Methodenartikel

Einzellige Ladungszustand im lebendigen intakten Zebrafisch

DOI:

10.3791/57024

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19. März 2018

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1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Center for Stem Cells and Regenerative Medicine, University of Notre Dame

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll um zu zeigen, wie die Zelle Ladungszustand durch UV-Einwirkung auf bestimmte Bereiche, die mit dem Ausdruck des fluoreszierenden Proteins, Eos, in lebenden Tieren erreicht wird.

Zusammenfassung

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Tierischen und pflanzlichen Gewebe besteht aus unterschiedlichen Populationen von Zellen. Diese Zellen interagieren im Laufe der Zeit zum Aufbau und Erhalt des Gewebes und können verursachen Krankheit wenn gestört. Wissenschaftler haben clevere Techniken um Eigenschaften und natürliche Dynamik dieser Zellen innerhalb von intaktem Gewebe zu untersuchen, zum Ausdruck bringen, fluoreszierende Proteine in Teilmengen von Zellen entwickelt. Jedoch erfordern manchmal Experimente mehr ausgewählten Visualisierung von Zellen im Gewebe, manchmal auf die einzelne Zelle oder Bevölkerung der Zellen Art und Weise. Um dies zu erreichen und Einzelzellen innerhalb einer Bevölkerung der Zellen zu visualisieren, haben Wissenschaftler einzellige Ladungszustand der fluoreszierende Proteine genutzt. Um diese Technik zu demonstrieren, zeigen wir hier wie UV-Licht auf eine Eos exprimierenden Zelle des Interesses an einem intakten, direkte Leben Zebrafisch. Wir Bild dann diese Photoconverted Eos+ Zellen 24 h später um festzustellen, wie sie im Gewebe verändert. Wir beschreiben zwei Techniken: einzelne Zelle Ladungszustand und Photoconversions der Bevölkerung der Zelle. Diese Techniken können verwendet werden, zu visualisieren, Zell-Zell-Interaktionen, Zelle-Schicksal und Differenzierung und Zelle Migrationen, so dass es eine Technik, die in zahlreichen biologischen Fragestellungen anwendbar ist.

Einleitung

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Mehrere unterschiedliche Zellen interagieren, um aufzubauen und zu pflegen komplexe tierischen und pflanzlichen Geweben. Diese Zellen sind oft eingefügten und schwer zu unterscheiden von Nachbarn auf eine einzelne Zellenebene ohne Hochauflösende Mikroskopie, die Fixierung des Gewebes erfordern. Zu verstehen, wie diese Gewebe bilden, sind gepflegt und werden krank, es war jedoch wichtig, zu untersuchen, wie einzelne Zellen im Gewebe sind im Laufe der Zeit interagieren. Idealerweise benötigen diese Experimente die Kennzeichnung einzelner Zellen innerhalb eines Gewebes in einer nicht-invasive Weise ohne das Erfordernis einer Fixierung. Wissenschaftler haben jetzt zahlrei....

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Protokoll

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Alle Tierversuche wurden von der University of Notre Dame institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt.

1. Vorbereitung der Zebrafisch-Probe

  1. Legen Sie einen erwachsenen Mann und einem Erwachsenen weiblichen Tg (Cabrio Protein) in einer Paarung Kammer pro Standardverfahren13. Verwenden Sie in diesem Manuskript Tg(sox10:eos) Fisch9 wegen Zugang aber andere transgenen Linien mit Photoconvertible Protein gleichermaßen genutzt werden kann. Richten Sie mehr als eine Kammer für den Fall, dass Fische nicht verlegen zu tun. Lassen Sie die Fische über Nacht in der Kammer verbleiben.....

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Ergebnisse

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Ladungszustand der fluoreszierenden Proteinen kann verwendet werden, um verschiedene Zellen in einem Gewebe6beschriften. Um dies zu demonstrieren, wurden Tg(sox10:eos) Fisch9 verwendet, um das Photoconvertible Protein Eos unter die regulatorischen Sequenzen des sox10. Die Tg(sox10:eos) Tiere bei 48 hpf waren zunächst montiert, und dann ein Image erstellt um eine unspezifische Ladungszustand erkennen, die möglicherw.......

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Diskussion

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In komplexen Gewebe organisieren verschiedene Zelltypen in bestimmten Domänen. Vor kurzem wurden Techniken zur Bezeichnung einzelner Zellen innerhalb dieser großen Gewebe Strukturen1,2,3genutzt. Hier zeigen wir zwei Techniken, die in ähnlicher Weise genutzt werden können, um einzelne Zelle Interaktionen und Zelle Bevölkerung Wechselwirkungen in komplexen Gewebe sichtbar zu machen. Der Vorteil der Ladungszustand Technik ist die r.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Wir danken Bernard Kulemaka und Mitglieder des Smith-Lab für ihre hilfreichen Kommentare und Reagenz Beratung, Sam Connell und Brent Redford von 3i für fielding Bildgebung Fragen und Deborah Bang, Karen Heed und Kay Stewart für Zebrafisch Pflege. Diese Arbeit wurde von der University of Notre Dame, die Elisabeth und Michael Gallagher Family, Alfred P. Sloan Foundation, Zentrum für Zebrafisch-Forschung an der University of Notre und Zentrum von Stammzellen und Regenerationsmedizin an der University of Notre unterstützt. Dame. Alle tierexperimentellen Studien erfolgten in Übereinstimmung mit der University of Notre Dame IACUC Dr. Cody Smith.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Tg(sox10:eos) Zebrafisch-TiereFische wurden aus der Fischanlage der University of Notre Dame entnommen und gekreuzt
100 x 15 mm PetrischaleVWR25384-302
Embryo-MediumDas Embryomedium wird wöchentlich hergestellt und von der Fischanlage an der University of Notre Dame zur Verfügung gestellt, das 5 l RO-Wasser, 30 μl Methylenblau und 200 ml Salzfond enthält.
0,8 % niedriger Schmelzpunkt Agarosedot scientific inc9012-36-6
35 x 10 mm Glasdeckglas Boden PetrischaleTed Pella Inc.14021-20
Nadel-Präpariersonde
0,002% 3-Aminobenzoesäureester (Tricain)Fluka analyticalA5040-250G
Fluoreszierendes Präpariermikroskop mit GFP-FilternZeiss Axiozoom
Konfokales Mikroskop mit Lasern zur Anregung von GFP und RFP Filtersets3i Spinning-Disk konfokal
UV-Lichtquelle (Laser) für die Photokonversion405 nm Laser
Diabuch-Software3i
MethylenblauKordon

Referenzen

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  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  2. Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent prot....

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Schlagwörter

Photokonvertierbares ProteinKonfokalmikroskopieUV LichtexpositionZebrafischembryonenEos ProteinZellschicksalsverfolgungZellmigrationsanalyseZeitrafferbildgebungFluoreszenzprotein

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