Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für die Verwendung von STED-Mikroskopie, gleichzeitig Aktin Bildstrukturen, Mikrotubuli und Mikrotubuli-Plus-Ende-bindende Proteine in B-Zellen, die auf Deckgläsern beschichtet mit Antikörpern gegen den B-Zell-Rezeptor, ein Modell für die Anfangsphase verbreitet haben der immun Synapse Formation.
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Methodenartikel
Visualisierung der Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons an der B-Zelle immun Synapse mit stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
B-Zellen, die an Membran-gebundene Antigene (z.B.auf der Oberfläche einer Antigen-präsentierenden Zelle) binden bilden eine immun Synapse, eine spezielle Zellstruktur, die B-Zell Rezeptor (BCR) Signalisierung optimiert und BCR-vermittelten Antigen Erwerb. Der Umbau des Aktin-Zytoskeletts und die Neuausrichtung des Mikrotubuli-Netzwerkes gegenüber der Antigen-Kontakt-Seite sind für immun Synapse Bildung unerlässlich. Umbau des Aktin-Zytoskeletts in einem dichten peripheren Ring des F-Aktin wird begleitet von Polarisation des Mikrotubuli-organizing Centers gegenüber immun Synapse. Mikrotubuli-Plus-Ende-bindende Proteine, sowie kortikalen Plus-End Capture Proteine vermitteln physikalische Wechselwirkungen zwischen den Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons, die ihnen ermöglichen, in koordinierter Weise reorganisiert werden. Aufklärung der Mechanismen, Kontrolle, die das Zellskelett Reorganisation sowie verstehen wie diese Zellskelett Strukturen immun Synapse Bildung und BCR-Signalisierung, gestalten bieten neue Einblicke in die B-Zell-Aktivierung. Dies hat durch die Entwicklung von Super-Auflösung Mikroskopie Ansätzen unterstützt worden, die neue des Zytoskeletts Netzwerkorganisation Details. Wir beschreiben hier eine Methode für die Verwendung von stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie gleichzeitig Aktin Bildstrukturen, Mikrotubuli und transfizierten GFP-Tags Mikrotubuli-Plus-Ende-bindende Proteine in B-Zellen. Um die frühen Ereignisse immun Synapse Bildung zu modellieren, ermöglichen wir den B-Zellen zu verbreiten auf Deckgläsern beschichtet mit Anti-Immunglobulinen (Anti-Ig) Antikörper, die BCR-Signalisierung und cytoskelett Umbau zu initiieren. Wir bieten detaillierte Protokolle für den Ausdruck von GFP Fusionsproteine in A20 B-Lymphom-Zellen, für die Verbreitung von Anti-Ig-induzierte Zelle und für nachfolgende Zelle Fixierung, Immunostaining, Bildaufnahme und Bild Dekonvolution Schritte. Die hochauflösenden Bilder mithilfe dieser Verfahren erlauben es, gleichzeitig visualisieren Aktin Strukturen, Mikrotubuli und die Mikrotubuli Plus-Ende bindende Proteine, die diese beiden Zellskelett Netzwerke verbinden können.
Einleitung
Wenn B-Zellen zu binden polarisierten Arrays von Antigenen (z.B., angezeigt auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs)), der daraus resultierenden B-Zell Rezeptor (BCR) Signalisierung Laufwerke die Entstehung einer klassischen immun Synapse Struktur, die erstmals in beschrieben T Zellen1,2,3,4,5,6,7,8,9,10
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Protokoll
Alle tierische Verfahren wurden von der University of British Columbia Animal Care Committee genehmigt.
(1) mit dem Ausdruck GFP-Fusionsproteinen in A20 B-Lymphom-Zellen
- A20 Zellkulturen in komplette RPMI Medium (RPMI-1640 mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS), 50 µM 2-Mercaptoethanol, 2 mM Glutamin, 1 mM Pyruvat, 50 U/mL Penicillin und 50 µg/mL Streptomycin ergänzt) bei 37 ° C in einer Gewebekultur Inkubator mit 5 % CO2.
- Vorbereiten des Transfection Reagens (siehe die Tabelle der Materialien) entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
Hinweis: Dieses Protokoll wurde fü....
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Ergebnisse
Für B-Zellen auf immobilisierte Anti-Ig zu verbreiten bietet STED-Mikroskopie, die in Verbindung mit Dekonvolution Software verwendet Bilder mit höherer Auflösung des Zytoskeletts Strukturen als konfokalen Mikroskopie. Dies zeigt sich in Abbildung 1, wo F-Aktin-Netzwerk mit dem oben beschriebenen Protokoll visualisiert wurde. Ein Vergleich der konfokalen und STED Höchstauflösung Bilder von der gleichen Probe zeigt, dass die STED-Bilder einer höheren Auflösung.......
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Diskussion
Detaillierte Bilder des Zytoskeletts Strukturen erhalten Sie mit STED Höchstauflösung Mikroskopie, die theoretisch eine Auflösung von 50 erreichen nm, im Vergleich zu konventionellen konfokalen Mikroskopie, wofür die Beugung begrenzte Auflösung ~ 200 beträgt nm 24. die Möglichkeit, feinere Strukturen aufzulösen mithilfe Dekonvolution Software zur Berechnung der wahrscheinlichsten Position der ursprüngliche Lichtquelle aus dem beobachteten "verschwommen" Fluoreszenzsignal verstärkt wird. Dieses Pro.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir bedanken uns bei den UBC Life Sciences Institute (LSI) Imaging Facility für Betreuung und Pflege der STED-Mikroskop. Diese Arbeit wurde durch #68865 von Canadian Institutes of Health Research (zu M.R.G) finanziert. Wir danken Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya University, Nagoya, Japan) für die CLIP-170-GFP-Plasmid.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Zellkultur | |||
| A20 Maus-B-Lymphomzellen | ATCC | TIB-208 | Maus-B-Zell-Lymphom Balb/c-Herkunft, das auf seiner Oberfläche ein IgG-haltiges BCR exprimiert |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scient | R0883 | |
| Fötales Rinderserum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | Hitzeinaktivierung bei 56 oC für 30 min |
| 2-Mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148 | |
| Glutamin | Millipore Sigma | G5763 | |
| Natriumpyruvat | Millipore Sigma | P5280 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid, 10.000 Stück |
| Zusatzmaterialien für primäre B-Zellen | |||
| 70-&Mikro; m-Zell-Sieb | Corning | 352350 | |
| B-Zell-Isolationskit auf Magnetbead-Basis | Stammzelltechnologien | 19854 | EasySep B-Zell-Isolationskit für Mäuse |
| Lipopolysaccharid (LPS) | Millipore Sigma | L4391 | LPS aus E. coli 0111:B4 |
| B-Zell-aktivierender Faktor (BAFF) | R& D Systems | 2106-BF-010 | |
| Name | Company | Katalognummer | Kommentare |
| Transfection | |||
| Plasmid-Kodierung CLIP-170-GFP | Geschenk von Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); beschrieben in Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002 | ||
| Empfohlene Transfektionsreagenzien und Ausrüstung Amaxa | |||
| Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers zum Mischen der Transfektionsreagenzien mit dem DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Programm L-013 verwendet |
| Falcon 6-Well-Platten, TC-behandelt, steril | Corning | 353046 | |
| Name | Company< | strong>Katalognummer | > |
| Beschichtung Deckgläser | |||
| 18 mm Durchmesser runde #1,5 Deckgläser | Thomas Scientific | 1217N81 | Ähnliches Produkt: Marienfield-Superior Katalog #117580 |
| Pinzette | Fisher Scientific | 1381242 | Dissetieren extra feine Splitterzange |
| Falcon 12-well sterile Gewebe-Polystyrol-Gewebekulturplatte | Corning | 353043 | |
| 100% | Methanol Fisher Scientific | A412-4 | |
| Sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne Kalzium oder Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörper | Jackson ImmunoResearch | 115-005-008 | Für A20-Zellen |
| Ziegen-Anti-Maus-IgM-Antikörper | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | Für primäre Maus-B-Zellen |
| Name | >> | Katalognummer | Kommentare |
| Färbung | |||
| Paraformaldehyd (16%ige Stammlösung) | Elektronenmikroskopie Sciences | 15710 | PBS auf die Arbeitskonzentration verdünnen |
| Glutaraldehyd (50%ige Stammlösung) | Millipore Sigma | 340855 | Mit PBS auf die Arbeitskonzentration verdünnen |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Saponin | Millipore Sigma | S2149 | |
| Rinderserumalbumin (BSA), Fraktion V | Millipore Sigma | 10735094001 | |
| Kaninchen Anti-Tubulin Antikörper | Abcam | ab52866 | :250 Verdünnung empfohlen, sollte aber optimiert werden |
| Alexa Fluor 532-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen IgG | Thermo Fisher Scientific | A11009 | Verdünnung im Verhältnis 1:100 empfohlen, sollte aber optimiert werden |
| Alexa Fluor 568-konjugiertes Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12380 | Verdünnung im Verhältnis 1:100 empfohlen, sollte aber optimiert werden |
| Prolong Diamond Antifade Eindeckmittel | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Ohne DAPI |
| Fisherbrand Superfrost Plus Objektträger | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Name | Firma | Katalognummer | Kommentare |
| Materials | |||
| Parafilm | VWR | P1150-2 | |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358 | |
| KCl | Millipore Sigma | P9333 | |
| CaCl2 | Millipore Sigma | C1016 | |
| Na2HPO4 | Fisher | Scientific S374-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63 | |
| Dextrose | Fisher | Scientific D16-500 | |
| Name | <>Unternehmen | <>Katalognummer | Kommentare |
| <>Mikroskopie | |||
| Leica SP8 TCS STED Mikroskop | Leica | ||
| Huygens Dekonvolutionssoftware | Scientific Voume Imaging | Siehe https://svi.nl/HuygensProducts |
Referenzen
- Harwood, N. E., Batista, F. D. The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360(2011).
- Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
