Epigenetische Mechanismen werden häufig in Gliom verändert. Chromatin Immunopräzipitation könnte verwendet werden, um die Auswirkungen der genetischen Veränderungen, die in Gliom zu studieren, die aus Änderungen in Histon Änderungen ergeben, die Chromatin Struktur und gen-Transkription regulieren. Dieses Protokoll beschreibt native Chromatin Immunopräzipitation auf murine Gehirn Tumor Neurosphären.
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Methodenartikel
Native Chromatin Immunopräzipitation mit Murine Gehirn Tumor Neurosphären
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Epigenetische Veränderungen können in der Entstehung und Progression von Gliom beteiligt sein. Veränderungen in der Methylierung und Acetylierung von Promotoren und regulatorischen Regionen der Onkogene und Tumor-Suppressoren können führen zu Veränderungen in der Genexpression und spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese von Hirntumoren. Native Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) ist eine populäre Technik, die erlaubt die Erkennung von Änderungen oder andere Proteine fest an DNA gebunden. Im Gegensatz zu vernetzten ChIP in native ChIP sind Zellen nicht mit Formaldehyd Protein kovalent an DNA Verbindung behandelt. Dies ist vorteilhaft, weil manchmal Vernetzung kann Proteine, die nur vorübergehend mit der DNA interagieren und haben keine funktionelle Bedeutung im Genregulation zu beheben. Darüber hinaus werden Antikörper gegen fixierten Peptide in der Regel ausgelöst. Daher wird Antikörperbesonderheit native ChIP erhöht. Allerdings ist es wichtig, im Auge zu behalten, die native ChIP nur anwendbar ist auf Histone oder anderen Proteinen, die eng an DNA binden zu studieren. Dieses Protokoll beschreibt die native Chromatin Immunopräzipitation auf murine Gehirn Tumor Neurosphären.
Einleitung
Epigenetische Ereignisse sind häufig in Gliome und wahrscheinlich eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Tumor. In der Tat in pädiatrischen hochwertige Gliom treten Mutationen in den Genen Codierung Histon-Varianten H3.3 und H3.1 häufig1. Die Mutationen beeinflussen Histon Änderungen und wichtige epigenetische folgen2,3. In der Jugendlichen zu Erwachsenen Spektrum auftreten, wiederkehrende Mutationen im Isocitrate Dehydrogenase Gen 1/2 (IDH1/2), eine Mutation, die α-KG abhängigen Histon und DNA-de-Methylasaes hemmt und genetische Veränderungen in den anderen Chromatin Aufsichtsbehör....
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Protokoll
Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Michigan genehmigt.
1. Generation von Hirntumor NS und Kultivierung Bedingungen.
- Neuronale Stammzellen Medium (NSC) mit Dulbeccos geändert Eagle Medium/F12B27 Ergänzung (1 X), N2-Ergänzung (1 X) und eine antimikrobielle Reagenz vorbereiten. NSC-Medium am Tag der Verwendung mit menschlichen rekombinante endothelialen Wachstumsfaktor (EGF) und Basic-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) auf eine Endkonzentration von 20 ng/mL zu ergänzen.
- Induzieren Sie die Hirntumoren bei Maus über das Dornröschen Tr....
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Ergebnisse
Eine schematische Darstellung des Tumors NS generiert aus einem Gehirntumor wo Gehirn Tumorzellen Katushka positiv sind, ist in Abbildung 1dargestellt. Abbildung 2 zeigt eine schematische Darstellung der gesamten ChIP Technik. Abbildung 3 zeigt die repräsentativen Ergebnisse von Chromatin von Gehirntumor NS verdaut mit MNase für 12 min, eine Mehrheit von Mono-, di- und Tri-Nukleosomen nachgeben. Nach.......
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Diskussion
Das Protokoll hier vorgestellten ermöglicht den Benutzer durchführen native ChIP auf NS gentechnisch Hirntumoren abgeleitet. Im Gegensatz zur Vernetzung ChIP, beschränkt sich dieses Protokoll für das Studium der Proteine, die DNA6fest zugeordnet. Die Anzahl der verwendeten Zellen kann nach Bedarf geändert werden und das Protokoll kann hochskaliert werden. Wir haben 1 X 106 Zellen pro IP, native ChIP kann jedoch auch mit weniger als 4 x 104 Zellen5durch.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch nationale Institute der Gesundheit/National Institute of Neurological Disorders, R21-NS091555, M.G.C. & Schlaganfall (NIH/NINDS) Zuschüsse R37-NS094804, R01-NS074387 unterstützt; NIH/NINDS gewährt R01-NS076991 R01-NS082311 und R01-NS096756 P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; der Abteilung für Neurochirurgie; Leahs Happy Hearts und Tschad obwohl Stiftung, M.G.C. und P.R.L. RNA Biomedizin Grant F046166, M.G.C. F.M.M. wird unterstützt durch eine F31 NIH/NINDS-F31NS103500. R.I.Z.-V. wird unterstützt durch das NIH / NIGMS grant 5T34GM007821-37.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Agilent 2100 Bioanalysator | Agilent | G2946-90004 | Bioanalysator |
| AccuSpin Micro 17R, gekühlt | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 Maus |
| Calciumchlorid | Aldrich | 22350-6 | Pufferreagenz |
| D-Luciferin, Kaliumsalz | Goldbio | LuckK-1g | |
| DiaMag1.5 magnetisches Gestell | Diagenode | B04000003 | für magnetische Bead-Waschungen |
| DiaMag Rotator EU | Diagenode | B05000001 | |
| Rotator DMEM/F-12 | Gibco | 11330-057 | NSC-Komponente |
| Dynabeads Protein A | Thermo Fisher Scientific | 10001D | Protein A magnetische Kügelchen |
| Dynabeads Protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | Protein G magnetische Kügelchen |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | bereiten 20 μm vor g/mL-Bestand in 0,1% BSA und aliquot. |
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) | Sigma | E-4884 | Pufferreagenz |
| Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure) (EGTA) | Sigma | E-4378 | Pufferreagenz |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | qPCR-Reagenz |
| Fötales Rinderserum | Gibco | 10437028 | zum Einfrieren von Zellen |
| FGF | PeproTech | 100-18b | Vorbereiten 20 μm; g/mL-Bestand in 0,1% BSA und aliquot. |
| Pinzette | Fine Science Tools | 11008-13 | für die Dissektion von Tumoren |
| Glycerin, MB Grade | EMD- Millipore | 356352 | |
| H3K4me3 | Abcam | Ab8580 | |
| H3K27me3 | Millipore | 07-449 | |
| HBSS | Gibco | 14175-103 | ausgewogene Salzlösung |
| Fluriso | VETone | 501017 | Anästhetikum für Inhalation |
| Ivis Spectrum | Perkin-Elmer | 124262 | optisches In-vivo-Bildgebungssystem |
| Hyqtase | HyClon | SV3003001 | Zellablösungsmedium |
| Lithiumchlorid | Sigma | L8895 | Pufferreagenz |
| Mikroröhrchen mit geringer Bindung | Corning Costar | CLS3207 | Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung |
| Mikrozentrifugenröhrchen | Fisher | 21-402-903 | reguläres Mikrozentrifugenröhrchen |
| Micrococcal Nuclease | Thermo Fisher Scientific, Affymetrix | 70196Y | jede Charge kann abweichen; kaufen Sie eine ausreichende Menge für Experimente und aliquot. |
| N2 | Gibco | 17502-048 | NSC-Komponente |
| Normales Kaninchen-IgG | Millipore | 12-372 | |
| Normocin | Invivogen | NOL-36-063 | antimikrobielles Mittel, bei 0,1 mg/ml verwenden. |
| NP-40 (Igepal CA-630) | Sigma | 18896-50ML | Pufferreagenz |
| Kimble Kontes Pellet Stößel | Fisher Scientific | K749515-0000 | |
| Proteaseinhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | aliquot und bei -20 °C lagern. |
| Protinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | stellt 10 mg/ml Bestand in Wasser her; aliquotiert und lagert bei -20 μC. |
| QIAquick PCR-Aufreinigungskit | Qiagen | 28104 | DNA-Aufreinigungskit |
| Skalpell | Fine Science Tools | 10007-16 | für die Dissektion von Tumoren |
| Natriumchlorid | VWR | 0241-5KG | Pufferreagenz |
| Natriumdesoxycholat | Sigma-Aldrich | D670-25G | Pufferreagenz |
| Natriumdodecylsulfat (SDS) | Sigma | L-4390 | Pufferreagenz |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | Bp152-1 | Pufferreagenz |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP 151-500 | Polyethylenglykol octylphenylether |
| Standard Mini-Zentrifuge | Fisherbrand | 12-006-901 | Standard Mini-Zentrifuge |
| SZX16 Mikroskop | Olympus | SZX16 | fluoreszierendes Präpariermikroskop |
| ViiA 7 Real-Time-PCR-System mit schnellen 96-Well-Block-Biosystemen | 4453535 | ||
| Nanodrop One | Thermo-Fisher Scientific | ND-ONEC-W |
Referenzen
- Schwartzentruber, J., et al. Driver mutations in histone H3.3 and chromatin remodelling genes in paediatric glioblastoma. Nature. 482 (7384), 226-231 (2012).
- Bjerke, L., et al. Histone H3.3. mutations drive pediatric glioblastoma th....
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Nachdrucke und Genehmigungen
