Dieses Papier soll eine schrittweise Anleitung zu sammeln verschiedene weißen Fettgewebe von Mäusen, die Fett Proben zu verarbeiten und RNA extrahieren zu präsentieren.
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Methodenartikel
Maus Fettgewebe Erhebung und Verarbeitung für die RNA-Analyse
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Im Vergleich zu anderen Geweben, hat weißen Fettgewebe einen deutlich weniger RNA und Protein Inhalt für downstream-Anwendungen wie Real-Time PCR und Western-Blot, da es meist Lipide enthält. RNA Isolation aus Fettgewebe Proben ist auch herausfordernd, da zusätzliche Schritte erforderlich sind, um diese Lipide zu vermeiden. Hier präsentieren wir Ihnen ein Verfahren um drei anatomisch unterschiedlichen weißen Fettgewebe von Mäusen, verarbeiten diese Proben und durchführen von RNA Isolierung zu sammeln. Wir beschreiben weiter die Synthese der cDNA und gen-Ausdruck-Experimente mittels Real-Time PCR. Das hiermit beschriebene Protokoll ermöglicht die Reduzierung der Kontamination von Haar und Blut auf Fettpolster sowie Cross-Kontamination zwischen verschiedenen Fettpolster bei der Entnahme von Gewebe des Tieres. Es wurde auch optimiert, um angemessene Quantität und Qualität der extrahierten RNA zu gewährleisten. Dieses Protokoll kann weit angewendet werden, um jede Maus-Modell wo Fettgewebe Proben für routinemäßige Experimente wie Real-Time PCR erforderlich sind, aber ist nicht zur Isolation von primären Adipozyten Zellkultur.
Einleitung
Adipositas ist eine weltweite Epidemie Komplikationen wie Typ 2 Diabetes1führen kann. Diät-induzierten fettleibig und gentechnisch veränderten Tiermodelle sind häufig in Übergewicht und die damit verbundenen Komplikationen für die Forschung verwendet. Traditionell weißen Fettgewebe ist bekannt als ein Ablagefach für überschüssige Energie und besteht hauptsächlich aus Lipiden während braunes Fettgewebe Energie in Wärme2,3 wandelt. Fettgewebe ist dynamisch erweitern und verkleinern abhängig von vielen Faktoren wie Ernährung und körperliche Aktivität. Um Faktoren auf diese Veränderungen zu....
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Protokoll
Pflege der Mäuse in den Prozeduren verwendet erfüllt Normen für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren von Canadian Council für den Schutz von Tieren festgelegt. Alle Verfahren wurden von der Universität Animal Care und Einsatz-Ausschuss am Forschungszentrum für CHUM genehmigt.
(1) Sektions- und Fettgewebe Sammlung von männlichen Mäusen
- Versuchsgruppen nach Studienziele zu machen. In dieser Studie wurden Proben von zwei Gruppen von männlichen Mäusen auf einem Hintergrund C57Bl/6 (n = 12-14/Gruppe). Stellen Sie sicher, dass Mäuse, die hier verwendeten 12-15 Wochen alt sind und werden auf 12 h hell/dunkel-Zyklus mit Zugang zu ....
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Ergebnisse
Nach der Autopsie Prozedur wurden drei weißen Fettgewebe gesammelt und aus den zwei Gruppen von Mäusen (N und HF Diät gefüttert Mäuse) gewichtet. Wie erwartet, stieg Mäuse auf der HF-Diät endgültige Körpergewicht und Gewichtszunahme im Vergleich zu Wurfgeschwistern N Diät (Tabelle 1). Diese Beobachtungen wurden begleitet von mehr als eine 2-fache Erhöhung des Gewichts der SCF, PGF und PRF bei fettleibigen Mäusen im Vergleich zu den N-Diät.
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Diskussion
Fettleibige Mäusen ergab folgenden HF-Diät ernähren, Körper und weißen Fettgewebe Gewichte im Vergleich zu Mäusen eine N-Diät gefüttert zugenommen haben. RNA mit Phenol Lösung ergab Proben mit guter Reinheit extrahiert. Leptin ist ein Adipokine produziert in erster Linie von Fettgewebe und positiv korrelieren mit fat mass16bekannt. Wie erwartet erhöht Leptin mRNA Ausdruck bei fettleibigen Mäusen in Tateinheit mit ihrer Fettmasse.
Diese Methode hat mehrere wichtige Schri.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von Diabetes Kanada unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1 mL Seringes | |||
| 1X TE Lösung (10 mM Tris-HCl und 1 mM EDTA• Na2. pH 8,0) | |||
| 22 G Nadeln | |||
| 26 G Nadeln | |||
| 75% Ethanol | |||
| Blockheizung (Trockenbad) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermowissenschaftliches | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 μμ; l) | Thermowissenschaftliche | Norm EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR Green Master (Rox) Fluoreszenzfarbstoff | Roche | 4913914001 | |
| Gefilterte Spitzen | |||
| Pinzetten | Instrumentarium | HB275 | |
| Mullhammer | |||
| Diät für fettreiche Nagetiere | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin-Forward-PCR-Primer (5'-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3') 10 μM | |||
| Leptin-Reverse-PCR-Primer (5'-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3') 10 μM | |||
| Flüssigstickstoff | |||
| Maxima Reverse Transkriptase (Enzym und 5x Puffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanoreines Wasser (als Reinstwasser bezeichnet) | |||
| Nitril-Untersuchungshandschuhe | |||
| Nitril-Handschuhe | |||
| Normale Nagetierdiät | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 Pipettierer | |||
| P2 Pipettierer | |||
| P20 Pipettierer | |||
| P200 Pipettierer | |||
| Phenollösung (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Voridentifizierte Aluminiumfolie | |||
| Quarz-Spektralphotometer Küvettengestell | |||
| für PCR-Röhrchenstreifen | |||
| Gestelle für RT-PCR-Röhrchenstreifen | |||
| Zufällige Hexamere | Invitrogen | 58875 | |
| Echtzeit-PCR-Rotor-Gensystem | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene Thermocycler | |
| Gekühlte Tischzentrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNasefreie 1,5 mL Eppendorf Röhrchen | |||
| RNasefreie 1,5 mL Röhrchen | |||
| RNasefreie PCR Röhrchenstreifen (0,2 mL) und Kappen | |||
| RNasefreies Wasser | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR-Gerät | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR-Röhrchenstreifen (0,1 mL) und Kappen | |||
| S16 Forward PCR Primer (5'-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3') 10 μM | |||
| S16 Reverse PCR Primer (5' ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3') 10 uM | |||
| Spektralphotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Mörser und Stößel | |||
| Chirurgische Pads | Hausgemachte eine Schaumstoffplatte, die in eine saugfähige Einwegunterlage | ||
| Chirurgische Schere | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermocycler | |||
| Thermocycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex-Mischer | |||
| Wiegespatel |
Referenzen
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis. BMC. Public Health. 9, 88(2009).
- Wronska, A., Kmiec, Z. Structural and biochemic....
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Nachdrucke und Genehmigungen
