Visualisierung der Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons an der B-Zelle immun Synapse mit stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie

Wenn B-Zellen zu binden polarisierten Arrays von Antigenen (z.B., angezeigt auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs)), der daraus resultierenden B-Zell Rezeptor (BCR) Signalisierung Laufwerke die Entstehung einer klassischen immun Synapse Struktur, die erstmals in beschrieben T Zellen^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13}. Zunächst Mikrokügelchen Antigen gebunden BCR Form an der Peripherie der B-Zelle: APC-Kontakt-Seite. Diese Mikrokügelchen bewegen sich dann in Richtung der Mitte der Antigen-Kontakt-Seite, wo sie verschmelzen zu einem zentralen supramolekularen Aktivierung-Cluster (cSMAC), die den Kern der immun Synapse bildet. Immun Synapse Bildung optimiert BCR Signalisierung und erleichtert die BCR-vermittelten Antigen-Extraktion aus der APC-Membran-¹⁴. Diese Antigen-Akquisition, die BCR-vermittelten Antigen Internalisierung und anschließende Antigen Verarbeitung folgt, kann B-Zellen zu präsentieren Peptid: MHC-II-komplexe, T-Zellen und T-Zell-Hilfe-¹⁴zu entlocken. Da immun Synapse Bildung fördert B-Zell-Aktivierung, Aufklärung der Mechanismen, die festlegen, dass diese funktionalen Muster der Rezeptor Organisation neu bieten kann sind Einblicke wie Humorale Immunantwort eingeleitet und geregelt.

Reorganisation der Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons ist essentiell für immun Synapse Bildung. Lokalisierte BCR Signalisierung angeregt durch eine räumlich-polarisierten Arrays von Antigenen induziert rasche und drastische Umgestaltung der Aktin-Zytoskelett^1,15. Die Bildung von dendritischen Aktin-Strukturen an der Peripherie der B-Zellen übt Druck Kräfte auf die Plasmamembran und fördert die Verbreitung von B-Zellen. Dies ermöglicht die B Zelle, einen größeren Bereich des Antigen-Auflagefläche zu scannen, und erhöht die Anzahl der BCR, die Antigen binden und BCR Signalwege aktivieren. Zur gleichen Zeit sind die MTOC und Mikrotubuli-Netzwerk neu ausgerichtet auf dem Gelände der Antigen-Kontakt. Während die MTOC der Antigen-Kontakt-Seite nähert, verlängern Mikrotubuli, die aus der MTOC entlang der Innenseite der Plasmamembran an der Schnittstelle zwischen der B-Zelle und Antigen tragenden Fläche^16,17. Diese Juxtamembrane Mikrotubuli können dann als Titel für die dynien-vermittelten zentripetalen Bewegung der Antigen-gebundenen BCR Mikrokügelchen¹⁸, was zur Bildung einer cSMAC handeln.

Die Neuausrichtung und die Polarisation des MTOC gegenüber immun Synapse erfordert intakte Actin und Mikrotubuli Cytoskeletons und hängt oft von Wechselwirkungen zwischen der kortikalen Aktin Netzwerk und Mikrotubuli^{16,17, 19,20}. Kortikale Actin-bindende Proteine, wie IQGAP1, können Mikrotubuli erfassen, durch die Interaktion mit Proteinkomplexe, die Mikrotubuli Plus-enden²¹schmücken. Diese dynamische komplexe Plus-Ende-bindende Proteine gehören EB1 und CLIP-170, die gemeinsam als Mikrotubuli Plus-tracking-Proteine (+ Tipps)^21,22End bezeichnet werden. + Spitzen an den Enden der Mikrotubuli können Proteine binden, die die Plasmamembran oder der kortikalen Aktin-cytoskelett zugeordnet sind. Dies ermöglicht Kraft erzeugenden Mechanismen (z.B.Minus-Ende gerichtet Bewegung des cortically verankert dynien entlang der Mikrotubuli) Zugkräfte auf Mikrotubuli ausüben, und positionieren dabei die MTOC. CLIP-170 kann binden an das Protein Aktin-assoziierten Gerüst IQGAP1²³, und wir haben gezeigt, dass beide dieser Proteine für MTOC BCR-Induzierte Polarisation in Richtung immun Synapse¹⁷erforderlich sind. Diese IQGAP1-CLIP-170-Interaktion kann eine wichtige Rolle bei der Koordinierung der Umbau des Aktin-Zytoskeletts mit der Neupositionierung des Mikrotubuli-Netzwerks an der B-Zelle immun Synapse spielen.

Konventionelle Fluoreszenzmikroskopie hat die dramatische Reorganisation von Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons während B-Cell immun Synapse Bildung²ergeben. Dieser Ansatz kann nicht jedoch kleine zelluläre Strukturen im Detail durch die Beugungsgrenze des Lichts, aufgelöst, die nach dem Abbeschen Gesetz abhängig von der Wellenlänge des Lichts verwendet ist, um die Probe und die Blende der Objektive²⁴beleuchten. Diese Beugungsgrenze schränkt die Auflösung der konventionellen Lichtmikroskopen, 200-300 nm in seitlicher Richtung und 500-700 nm in axialer Richtung²⁵. Daher kleinere subzellulären Strukturen, sowie die feinen Details der Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons konnten nur beobachtet werden mit Elektronenmikroskopie. Elektronenmikroskopie-Bildgebung des Zytoskeletts ist zeitaufwendig, erfordert harte Probe Fixierung und Vorbereitung Protokolle, die biologische Strukturen zu verändern, und beschränkt sich auf Antikörper-vermittelten Erkennung. Die Fähigkeit, Immunostain und gleichzeitig Bild mehrere Proteine oder zelluläre Strukturen stellt einen wesentlichen Vorteil der Fluoreszenz-Mikroskopie. Darüber hinaus mit dem Ausdruck fluoreszierende Schmelzverfahren Proteine in den Zellen ermöglicht Echtzeit-Bildgebung und ist nützlich, wenn wirksame Antikörper für Immunostaining Protein des Interesses nicht verfügbar sind.

Jüngsten technologischen Fortschritte in der Super-Auflösung Mikroskopie überwinden Sie die Grenzen der Beugung des Lichts und erlaubt die Visualisierung von nanoskaligen Zellstrukturen²⁴. Eine solche super-Resolution-Mikroskopie-Technik heißt stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie. STED beschäftigt zwei Lasern, wo ein Laser regt das Fluorophor und ein zweiten Lasers mit einem Donut-förmigen Muster gezielt unterdrückt die Fluoreszenz-Emission um das Fluorophor. Dies reduziert die Point-Spread Funktion (scheinbare Bereich) ein einzelnes fluoreszierende Partikel und bietet ein Sub Beugung Begrenzung fluoreszierende Bild^25,26. Grundzustand Erschöpfung Mikroskopie beschäftigt auch Fluoreszenz-basierte Techniken zu Super-Auflösung erwerben. Aber die Bild-Erwerb und Wiederaufbau-Zeiten sind längst gibt es nur eine begrenzte Anzahl von Fluorophore, die verwendet werden können und die gleichzeitige hochauflösende Bildgebung des Zytoskeletts mehrere Komponenten ist technisch anspruchsvoll, da die Verwaltung Aktin und Mikrotubuli Strukturen erfordert unterschiedliche Fixierung Verfahren. Daher STED hat mehrere Vorteile gegenüber der Elektronenmikroskopie und anderen Super-Auflösung Mikroskopie nähert sich, dass es schnelle Bildakquisition bietet, minimale Nachbearbeitung Anforderungen hat und setzt die gleichen Fluorophore und Färbetechniken für konventionelle Fluoreszenzmikroskopie von örtlich festgelegten Proben²⁶genutzt werden.

Super-Auflösung Mikroskopie wurde jetzt verwendet, um Aktin-Strukturen an der immun Synapse in natürlichen killer (NK)-Zellen und T Zellen^{26,27,28,29,30,} visualisieren ³¹. jedoch Höchstauflösung Bildgebung des Mikrotubuli-Zytoskeletts sowie die koordinierte Reorganisation von Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons bei immun Synapse Bildung, wurde erst vor kurzem berichteten¹⁷. B-Bildzellen, die verteilt auf Deckgläsern beschichtet mit Anti-Immunglobulinen (Anti-Ig) Antikörper, die stimulieren, BCR Signalisierung und initiieren Zytoskelett Reorganisation durfte früher STED-Mikroskopie. Wenn auf immobilisierten Antikörper Anti-Ig verchromt, durchlaufen B-Zellen dramatische Aktin-abhängige verbreiten, die rekapituliert die ursprünglichen Ereignisse während immun Synapse Bildung. Wichtig ist, offenbart STED-Mikroskopie die feinen Details der dendritischen Ring der F-Aktin, die Formen an der Peripherie des Immunsystems synapse und zeigte, dass die MTOC sowie die Mikrotubuli befestigt ist, in der Nähe der Antigen-Kontakt-Seite¹⁷bewegt hatte. Diese Mikrotubuli verlängert nach außen in Richtung der Peripherie Ring des F-Aktin. Multi-Color STED Bildgebung verschiedener Kombinationen von F-Actin, Tubulin, IQGAP1, und GFP-markierten CLIP-170 + Tipps Ferner ergab, dass Mikrotubuli Plus-enden gekennzeichnet durch CLIP-170-GFP eng verbunden mit der peripheren Aktin-Geflecht und IQGAP1, waren ein kortikale Erfassung Protein¹⁷.

Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für imaging-Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons an der immun Synapse mit STED-Mikroskopie. Diese Methoden wurden optimiert mit der A20 murinen B-Zell-Linie, die am meisten beschäftigt war, für das Studium BCR Signal- und immun Synapse Bildung^{17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39}. weil kommerzielle Antikörper auf CLIP-170 gut für Immunostaining in früheren Experimenten nicht funktioniert, beschreiben wir ausführlich die Expression von GFP-markierten CLIP-170 in A20 Zellen zusammen mit Färbung Protokolle zur Visualisierung von gleichzeitig bis zu drei Zellskelett Komponenten oder Zytoskelett-assoziierte Proteine. Methoden für die Verwendung von STED-Mikroskopie, Bild Aktin an NK Zelle immun Synapsen wurden⁴⁰beschrieben. Hier reichen wir dies Höchstauflösung multi-Color-Bilder von der Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons in B-Zellen zu erwerben.

Eine kritische Betrachtung für die Höchstauflösung Mikroskopie nutzt die entsprechende Fixierung-Verfahren für die Aufrechterhaltung der Zellstrukturen und vermeiden von Schäden an fluoreszierenden Proteinen. Die Fixierung und Färbung hierin vorgestellten Methoden wurden optimiert, um GFP Fluoreszenz zu behalten und bieten hochauflösende Bildgebung der Aktin und Mikrotubuli. Wenn fluoreszierende Proteine zum Ausdruck zu bringen, sollte angemerkt werden, dass B-Zellen in der Regel schwer zu transfizieren. Mithilfe dieses Protokolls 20-50 % von A20 express Zellen in der Regel den transfizierten GFP Fusionsprotein, und unter dieser Bevölkerungsgruppe sind die Ebenen der Proteinexpression variabel. Trotzdem super-Resolution Imaging von Aktin und Mikrotubuli, die mit den Verfahren, die wir beschreiben ist recht robust und qualitativ hochwertige Bilder sind leicht erhältlich. Trotz ihrer geringen Größe im Verhältnis zu A20 Zellen zeigen wir, dass diese Verfahren auch verwendet werden können, zum Bild der Mikrotubuli-Netzwerk im primären B-Zellen, die kurz mit Lipopolysaccharid (LPS) aktiviert wurden. Wir haben gezeigt, dass LPS aktiviert primäre B-Zellen mit siRNA mit relativ hohem Wirkungsgrad (d. h.so, dass Protein Erschöpfung durch Immunoblotting nachgewiesen werden kann), transfiziert werden können so dass sie eine gute Alternative zu der Verwendung von B-Zell-Linien für einige Studien ¹⁷.

Alle tierische Verfahren wurden von der University of British Columbia Animal Care Committee genehmigt.

(1) mit dem Ausdruck GFP-Fusionsproteinen in A20 B-Lymphom-Zellen

1. A20 Zellkulturen in komplette RPMI Medium (RPMI-1640 mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS), 50 µM 2-Mercaptoethanol, 2 mM Glutamin, 1 mM Pyruvat, 50 U/mL Penicillin und 50 µg/mL Streptomycin ergänzt) bei 37 ° C in einer Gewebekultur Inkubator mit 5 % CO₂.
2. Vorbereiten des Transfection Reagens (siehe die Tabelle der Materialien) entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
   Hinweis: Dieses Protokoll wurde für die spezifischen Reagenzien optimiert und Transfektion Protokoll beschrieben der Tabelle der Materialien. Anderen Transfektion Reagenzien, die wir versucht haben, haben nicht genügend Transfektion Effizienz geführt.
3. Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer. Zentrifuge 2,5 x 10⁶ A20 Zellen (für jede Transfektion) für 5 min bei 525 X g. Aufschwemmen der Zellen in 100 µL Transfection Reagens, 1-2,5 µg von Plasmid DNA enthalten. Verwenden Sie für DNA Kodierung CLIP-170-GFP²³2,5 µg pro Transfektion. Mischen Sie vorsichtig.
4. Übertragen Sie die Zellen zu einem Brunnen von einem 6-Well-Platte zu, und stellen Sie die Lautstärke auf 2 mL mit vorgewärmten komplette RPMI Medium. Kulturzellen Sie 18 h bei 37 ° C Proteinexpression ermöglichen.

2. primäre Maustaste B Zellen zu isolieren und aktivieren sie mit LPS

1. Verwenden Sie sterilisierte chirurgische Instrumente, eine Maus, Protokolle von der Instituts Animal Care Committee genehmigt die Milz entfernt.
2. Legen Sie in der Gewebekultur-Haube ein steriles 70 µm Zelle Sieb in eine 35-mm-Gewebe-Kultur-Schale mit 3 mL sterile PBS Raumtemperatur. Verwenden Sie das Gummiteil des Kolbens aus einer 5-ml-Spritze, die Milz durch das Sieb der Zelle zerquetschen.
3. Die einzelne Zelle Aussetzung der Splenoctyes in ein steriles 15-mL-Röhrchen und Zentrifuge bei 525 X g für 5 min pipettieren.
4. Verwenden Sie eine magnetische Wulst-basierten B-Zell-Isolation kit (siehe Tabelle der Materialien), um eine hoch angereicherte Population von B-Zellen zu erhalten.
5. Aufschwemmen der B-Zellen, 3 x 10⁶/mL in kompletten RPMI Medium mit 2,5 µg/mL LPS plus 5 ng/mL B Zelle Aktivierung Faktor (BAFF; ein Überleben Zytokin) ergänzt.
6. Kultur der Zellen für 6 h bei 37 ° C.

3. Beschichtung Glasdeckgläser mit Antikörpern Anti-Ig

1. Bereiten Sie die Antikörperlösung für die Beschichtung der Deckgläsern. Verdünnen der Stammlösung Ziege-Anti-Maus-Ig-Antikörper in Raumtemperatur sterile PBS eine 12,5 µg/mL Lösung zu machen; 400 µL Antikörper-Lösung ist erforderlich für jede Deckglas.
   Hinweis: Verwenden Sie Ziege Anti-Maus IgG für A20 Zellen; Maus: Ziege Anti-IgM für primäre B-Zellen. Ziege IgG Antikörper binden nicht gut auf Maus-Fc-Rezeptoren. Aber, um jede mögliche Fc Rezeptorbindung zu vermeiden, eine F(ab) oder F(ab')₂ Fragmente von Anti-Maus IgG oder IgM-Antikörper Anti-Maus können.
2. Tauchen Sie ein #1.5-18 mm Runde Glas-Deckglas in 100 % Methanol und vollständig trocknen lassen (ca. 10 min).
3. Mit Pinzette, legen Sie die getrockneten Deckglas in einer Gewebekultur 12-Well Platte und pipettieren 400 µL die 12,5 µg/mL Antikörperlösung (5 µg insgesamt; 2 µg/cm²) auf das Deckglas, so dass es eine Blase in der Mitte des das Deckglas bildet und breitet sich bis an den Rand.
4. Achten Sie darauf, die gesamte Deckglas abdecken, aber lassen Sie nicht die Antikörperlösung, vorbei an den Rand des Glas-Deckglas und auf der Gewebekultur Kunststoff zu verlängern. Bei Raumtemperatur für 30 min inkubieren.
5. Waschen Sie die Deckgläsern durch pipettieren 1 mL sterile PBS in der gut und anschließend absaugen, die Lösung. Wiederholen Sie zwei weitere Male, ungebundenen Antikörper zu entfernen.
6. Fügen Sie 1 mL sterile PBS, die gut mit der Antikörper-beschichtete Deckglas bis Zellen hinzugefügt werden können.
   Hinweis: Die Deckgläsern können bei Raumtemperatur, bedeckt mit PBS, für den Einsatz am gleichen Tag gehalten werden.

(4) B-Zellen auf Anti-Ig-beschichtete Deckgläsern

1. Bereiten Sie modifiziert HEPES gepufferten Kochsalzlösung (mHBS): 25 mM HEPES, pH 7,2, 125 mM NaCl, KCl, 1 mM CaCl₂5 mM, 1 mM Na₂HPO₄, 0,5 mM MgSO₄, 1 mg/mL Dextrose, 2 mM Glutamin, 1 mM Natrium Pyruvat und 50 µM 2-Mercaptoethanol). Filter dieser Lösung zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C.
2. Am Tag des Experiments machen 50 mL mHBS mit 2 % FBS (mHBS-FBS) durch Zugabe von 1 mL der Hitze-inaktivierten FBS, 50 mL mHBS. Der mHBS-FBS auf 37 ° C vor dem Gebrauch warm.
3. Zentrifugieren der transfizierten Zellen A20 oder die primären B-Zellen, die mit BAFF plus LPS bei 525 X g für 5 min kultiviert worden war.
4. Aufschwemmen der Zellen in 1 mL der mHBS-FBS, zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer und verdünnen Sie die Zellen, die 2 x 10⁵ Zellen/mL in mHBS-FBS.
5. Mit Pinzette, das Deckglas aus der Gewebekultur-Platte auf ein Stück Paraffin Film übertragen.
6. Jede Deckglas 250 µL der B-Zellen (5 x 10⁴ Zellen) hinzufügen.
7. Inkubieren Sie Deckgläsern bei 37 ° C für 15 Minuten im Dunkeln damit die B Zellen über die Anti-IgG-beschichtete Oberfläche verteilen.

5. Befestigung und Immunostaining Zellen

1. Bereiten Sie die Fixierung Lösung durch Verdünnung der Stammlösung 16 % Paraformaldehyd und 50 % Glutaraldehyd Vorratslösung in Raumtemperatur destilliertes Wasser Endkonzentrationen von Paraformaldehyd und 0,1 % Glutaraldehyd 3 % Ausbeute. Bereiten Sie die Fixierung Lösung am Tag ist es verwendet zu werden und überschüssiges Öl zu verwerfen.
   Achtung: Die Paraformaldehyd und Glutaraldehyd Stammlösungen sollten nur in einem chemischen Abzug verwendet werden. Folgen Sie den Anweisungen auf dem Sicherheitsdatenblatt (MSDS).
2. Bereiten Sie die Permeabilisierung/blockieren-Puffer (3 % BSA und 0,1 % Triton x-100 verdünnt mit PBS-Puffer). Filter dieser Lösung zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C. Am Tag des Experiments wärmen Sie die benötigte Menge auf Raumtemperatur.
3. Bereiten Sie die Färbung Puffer (1 % BSA und 0,1 % Saponin mit PBS-Puffer). Diese Lösung mit einem 0,2 µm-Filter zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C. Am Tag des Experiments wärmen Sie die benötigte Menge auf Raumtemperatur.
4. Pipettieren 350 µL der Lösung Fixierung auf jeder Deckglas, um sicherzustellen, dass die Oberfläche vollständig bedeckt ist. Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min in der Dunkelheit.
5. Entfernen Sie die Fixierung-Lösung aus dem Deckglas durch Absaugen vorsichtig vom Rand der das Deckglas mit einem Micropipet.
   Achtung: Die Fixierung-Lösung sollte als gefährlicher chemischer Abfall entsorgt werden.
6. Waschen Sie die Deckgläsern einmal mit 500 µL Puffer Permeabilisierung/blockieren. Pipettieren der Flüssigkeit.
7. Permeabilize und die Zellen zu blockieren, indem jeder Deckglas 250 µL Puffer Permeabilisierung/blockieren hinzufügen und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
8. Verdünnen Sie die Kaninchen Anti-Tubulin Antikörper 1: 100 in der Färbung Puffer.
9. Aspirieren aus Permeabilisierung/blockieren-Puffer von der Deckgläsern, und jeder Deckglas 50 µL der verdünnten Antikörper Anti-Tubulin-Lösung hinzu. Inkubation bei Raumtemperatur für 30 min in der Dunkelheit.
10. Bereiten Sie die sekundäre Antikörper/Aktin Fleck Lösung durch Verdünnung der Alexa Fluor 532 konjugiert Ziege-Anti-Kaninchen-IgG Sekundärantikörper und Alexa Fluor 568 konjugiert Phalloidin 1: 100 in der Färbung Puffer.
11. Waschen Sie die Deckgläsern 3 Mal um überschüssige Primärantikörper zu entfernen, durch Zugabe von 500 µL Puffer Färbung und dann Absaugen es.
12. Jede Deckglas 50 µL der sekundären Antikörper/Aktin-Fleck-Lösung hinzu, und 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
13. Waschen Sie die Deckgläsern 3 Mal um überschüssige Sekundärantikörper zu entfernen, durch Zugabe von 500 µL Puffer Färbung und dann Absaugen es.
14. Fügen Sie 10 µL Reagenz Montage auf einen Objektträger. Montieren Sie das Deckglas auf den Objektträger mit der Zelle-Seite nach unten.
    Hinweis: Ein "Anti-Fade" Eindeckmedium (siehe Tabelle der Materialien) wird dringend empfohlen, die Fluoreszenzintensität der GFP Fusionsproteine zu bewahren. Vermeiden Sie die Verwendung der Montage Reagenzien mit DAPI, die mit der Abbildung von der Fluorophore stören können, wenn die STED-Laser verwenden.
15. Lassen Sie über Nacht trocknen Sie die Folien im Dunkeln. Bild der Folien am nächsten Tag.
    Hinweis: Die Folien Imaging, sobald das Deckglas trocken ist wird dringend empfohlen wie die GFP Fluoreszenz im Laufe der Zeit sinkt.

6. Bildgebung mit der STED-Mikroskop

Hinweis: Bitte beachten Sie, dass alle unten beschriebenen Software-Schritte sind spezifisch für das Mikroskop und die Software, die wir verwendet (siehe die Tabelle der Materialien). Die Schritte und Einstellungen müssen angepasst werden, wenn die Bildgebung mit einer anderen Mikroskop/Software ausgeführt wird.

1. Schalten Sie die STED-Mikroskop, aktivieren Sie Laser und Epifluoreszenz Beleuchtung und starten Sie die Mikroskop-Software.
2. Legen Sie die Parameter für die STED-Erschöpfung-Laser.
   Hinweis: Dies hängt das spezifische Mikroskop verwendet wird und die Laser, denen es mit ausgestattet ist. Einige empfohlene Einstellungen Weißlicht (WLL) 70 %; 592 nm Laser 80 %; 660 nm Laser 80 %.
3. Aktivieren Sie die STED-Einstellungen und richten Sie die STED-Laserstrahlen mit dem 100 X Objektiv.
4. Verwenden das Okular, konzentrieren Sie sich die Probe und wählen Sie eine Zelle mit moderaten GFP Ausdruck.
   Hinweis: Niedrige GFP-Ausdruck wird nicht sichtbar, da STED die Emissionsintensität reduziert. Im Gegensatz dazu induziert hohe Expression von CLIP-170-GFP die spontane Bildung von großen Clustern, die nicht den normalen Mikrotubuli Plus-End Protein komplexe Morphologie und Verteilung widerspiegelt. Auswählen einer Zelle mit moderaten GFP Expression ist essentiell für die Bildgebung genau der Zellskelett Strukturen auf der Antigen-Kontakt-Seite.
5. Zoom in der ausgewählten Zelle und wählen Sie die Region von Interesse für abgebildet werden. Stellen Sie den Fokus, so dass die X-y -Ebene der B-Zellen, die am nächsten an das Deckglas ist im Fokus.
   1. Um dies zu tun, stellen Sie das Ziel schrittweise näher auf das Deckglas, sodass B Zellskelett Zellstrukturen in den Mittelpunkt kommen und dann unscharf gehen. Dann bewegen allmählich das Ziel in die entgegengesetzte Richtung, bis die B Zellskelett Zellstrukturen zunächst wieder in den Fokus gerückt.
6. Optimieren Sie die Einstellungen, einschließlich der Laserleistung, Erregung Strahl und detektorbereich. Beginnen Sie mit den Einstellungen von den Anweisungen des Herstellers empfohlen. Das Signal für die Proben zu optimieren Bedarf dann nehmen Sie Anpassungen vor. Bild alle Proben mit den gleichen Einstellungen miteinander verglichen werden.
7. Auf der Registerkarte "acquire" der Software soll die Bildaufnahme sequentielle Frame Akquisition im unteren linken "Sequentieller Scan" durch die Option "zwischen Frames".
8. Legt die Übernahme-Sequenz.
   Hinweis: Wir erwerben die GFP-Fluoreszenz zuerst zur Vermeidung der Verschlechterung des GFP-Signals.
   Abhängig von der Kombination des Fluorophore, die neben GFP verwendet werden, kann der längeren Wellenlänge Fluoreszenzsignal imaging zunächst bessere Ergebnisse. Jedoch sollte die Reihenfolge der Fluorophore oder fluoreszierende Proteine sind stimulierte Emission Depletion unterzogen und abgebildet optimiert werden, um die stärkste Fluoreszenz-Signale und beste Auflösung zu erhalten.
9. Wählen Sie und setzen Sie die STED-Laserleistung für jedes Fluorophor unter dem Reiter "Acquire" der Software, und verwenden Sie den Schieberegler für die 592-nm oder 660 nm STED Laser um die Laserleistung anzupassen. Passen Sie die Kraft für die Erschöpfung 592-nm-Laser für GLP und Alexa Fluor 532. Stellen Sie den Strom für die Erschöpfung 660 nm-Laser für Alexa Fluor 568.
10. Um die Auflösung zu erhöhen und das Hintergrundsignal, gehe zu den "Erwerb" Einstellungen auf der Registerkarte "Acquire" der Software, die Linie und/oder Rahmen, indem ein Wert größer als 1 verwenden die Drop-Down-Menü für jede Option Mittelwertbildung zu erhöhen.
11. Auch das Fluoreszenzsignal mit Zeit-gated STED durch Überprüfung der gating Option für das Fluorophor auf der Registerkarte "Acquire" und Angabe von Werten für Zeit-gating zu erwerben (siehe Hinweis unten). Die STED-Laserleistung um die Auflösung zu erhöhen zu erhöhen, obwohl dies auch Immunofluoreszenz die Fluorophore erhöhen wird.
    Hinweis: Die gating Zeit müssen für das Mikroskop, Probe und Fluorophore verwendeten optimiert werden. Eine Zeit Anspritzung von 0,3 bis 6 ns wird empfohlen. Nach der Fixierung ist GFP besonders empfindlich auf hohe Laserleistung. Um die Immunofluoreszenz der GLP zu reduzieren, Zeit Anspritzung angewandt werden und die STED-Laserleistung reduziert werden sollte.
12. Funktion (PSF) verteilt auf 3D-Bilder STED zu erfassen, verwenden Sie den Schieberegler, um den Punkt zu ändern auf "3D STED".
13. Manuell erwerben Sie mehrere Bilder, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Deconvolve die Bilder (siehe Abbildung 1) mit einer Dekonvolution Software Paket⁴¹(siehe Tabelle der Materialien).

Für B-Zellen auf immobilisierte Anti-Ig zu verbreiten bietet STED-Mikroskopie, die in Verbindung mit Dekonvolution Software verwendet Bilder mit höherer Auflösung des Zytoskeletts Strukturen als konfokalen Mikroskopie. Dies zeigt sich in Abbildung 1, wo F-Aktin-Netzwerk mit dem oben beschriebenen Protokoll visualisiert wurde. Ein Vergleich der konfokalen und STED Höchstauflösung Bilder von der gleichen Probe zeigt, dass die STED-Bilder einer höheren Auflösung und zeigen detaillierte Strukturen des Aktin-Zytoskeletts (Abbildung 1). Diese Abbildung zeigt auch, dass Dekonvolution ist unerlässlich für den Erhalt der STED Bilder in hoher Qualität in die Aktin Filamente klarer definiert werden. Obwohl Dekonvolution konfokale Bilder ergibt sich eine deutliche Verbesserung der Auflösung des Bildes, bieten deconvolved STED Bilder detaillierte Strukturinformationen als deconvolved konfokale Bilder. Vor allem offenbart die dendritische Struktur der peripheren F-Aktin-Ring genauer STED-Mikroskopie (Abbildung 1 und Abbildung 2). Die Mikrotubuli-Netzwerk bei der Antigen-Kontakt-Seite war auch abgebildet, mit Hilfe der Probenvorbereitung und imaging-Protokoll beschriebenen (Abbildung 3). Mikrotubuli stammen von einer zentralen Stelle, die die MTOC, und Strahlen nach außen in Richtung der Peripherie der Zelle. In diesem Experiment durften die B-Zellen auf Anti-Ig-beschichtete Deckgläsern für 15 min (Abbildung 3), einen Zeitpunkt zu verbreiten, an dem die MTOC in Richtung der Antigen-Kontakt-Seite17bewegt hat. CLIP-170-GFP-Cluster, die markieren Sie die Plus-Enden der Mikrotubuli erkennbar an den Enden der Mikrotubuli, die in Abbildung 3dargestellt. Bei der Probenvorbereitung und STED Bildgebung des Mikrotubuli-Netzwerks ist optimale, kontinuierliche und ausgeprägte sind Mikrotubuli mit CLIP-170-GFP lokalisiert entlang der Mikrotubuli oder an den Plus-enden (Abb. 3A) beobachtet. Suboptimale Mikrotubuli Färbung, die beobachtet wurde, bei niedrigeren Konzentrationen der Färbung Antikörper oder Chargen von α-Tubulin Antikörper, die mehr als ein Jahr alt, sind Ergebnisse in Mikrotubuli erscheinen als diskontinuierliche Abschnitte, die schlecht gelöst werden auf Dekonvolution (Abb. 3 b; siehe auch Abbildung 5). Obwohl alle die CLIP-170-GFP-Fluoreszenz in diesen Bildern ist mit α-Tubulin-Immunostained Strukturen verbunden, kann nicht man unterscheiden, ob CLIP-170-GFP an den plus enden oder entlang der Länge der Mikrotubuli, aufgrund der unvollständigen Färbung befindet der Mikrotubuli. Daher ist es wichtig, dass die α-Tubulin-Antikörper unter dem Hersteller empfohlenen Lagerbedingungen und innerhalb eines Jahres verwendet gespeichert werden.

Unter Verwendung dieses Protokolls, multi-Color STED Bilder in hoher Qualität, die zeigen, die Organisation und Struktur des Aktin-Zytoskeletts sowie die Mikrotubuli Netzwerk und Proteine wie IQGAP1 und CLIP-170, die diese zwei Cytoskeletons17zuordnen, konnten gewonnen werden. Die STED-Bilder in Abbildung 4 zeigen den peripheren Ring dendritischen Aktin sowie Mikrotubuli, die von einer zentralen Stelle in der Zelle ausgehen wo die Aktin-Färbung viel weniger dicht ist. CLIP-170-GFP an den Enden der diese Mikrotubuli ist eng verbunden mit der peripheren F-Aktin. Dieses Protokoll ermöglicht es, Zellskelett Strukturen an der immun Synapse mit einfarbigen STED imaging (Abbildung 2) oder multicolor STED imaging (Abbildung 3 und Abbildung 4) sichtbar zu machen. Allerdings sollte angemerkt werden, dass einzelne Farbe STED Bildgebung (Abbildung 2) besseren Auflösung von Aktin Strukturen und Mikrotubuli in B-Zellen als multi-Color STED (Abbildung 4) ergeben kann. Dies kann durch Immunofluoreszenz durch sequentielle STED-Bilderfassung für die verschiedenen Fluorophore verursacht sein. Um zu erhalten die besten Super-Auflösung sowie die Kombination von Fluorophore und fluoreszierende Proteine ausgewählt und die Reihenfolge, in der sie abgebildet sind, mit der Erregung und Erschöpfung Lasern, sollte für die Probe optimiert werden. Dennoch bietet Multi-Color STED Bildbearbeitung Bilder mit höherer Auflösung dieser Zytoskeletts Strukturen als konventionelle konfokale Mikroskopie. Darüber hinaus kann einfarbige STED verwendet werden, um 3-dimensionale Höchstauflösung Bilder des gesamten B-Zellen Aktin Netzes und die Mikrotubuli (Film 1) zu erwerben.

Wenn mit fluoreszierenden Fusionsproteine Zellen verwenden transfizierten, sind erzielen optimale Ausdruck und die Vermeidung von Artefakten durch Überexpression wichtige Überlegungen. In den Zellen wo CLIP-170-GFP überexprimiert ist, bilden sich große Aggregate der CLIP-170-GLP (Abb. 5A). Neben dieser Mislocalization der CLIP-170-GLP war nur ein Teil des Mikrotubuli-Netzwerks in dieser Zelle innerhalb der Brennebene am nächsten an das Deckglas (Abb. 5 b). Dies deutet darauf hin, dass die CLIP-170 Überexpression auch MTOC BCR-Induzierte Polarisation beeinträchtigen kann. Umgekehrt, da starke Fluoreszenz-Signale in der Regel erforderlich für den Erwerb der STED Bilder in hoher Qualität sind, führt geringe Expression von fluoreszierenden Fusionsproteinen wie CLIP-170-GLP (Abbildung 5) schlechte Bildqualität. Daher ist es bei der Verwendung von Zellen, die transfiziert wurden mit fluoreszierenden Proteinen wichtig, nur jene Zellen mit optimalen Mengen an Fusion-Protein-Expression Bild. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Transfektion-Protokoll, das für A20 diente in der Regel Ergebnisse in 20-50 % der Zellen mit dem Ausdruck der transfizierten Proteins Zellen (siehe Tabelle der Materialien). Für Plasmid DNA (im Gegensatz zu SiRNAs), Transfektion Frequenzen für primäre B-Zellen sind oft viel niedriger als bei A20 Zellen, die den Einsatz von B-Zell-Linien. Dennoch, Bilder in hoher Qualität STED Zellskelett Elemente in untransfected primären B-Zellen erhalten Sie unter Verwendung dieses Protokolls (Abbildung 6).

Abbildung 1: Vergleich der konfokalen und STED Bildgebung des F-Aktin. Konfokale Bilder (oben) und STED (unten) einer A20-Zelle, die auf Anti-IgG-beschichtete Deckgläsern für 15 min ausgebreitet hatte, bevor mit Alexa Fluor 532 konjugiert Phalloidin befleckt wird. Mit Hilfe der konfokalen STED-Mikroskops, wurde dieselbe Zelle zuerst durch konfokale Mikroskopie und dann durch STED abgebildet. Die ersten konfokale und STED Bilder werden angezeigt, zusammen mit dem gleichen konfokale und STED Bilder nach Entfaltung. Maßstab: 5 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Aktin-Zytoskeletts bei der Antigen-Kontakt-Seite. A20-Zellen, die auf Anti-IgG-beschichtete Deckgläsern für 15 min verbreiten durfte waren fleckig mit Alexa Fluor 568 konjugiert Phalloidin und durch STED-Mikroskopie abgebildet. Die Anfangsbilder STED waren deconvolved. Paneele A-B und C-E -Panels zeigen repräsentative Bilder von zwei verschiedenen Zellen. E zeigt eine 3 X-Vergrößerung der Region in das weiße Feld im Bedienfeld " C". Maßstabsleiste für Panels A-D: 5 µm. Maßstab für Panel E: 1 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: STED Bilder der Mikrotubuli Netz- und CLIP-170-GFP. A20-Zellen mit dem Ausdruck CLIP-170-GFP durften auf Anti-IgG-beschichtete Deckgläsern für 15 min vor fixiert und Immunostained mit einem α-Tubulin-Antikörper plus ein Alexa Fluor 532-konjugierten Sekundärantikörper zu verbreiten. (A) repräsentative Darstellung Immunostaining des Mikrotubuli-Netzwerks mit CLIP-170-GFP liegt vor allem an den Plus-Enden der Mikrotubuli. (B) Sub-optimale Färbung und Auflösung von Mikrotubuli durch die Verwendung einer veralteten Bestand an α-Tubulin Antikörper. Skalieren Sie Bars: 5 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: STED Bilder von Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons. A20-Zellen mit dem Ausdruck CLIP-170-GFP durften auf Anti-IgG-beschichtete Deckgläsern für 15 min bevor Sie fixiert und gefärbt mit Alexa Fluor 568 konjugiert Phalloidin, F-Aktin zu visualisieren und mit einem α-Tubulin-Antikörper plus ein Alexa Fluor 532 konjugiert zu verbreiten Sekundärantikörper, Mikrotubuli zu visualisieren. Platten- A-D und E-F -Panels zeigen repräsentative Bilder von zwei verschiedenen Zellen. D -Panel ist ein 3,5 X Erweiterung der Region in das weiße Feld im Bedienfeld " C". Skalieren Sie Bars: 5 µm für Panels A-C und E-F; 1 µm für Panel D. Das Bild in zentrale A ist das gleiche Bild in Abbildung 3A verwendet sondern umfasst die Überlagerung des F-Aktin-Kanals. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5: Beispiele für schlechte Qualität STED Bilder durch Überexpression oder unzureichender Ausdruck der GFP Fusionsprotein. A20-Zellen mit dem Ausdruck CLIP-170-GFP durften auf Anti-IgG-beschichtete Deckgläsern für 15 min bevor Sie fixiert und gefärbt wie in Abbildung 4zu verbreiten. (A, B) CLIP-170-GFP Überexpression Ergebnisse in großen, abnorme Aggregate von CLIP-170-GLP (A) und beeinträchtigt MTOC Polarisation in Richtung der Antigen-Kontakt vor Ort (B). (C) kompensieren nicht genügend Ausdruck der CLIP-170-GLP durch die Erhöhung der Laser macht resultiert STED Bilder in schlechter Qualität. Skalieren Sie Bars: 5 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6: STED Bild des Mikrotubuli-Zytoskeletts in primären B-Zellen. Primäre Milz B-Zellen wurden für 6 h mit 5 ng/µL BAFF plus 2,5 µg/mL LPS kultiviert und dann für 15 min auf Deckgläsern zu verbreiten, die mit Anti-IgM-Antikörper beschichtet worden hatte durfte. Die Zellen wurden dann fixiert und gefärbt mit einem α-Tubulin-Antikörper plus ein Alexa Fluor 568-konjugierten Sekundärantikörper Mikrotubuli zu visualisieren. Ein repräsentatives Bild wird angezeigt. Maßstab: 5 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Movie 1: 3D-Rekonstruktion von B-Zellen Mikrotubuli Netzwerk. A20 Zellen durften auf Anti-IgG-beschichtete Deckgläsern für 15 min vor fixiert und Immunostained mit einem α-Tubulin-Antikörper plus ein Alexa Fluor 488-konjugierten Sekundärantikörper zu verbreiten. Z-Scheiben wurden auf 0,2 µm Schrittweiten für insgesamt 37 Bilder eingefangen. 3D Rekonstruktion erfolgte mit der STED-Mikroskop der imaging-Software. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

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