens (AUR) och CPI-613.
2. planering av Assay och REAGENSBEREDNING
- Ställa in analysen enligt tabell 1 i en plattan med 96 brunnar.
Obs: Den totala volymen för varje reaktion är 200 µL. lager koncentrationer är justerade så att 20 µL av reagens tillsätts till varje brunn. Detta säkerställer snabb tillsättning av kofaktorer och substrat till varje reaktion väl innan du startar analysen. - Förbereda reaktion buffert innehållande 220 mM mannitol, 70 mM sackaros, 1 mM EGTA och 20 mM HEPES (pH 7,4 med HCl).
Obs: Detta kan ändras beroende på de fysiska egenskaperna hos olika renade enzymer. - Undersöka renat KGDHC eller PDHC för kontaminering med enzym aktivitet analyser14,16,17 eller av immunoblot eller Coomassie bets5.
- Förbereda alla reagenser i reaktion bufferten per arbetande lösning halterna i tabell 1.
- Lagra alla reagenser som 1 mL alikvoter vid-20 ° C. Lagra pyruvat och α-ketoglutarat vid-80 ° C i 100-µL portioner att förhindra spontana nedbrytning på grund av självoxidering och upprepad frysning-tining.
- Förbereda AUR reagensen master stock i 1 mL av DMSO och späd sedan till 100 µM i reaktion buffert. Förvaras skyddat från ljus.
Obs: Här, 100 µM arbetslösning är gjort färska varje 2 till 3 veckor och skyddas från ljus.
3. ställa in mallen Assay
- Ställa in analysförfarandet på en monokromatisk microplate reader med dubbla mätning kapacitet.
- Definiera behandlingen förfarandet genom att välja ”protokoll”. Klicka sedan på ”förfarande”.
- Ange ”temperatur” till 25 ° C (figur 1A).
- Klicka på ”Starta KINETIC” för att ställa in Läs villkor (figur 1A). Ange tid och antal Läs intervall/experiment.
- Klicka på ”Läs” (figur 1B).
Obs: Läs prover från toppositionen med en vinst på 50. Tid: 5 min, Läs 30-s mellanrum. Kanal 1: Resorufin fluorescens - excitation/utsläpp = 565 nm:600 nm, våglängd bredd 13,5 nm. Kanal 2: NADH autofluorescens - excitation/utsläpp = 376 nm:450 nm, våglängd bredd 20 nm. - Under ”Läs”, Välj brunnar till bildskärm (t.ex., A1-A4 och B1-B4).
- Välj ”END KINETIC”.
4. standarden kurvor
- Tina reagenserna och lagra på is tills det behövs.
-
NADH standardkurvan (figur 2A)
- Förbereda de fungerande lösningarna för NADH koncentrationen mellan 0,5-10 mM i reaktion buffert.
- Tillsätt 20 µL portioner från varje NADH arbetar lösning koncentration till brunnar innehållande 180 µL reaktion buffert. NADH slutliga koncentration i varje brunn är 0,05-1 mM.
- Klicka på ”Läs” och ange excitation/utsläpp = 376 nm:450 nm, våglängd bredd 20 nm.
Obs: Detta är en slutpunkt som skrivskyddad - kinetiska parametrar krävs inte.
-
AUR standardkurvan (figur 2B)
- Förbereda de arbetande bestånd av väteperoxid i reaktion buffert; beståndet koncentrationer varierar från 200-4000 nM.
- Tillsätt 120 µL av reaktion bufferten till varje brunn.
- Tillsätt 20 µL av HRP (arbetar lager koncentration = 30 U/mL, slutlig koncentration i brunnen = 3 U/mL), 20 µL av SOD (arbetar lager koncentration = 250 U/mL, slutlig koncentration i brunnen = 25 U/mL), och 20 µL av AUR (arbetar lager koncentration = 100 µM slutlig koncentration i brunnen = 10 µM) till varje brunn innehållande reaktion-buffert.
- Tillsätt 20 µL av varje H2O2 arbetar stamlösning till varje brunn innehållande buffert och assay reagenser. Den slutliga reaktionsvolym är 200 µL och slutliga koncentration H2O2 i varje brunn är 20-400 nM.
- Inkubera plattorna för 1 min i plattan läsaren vid 25 ° C.
- Klicka på ”Läs” och ange excitation/utsläpp = 565 nm/600 nm, våglängd bredd 13,5 nm. Observera att detta är en slutpunkt som skrivskyddad - kinetiska parametrar krävs inte.
5. att mäta O2● - h2 O2 Release och NADH produktion av KGDHC och PDHC
- Se tabell 1 för beställa av tillägg av olika reagenser, koncentrationen av varje fungerande lösning, och volymen tillsätts varje brunn.
- Tillsätt 40 µL av reaktion buffert till varje brunn. För analyser med hjälp av KMV eller CPI-613, tillsätt 20 µL buffert i varje brunn.
- Tillsätt 20 µL av PDHC eller KGDHC (fungerande lager 1 U/ml, slutlig koncentration per brunn = 0,1 U/mL) till varje brunn.
- Inkubera PDHC och KGDHC vid 25 ° C under 2 minuter.
- Tillsätt 20 µL av KMV (fungerande lager = 100 mM, slutlig koncentration = 10 mM) eller 20 µL av CPI-613 (arbetar lager koncentration = 1,5 mM, slutlig koncentration = 150 µM) (tabell 2).
Obs: Detta steg kan uteslutas om hämmare inte används för analyserna. - Inkubera i 1 min vid 25 ° C.
Obs: Detta steg kan uteslutas om hämmare inte används för analyserna. - Tillsätt 20 µL av HRP (arbetar lager koncentration = 30 enheter/mL, slutlig koncentration i brunnen = 3 enheter/mL) och 20 µL av SOD (arbetar lager koncentration = 250 enheter/mL, slutlig koncentration i brunnen = 25 enheter/mL) till varje brunn.
- Tillsätt 20 µL av coenzym A (arbetar lager koncentration = 1 mM, slutlig koncentration = 0,1 mM), 20 µL av TPP (arbetar lager koncentration = 3 mM, slutlig koncentration = 0,3 mM), och 20 µL av NAD+ (arbetar lager koncentration = 10 mM, slutlig koncentration = 1 mM) till varje w ell.
- Ta bort AUR reagensen från skyddande tinfoil täcker och tillsätt 20 µL till varje brunn.
- Tillsätt 20 µL pyruvat (arbetar lager koncentration allt från 1-100 mM, slutlig koncentration för analyser = 0,1-10 mM) till brunnar som innehåller PDHC och α-ketoglutarat (arbetar lager koncentration allt från 1-100 mM, slutlig koncentration för analyser = 0,1-10 mM) till brunnar som innehåller KGDHC.
- Klicka på ”Läs” för att starta kinetiska mätningen.
6. dataanalys
- Håll 'CTRL' knappen på tangentbordet och klicka på brunnar för att generera en graf som innehåller alla kinetiska mätningar motsvarande kanal 1 (figur 3A).
- Klicka på ”data” i Visa ikonen i det övre högra hörnet för raw värden för relativ fluorescens enheter (RFU) mäts vid olika tidpunkter (figur 3B).
- Exportera värden för analys (tabell 3).
- Klicka på ”Graph” rullgardinsmenyn på längst upp till höger (figur 3B) för att komma åt RFU-värden som är associerade med fluorescens kanal 2.
- Upprepa steg 6.1-6.3 för kanal 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3A ger en representativ trace för RFUEN samlas in under samtidig mätning av H2O2 och NADH produktion av renat KGDHC. RFU rådata för varje tidsintervall avbildas i figur 3B. RFU rådata exporteras sedan för analys. Genom att extrapolera från standard kurvor presenteras i figur 2, kan den absoluta mängden NADH och H2O2 bildas vid varje mätning intervall under perioden 5-min bestämmas. Ett exempel på denna beräkning finns i tabell 3. När mängden NADH och H2O2 bildas av KGDHC eller PDHC med olika intervall har fastställts, värden kopieras och matas in i en grafritande/statistisk programvara för vidare analys. Med hjälp av XY diagram-typ analys, kan mängden NADH (µmol) och H2O2 (pmol) bildas av KGDHC eller PDHC ritas som en funktion av tiden (figur 4A). Med hjälp av dessa värden, kan graden av NADH och H2O2 bildandet under substrat oxidation också beräknas. Som visas i figur 4B, visar KGDHC och PDHC olika egenskaper i form av NADH och H2O2 bildar kapacitet.
När det har fastställts att KGDHC och PDHC är enzymatiskt aktiva och NADH och H2O2 bildandet kan spåras samtidigt, ROS release boenden och Enzymaktiviteter kan mätas. Vi valde att jämföra KGDHC och PDHC eftersom de är mycket homologa i grundstrukturen och har dokumenterats vara hög kapacitet platser för ROS produktion5. Figur 5 och figur 6 visar beroendet av NADH och H2O2 produktion på substrat koncentrationen. PDHC är enkelt mättad av låga mängder substrat med NADH och H2O2 produktionstakten når sitt maximum på 0,1-0,5 mM pyruvat. KGDHC, däremot, visar stegvis ökar i NADH och H2O2 produktion med ökande α-ketoglutarat (figur 5). Detta visar att KGDHC och PDHC, även om mycket homologa i grundstrukturen, har olika kinetiska egenskaper vad gäller hur mycket substrat krävs för att framkalla maximal ROS release. Figur 5 visar också att H2O2 release från KGDHC korrelerar starkt med NADH produktion och substrat tillgänglighet. PDHC å andra sidan har inte samma kinetiska egenskaper. KGDHC och PDHC skiljer sig också i form av NADH och O2● -h2O2 bildar kapacitet när NAD+ koncentration är varierad (figur 6).
Genom att utnyttja samtidig mätning av NADH och H2O2, kan potentiella platsspecifika hämmare för ROS produktion kontrolleras. Detta kan hjälpa vid fastställandet av hämmare som krävs för att framkalla maximal hämning av H2O2 release. Dessutom, genom att mäta NADH produktion samtidigt, kan platsen för hämmare åtgärder samt källan till ROS identifieras. Tidigare studier har visat att α-ketoglutarat analog, KMV, är mycket effektiva på att hämma ROS release från KGDHC (≥ 90% hämning)13,15. Vi visade också att CPI-613, en analog liponsyra som blockerar dihydrolipoamide för den E2 subuniten av PDHC och KGDHC, kan också hämma ROS release från antingen komplex av ~ 90%13,14. Webbplatsen för KMV och CPI-613 visas i figur 7. CPI-613 är en svavel innehållande molekyl och det rekommenderas därför att thiol-rika reduktionsmedel (Ditiotreitol; DTT) eller proteiner (albumin) utelämnas från den procedur13. Figur 7 visar att både KMV och CPI-613 var båda mycket effektivt på att begränsa både NADH och H2O2 av KGDHC. Jämväl, CPI-613 helt avskaffat H2O2 release från PDHC (figur 7). Sammantaget visar dessa resultaten att KMV och CPI-613 är mycket effektiv hämmare för H2O2 release och kan således appliceras på experiment med isolerade mitokondrier. Sådan skärm skulle vara mycket fördelaktigt för andra potentiella ROS-bildar enzymer eftersom den möjliggör en direkt bedömning av effektiviteten och selektivitet av olika hämmare på renat flavin-innehållande mellan östradiol och östron. Samtidig mätning av NADH har också fördelen av möjliggör preliminär identifiering av potentiella källan till ROS inom ett enzym complex. Figur 7 ger en skildring av den katalytiska mekanismen för KGDHC, vilket är mycket homologa till PDHC. Observationen att KMV och CPI-613, som blockerar E1 och E2 subuniten av KGDHC, nästan helt avskaffas både H2O2 och NADH produktion, bekräftar att den E3 subuniten, sannolikt modefluga, är ROS källan 18. CPI-613 utövade en liknande effekt på PDHC bekräftar att principen platsen för H2O2 release är det E3 subenhet18. Ett liknande tillvägagångssätt kan användas för andra mellan östradiol och östron. Detta skulle kräva identifiering av hämmare som blockerar elektronflödet genom olika delar av ett enzymkomplex.
Figur 1 : Representativa skärmdumpar för assay setup. (A) skildring av förfarandet som fastställs för kinetiska mätning av förändringar i NADH och resorufin fluorescens. (B) ställa in parametrarna fluorescens för analysen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativa standard kurvor för NADH och resorufin fluorescens. Kurvor används för att uppskatta graden avNADH och O2● -h2O2 produktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Representativa spår för raw RFU-data som samlats in under analysens. (A) kurvor för varje brunn som lästes under analysen. Plattan Visa kurvorna genereras genom att hålla ned CTL-knappen och klicka på varje brunn som läses. (B) för dataexport, klickas DATA under Visa att generera en tabell som innehåller de representativa RFU-värdena. Knappen Exportera kalkylblad klickas sedan exportera de raw resultat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Direkt jämförelse av H2 O 2 och NADH bildar priser av KGDHC och PDHC. (A) samtidig mätning av H2O2 och NADH som utgör potentiella KGDHC och PDHC. (B) Beräkning av H2O2 och NADH bildandet av KGDHC och PDHC. Direkt jämförelse av produktionen av båda flavin-innehållande enzymer NADH och ROS visar att KGDHC producerar mer H2O2 som är relaterad till dess högre enzymatisk kapacitet. n = 4, menar ± SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5 : Samtidig mätning av H 2 O 2 och NADH bildas priser av KGDHC och PDHC oxiderande olika substrat koncentrationer. Förändringar i fluorescens mättes som tidigare beskrivits utom sista substrat koncentrationen var varierade från 0 mM till 10 mM. Denna metod användes för att fastställa beroendet av H2O2 release på kinetiska egenskaper KGDHC och PDHC. n = 4, menar ± SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6 : KGDHC och PDHC också visa olika H2 O 2 och NADH bildas boenden när NAD + nivåer byts. Förändringar i fluorescens mättes som tidigare beskrivits förutom NAD+ slutliga koncentration var varierade från 0 mM till 1 mM. Denna metod användes för att fastställa beroendet av H2O2 release på kinetiska egenskaper KGDHC och PDHC. n = 4, menar ± SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 7 : Screening av olika platsspecifika hämmare för NADH och H2 O 2 produktion. (A) Diagram skildrar den katalytiska cykeln för KGDHC och platser för KMV och CPI-613. Observera att PDHC har en homolog katalytisk cykel, förutom att KMV inte konkurrerar pyruvat bindningsstället. E1: pyruvat eller α-ketoglutarat dehydrogenas, E2: dihydrolipoamide acyltransferase, E3: dihydrolipoamide-dehydrogenas. (B) effekt av KMV och CPI-613 NADH och H2O2 produktion av KGDHC och PDHC. Proverna var teststamman i KMV (10 mM) eller CPI-613 (150 µM) och sedan analyseras för NADH och H2O2 produktion. n = 4, menar ± SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Reagens | Arbetar lager koncentration | Volym till väl | Slutlig koncentration i väl |
| KGDHC eller PDHC | 1 enheter/mL | 20 ΜL | 0,1 enheter/mL |
| Superoxiddismutas | 250 enheter/mL | 20 ΜL | 25 enheter/mL |
| Pepparrotsperoxidas | 30 enheter/mL | 20 ΜL | 3 enheter/mL |
| Tiamin pyrofosfat | 3 mM | 20 ΜL | 0,3 mM |
| Coenzym A | 1 mM | 20 ΜL | 0,1 mM |
| NAD+ | 10 mM | 20 ΜL | 1 mM |
| 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine | 100 ΜM | 20 ΜL | 10 ΜM |
| Substrat | 1-100 mM | 20 ΜL | 0,1-10 mM |
Tabell 1: Exempel av ett grundläggande protokoll Ställ in för mätning av O 2 ●– / H 2 O 2 och NADH produktion av renat PDH eller KGDH. Eftersom 20 µL av varje reagens tillsätts varje brunn och slutliga volym/reaktion är 200 µL, slutliga koncentration av varje reagens är 10 gånger mindre än lager koncentrationen (t.ex., NAD+ slutliga koncentration i reaktionsblandningen är 1 mM ). Observera att reagenserna bör läggas till brunnen i den ordning som visas i tabellen.
| Hämmare | Mål |
| 3-metyl-2-oxo Valerian syra | E1 subuniten av KGDHC |
| KPI-613 | E2 subuniten av oxo syra mellan östradiol och östron |
Tabell 2: förteckning över hämmare och deras mål. Platser av åtgärd avbildas också i figur 8.
| NADH autofluorescens | |||||||||
| PDHC | KGDHC | ||||||||
| Tid | T ° 376,450 | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 |
| 0:00:04 | 24,4 | 99 | 99 | 91 | 88 | 85 | 82 | 58 | 88 |
| 0:00:34 | 24,4 | 128 | 107 | 99 | 108 | 81 | 80 | 77 | 78 |
| 0:01:04 | 24,4 | 124 | 128 | 117 | 139 | 97 | 88 | 97 | 76 |
| 0:01:34 | 24,4 | 146 | 142 | 129 | 132 | 91 | 97 | 84 | 78 |
| 0:02:04 | 24,4 | 161 | 153 | 148 | 146 | 90 | 107 | 95 | 88 |
| 0:02:34 | 24,4 | 171 | 160 | 156 | 145 | 97 | 103 | 111 | 122 |
| 0:03:04 | 24,4 | 176 | 176 | 161 | 169 | 109 | 120 | 99 | 116 |
| 0:03:34 | 24,4 | 186 | 180 | 179 | 167 | 118 | 123 | 121 | 119 |
| 0:04:04 | 24,4 | 201 | 182 | 187 | 183 | 127 | 124 | 119 | 131 |
| 0:04:34 | 24,4 | 225 | 190 | 195 | 186 | 136 | 143 | 124 | 132 |
| 0:05:04 | 24,4 | 227 | 227 | 203 | 197 | 115 | 143 | 121 | 143 |
| Resorufin fluorescens | |||||||||
| PDHC | KGDHC | ||||||||
| Tid | T ° 565,600 | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 |
| 0:00:00 | 24,4 | 204 | 178 | 169 | 152 | 148 | 113 | 107 | 90 |
| 0:00:30 | 24,4 | 224 | 188 | 167 | 152 | 144 | 116 | 124 | 112 |
| 0:01:00 | 24,4 | 212 | 186 | 178 | 161 | 153 | 114 | 122 | 120 |
| 0:01:30 | 24,4 | 212 | 188 | 165 | 164 | 160 | 132 | 127 | 116 |
| 0:02:00 | 24,4 | 222 | 203 | 190 | 169 | 154 | 128 | 133 | 127 |
| 0:02:30 | 24,4 | 217 | 198 | 193 | 179 | 165 | 129 | 147 | 130 |
| 0:03:00 | 24,4 | 223 | 218 | 202 | 179 | 183 | 142 | 145 | 137 |
| 0:03:30 | 24,4 | 239 | 223 | 208 | 188 | 179 | 150 | 155 | 148 |
| 0:04:00 | 24,4 | 236 | 219 | 202 | 183 | 180 | 163 | 156 | 153 |
| 0:04:30 | 24,4 | 249 | 220 | 214 | 177 | 199 | 149 | 150 | 167 |
| 0:05:00 | 24,4 | 251 | 232 | 225 | 196 | 211 | 170 | 169 | 161 |
Tabell 3: kalkylbladsvyn resultaten samlas in från uppsättningen experiment. Råa RFU-värden som genereras från experiment exporteras till ett kalkylblad för vidare analys. Använder standard kurvor genererade före experimenterande, kan NADH och H2O2 produktionstakten beräknas i kalkylbladet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll är fördelaktigt eftersom, 1) den eliminerar eventuella konkurrerande reaktioner som kan annars störa H2O2 identifiering (t.ex., antioxidant system eller andra källor av ROS), 2) ger en direkt bedömning av den infödda ROS release av en flavin-innehållande mitokondriell dehydrogenas, 3) tillåter jämförelse av infödingen ROS release priser av två eller mer renad flavin-baserade mellan östradiol och östron, 4) kan tillåta för en direkt jämförelse av ROS release och enzym aktivitet och 5) tillåter visning av selektiv konkurrenskraftiga hämmare för ROS release. Vår grupp och andra har använt denna metod i tidigare publikationer för att undersöka regleringen av ROS av Alloster och redox signalering mekanismer innan utförs experiment med mitokondrier eller permeabilized muskel14,16, 17,19,20.
Modifieringar och felsökning:
Denna procedur använder grundläggande utrustning tillgänglig vid nästan varje institution. Metoden är också låg kostnad och använder vanliga kemikalier tillgänglig via olika leverantörer. Buffert sammansättning kan variera beroende enzymet boenden - även om vi har funnit att en grundläggande reaktionen buffert som består av sackaros, HEPES, mannitol och EGTA fungerar bra i de flesta applikationer. Råa värden för resorufin fluorescens är vanligtvis cirka 50-500 RFU för en ROS släppa enzym utspädd till 0,1 U/mL. Högre RFU värden kan indikera AUR reagens har auto-oxideras på grund av exponering för ljus eller upprepad frysning-tining. Därför bör AUR fungerande lösningar rutinmässigt ersättas varje 2 till 3 veckor (beroende på användningsfrekvens). Orenheter i enzympreparat eller denaturering kan leda till lägre än normala ROS och NADH avläsningar. Enzymet renhet övervakas rutinmässigt med gelelektrofores. Kinetiska egenskaper (Km och Vmax för substrat och NAD+) bör också bedömas omedelbart efter köpet eller rening av ett enzym och då rutinmässigt övervakas därefter. De flesta av de reagens som används i analysen är stabila och kan bli föremål för flera frysning-tining cykler. Pyruvat och α-ketoglutarat ska förvaras i alikvoter av 100 µL vid-80 ° C att undvika auto-oxidation. Undvik att använda reduktionsmedel som DTT eftersom det bildar O2● -h2O2 direkt genom radikala bildande i PDHC och KGDHC (och eventuellt andra flavoenzymes)17. Analyser kan genomföras vid 37 ° C; vår grupp har emellertid funnit att genomföra dessa experiment vid 25 ° C är idealisk för att ge mer konsekventa data.
Begränsningar av tekniken:
Ett stort hinder är associerad med denna teknik är renat flavin-innehållande mitokondriella enzymer. Här, brukade vi kommersiellt tillgängliga KGDHC och PDHC visar att denna teknik kan användas för att direkt jämföra ROS release kapacitet och enzym aktivitet flavin-innehållande mitokondriell mellan östradiol och östron. Men de flesta ROS producerar flavin-innehållande enzymer är inte kommersiellt tillgängliga och måste renas i laboratoriet. Detta kan vara svårt med tanke på några av dessa enzymer är membran bunden eller absorbera till mitokondriell inre membranet. Det finns nu nya protokoll för lyckad rening av membran-bundna flavin-innehållande enzymer som producerar ROS. Detta inkluderar reningsmetoder för komplex I, komplex II och sn-glycerol-3-fosfatdehydrogenas21,22,23. Därför, även om de flesta av de börsnoterade ROS-generatorerna inte kanske är kommersiellt tillgängliga, protokoll finns för deras isolering och rening. Den fysiologiska relevansen av resultaten samlas med renat flavin-baserat enzymer är också en begränsning. Resultaten samlas in med renade enzymer bör därför följas upp med analyser med isolerade mitokondrier eller permeabilized vävnad. Fem separata studier används denna metod för att undersöka mekanismer för reglering av ROS release av KGDHC och PDHC14,16,17,19,20. Preliminära resultat för rollen av redox växlar kontrollera ROS release testades först med renat KGDHC och PDHC, och sedan mekanismer för reglering analyserades ytterligare i levern och hjärt mitokondrier och muskelfiber14, 16,17,20.
Betydelse med avseende på befintliga metoder:
Mäta ROS kan release från enskilda platser av produktionen i mitokondrier vara utmanande på grund av förekomsten av konkurrerande sidoreaktioner som också producerar O2● -h2O2 och antioxidativa system som annars kan leda till underskattningen av infödda. Membranpotentialen kan också förändra ROS release priser från olika platser och användningen av hämmare kan förändra elektronflödet, confoundingO2● -h2O2 bildandet mätningar. Metoden presenteras här tillåter direkt utvärdering av ROS release kapacitet från enskilda enzymer medan samtidigt bedöma förhållandet mellan inhemska priser O2● -h2O2 och enzym aktivitet. Här billig metod kan fungera som ett verktyg för att jämföra de infödda ROS release priserna för enskilda flavin-innehållande mitokondriella enzymer före genomföra mer sofistikerade experiment med mitokondrier, celler eller vävnad. Metoden presenteras häri kan dessutom utnyttjas för att förhandsgranska effektivitet och selektivitet av hämmare för ROS release innan utförs analyser med isolerade mitokondrier.
Framtida tillämpningar:
Metoden presenteras häri har använts i fem separata studier syftar till att utreda kontroll över ROS release från PDHC och KGDHC14,16,17,19,20. I dessa studier hämmare screenades och ROS release och NADH producerar priser utvärderades med renade enzymer. Resultat insamlade med renade enzymer kontrollerades sedan använda isolerade mitokondrier och permeabilized muskelfibrer14,16,17,20. Denna metod kan därför tillämpas på ett antal framtida studier syftar till att studera infödda ROS release priser från mitokondrier, celler och muskelfibrer.
Kritiska steg i protokollet:
Enzymet renhet och dess kinetiska egenskaper bör övervakas rutinmässigt. AUR arbetar lager reagens bör också bytas oftare. Detta kommer att säkerställa resultat insamlade är konsekvent. Tillägg av reagenser är avgörande för att köra ett lyckat experiment (tabell 1). Hämmare bör titreras för att bestämma den koncentration som krävs för att framkalla maximal hämning av ROS release. I denna studie valde vi 10 mM KMV och 150 µM CPI-613 eftersom vi hade tidigare bestämt att dessa koncentrationer framkalla maximal hämning av ROS release av KGDHC och PDHC13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det finns inget att redovisa.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av de naturliga vetenskaperna och Engineering Research rådet av Kanada (NSERC). Videoproduktion genomfördes i samarbete med centrum för Innovation inom undervisning och lärande (oberoende Transaktionsförteckning) på Memorial universitet av Newfoundland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pyruvate dehydrogenase complex | SIGMA | P7032-10UN | purified flavoenzyme |
| alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex | SIGMA | K1502-20UN | purified flavoenzyme |
| 30% hydrogen peroxide solution | SIGMA | HX0640-5 | reagent, standard curves |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | reagent, standard curves |
| pyruvate | SIGMA | P2256-5G | reagent, activity/ROS release assay |
| alpha-ketoglutarate | SIGMA | 75892-25G | reagent, activity/ROS release assay |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | reagent, activity/ROS release assay |
| thiamine pyrophosphate | SIGMA | C8754-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | buffer component |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | buffer component |
| sucrose | SIGMA | S7903-250G | buffer component |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | buffer component |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | reagent, ROS release inhibitor |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | reagent, ROS release inhibitor |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | reagent, ROS release detection |
| horseradish peroxidase | SIGMA | P8375-1KU | reagent, ROS release detection |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | reagent, ROS release detection |
| Biotech Synergy 2 microplate reader | BioTek Instruments | microplate reader for assays | |
| Gen5 software | BioTek Instruments | software, used for collection of raw RFU | |
| Graphpad Prism | Graphpad software | software, data analysis | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft | software, data analysis |
References
- Mailloux, R. J. Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species. Redox Biol. 4, 381-398 (2015).
- Nicholls, D. G. Forty years of Mitchell's proton circuit: From little grey books to little grey cells. Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).
- Brand, M. D. Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling. Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).
- Massey, V. Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins. J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P.
- Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox - function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling. Biol Chem. , (2017).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. J Biol Chem. , (2017).
- Harper, M. E., Green, K., Brand, M. D. The efficiency of cellular energy transduction and its implications for obesity. Annu Rev Nutr. 28, 13-33 (2008).
- Ambrus, A., et al. Formation of reactive oxygen species by human and bacterial pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complexes reconstituted from recombinant components. Free Radic Biol Med. 89, 642-650 (2015).
- Tretter, L., Adam-Vizi, V. Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase. J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).
- Slade, L., et al. Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).
- O'Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex. Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).
- Quinlan, C. L., et al. The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I. J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).
- Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase. Redox Biol. 8, 285-297 (2016).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Ambrus, A., Adam-Vizi, V. Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism. Neurochem Int. , (2017).
- Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria. FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).
- Fisher-Wellman, K. H., et al. Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload. Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).
- Kussmaul, L., Hirst, J. The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).
- Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0. A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).
- Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).
