Summary
Corriente de multiplexado de diagnóstico para detectar los Zika, chikungunya y dengue virus requieren preparación compleja y costosa instrumentación y son difíciles de usar en entornos de bajos recursos. Se muestra un diagnóstico que utiliza amplificación isotérmica con sondas desplazable filamento blanco específico para detectar y diferenciar estos virus con alta sensibilidad y especificidad.
Abstract
Zika, el dengue y el chikungunya virus son transmitidos por mosquitos, que causan enfermedades con sintomatología similar. Sin embargo, tienen potencialidades diferentes aguas abajo transmisión de paciente a paciente y requieren tratamientos de pacientes muy diferentes. Así, los brotes recientes de Zika hacen urgente a desarrollar herramientas que discriminan rápidamente estos virus en pacientes y atrapados los mosquitos, el correcto tratamiento de los pacientes y para comprender y manejar su epidemiología en tiempo real.
Desafortunadamente, pruebas de diagnóstico actuales, incluyendo ésos emergencia de 2016 recibe autorizaciones de uso y rápido estado, detectar ARN viral por transcripción reversa reacción en cadena polimerasa (RT-PCR), que requiere instrumentación, formación usuarios, y preparación de la muestra considerable. Por lo tanto, deben enviarse a laboratorios de referencia "aprobado", que requiere tiempo. De hecho, en agosto de 2016, el centro para el Control de enfermedades (CDC) estaba pidiendo que las mujeres embarazadas que había sido mordido por un mosquito y desarrolló una erupción de Zika indicando esperar un inaceptable 2 a 4 semanas antes del aprendizaje si estaban infectados. Mucho necesitamos pruebas que se pueden realizar en sitio, con pocos recursos y por personal entrenado pero no necesariamente con licencia.
Este video muestra un ensayo que cumpla con estas especificaciones, trabajando con orina o suero (para pacientes) o cadáveres de mosquitos aplastados (para la vigilancia ambiental), sin mucha preparación de la muestra. Cadáveres de mosquitos son capturados en papel con amonio cuaternario grupos (Q-papel) seguidos por el tratamiento de amoníaco para la gestión de riesgos biológicos. Estos son entonces directamente, sin el aislamiento de RNA, puestos en tubos de ensayo con reactivos liofilizados que ninguna cadena de refrigeración. Una forma modificada de amplificación isotérmica mediada lazo de transcripción inversa con sondas desplazables fluorescente etiquetas específico del destino produce lectura, en el minuto 30, como una señal de la fluorescencia tricolor. Esto se visualiza con un dispositivo portátil, con pilas con un filtro naranja. Contaminación hacia adelante se previene con tubos cerrados y el uso de termolábiles uracil ADN glicosilasa (UDG) en presencia de dUTP en la mezcla de amplificación.
Introduction
Infecciones de virus transmitidos por mosquitos, incluyendo Zika virus, dengue y chikungunya son en las estrategias de manejo inmediato de aumento y la demanda. Dengue y chikungunya virus ya son endémicos en muchas de las regiones tropicales donde Zika ahora se extiende en el hemisferio occidental1. Zika virus, como el dengue, es un miembro de la familia Flaviviridae y es nativo a África con un asiático y dos linajes genéticos africanos2. A pesar de la identificación del virus Zika se remonta a 1947, Zika infección en seres humanos seguía siendo esporádica por medio siglo antes de emerger en el Pacífico y las Américas. El primer brote reportado de Zika fiebre se produjo en la isla de Yap, en los Estados federados de Micronesia en 2007, seguido de la Polinesia francesa en 2013 y 2014. El primer brote importante en las Américas ocurrió en el año 2015 en Brasil.
Zika, chikungunya y dengue virus son transmitidos principalmente por Aedes aegypti y Aedes albopictus. Sin embargo, Zika tiene posibilidades de transmisión de humano a humano adicionales aguas abajo, es probable que se propague a través del contacto sexual, interacción de la madre al feto y a través de la lactancia materna3,4,5. La fiebre Zika primero se cree que causan sólo leves. Sin embargo, más tarde fue asociada con el síndrome de Guillain-Barré en adultos, microcefalia en recién nacidos y las enfermedades musculoesqueléticas crónicas que pueden durar meses a años. Diagnóstico de enfermedad de Zika puede ser difícil, ya que los síntomas de una infección de Zika son similares a los de otros virus mosquito-extensión6. Las coinfecciones comunes de estos virus hacen diagnóstico diferencial más difícil7,8. Por lo tanto, la detección rápida y confiable de los ácidos nucleicos de Zika y otros virus es necesario para comprender la epidemiología en tiempo real, para iniciar medidas preventivas y control y para gestionar la atención de los pacientes9.
Pruebas de diagnóstico actuales para estos virus incluyen pruebas serológicas, aislamiento viral, secuenciación de virus y transcripción reversa PCR (RT-PCR). Estándar métodos serológicos a menudo sufren de sensibilidad insuficiente y resultados pueden ser complicados por reactividad cruzada en pacientes que previamente han sido infectados por otros flaviviruses.
Por lo tanto, pruebas de ácido nucleico sigue siendo la forma más confiable para detectar y diferenciar estos virus. Detección de Zika y otros virus transmitidos por mosquitos se realiza generalmente mediante RT-PCR o RT-PCR en tiempo real en gran variedad de fluidos biológicos, como suero, orina, saliva, semen, leche materna y líquido cerebral10,11. Las muestras de orina y la saliva se prefiere generalmente sobre sangre, puesto que exhiben menos inhibición de la polimerización en cadena, cargas virales más altas, presencia de virus por largos períodos de tiempo y aumento de la facilidad de recolección y manejo de12,13. Pruebas diagnósticas basadas en RT-PCR, sin embargo, conforman la muestra extenso y caro equipamiento ciclismo térmico, haciéndolo menos óptima para el punto de atención.
Muestras de su tolerancia de sustancias inhibidoras en biológico y reversa de la transcripción mediada por el bucle de amplificación isotérmica (RT-LAMP) ha surgido como una poderosa alternativa de RT-PCR debido a su alta sensibilidad y especificidad14,15, y operación de temperatura individual, que significativamente ensayo de baja complejidad y los costos asociados, lo que es adecuado para entornos de bajos recursos. RT-LAMP, como clásicamente se implementa, consta de seis cartillas que se unen a ocho regiones distintas dentro de la meta de RNA. Funciona en temperaturas constantes entre 60 ° C y 70 ° C y utiliza una transcriptasa inversa y una ADN polimerasa con filamento fuerte desplazando la actividad.
Durante las etapas iniciales de RT-LAMP, hacia adelantados y hacia atrás interiores imprimaciones (FIP y BIP, figura 1A) junto con cartillas externas hacia adelantados y hacia atrás (F3 y B3) forman una estructura de la pesa de gimnasia, la estructura de la semilla de la amplificación exponencial de lámpara. Amplificación es aún más acelerada por el lazo hacia adelante y hacia atrás cartillas (LF y LB), que están diseñados para enlazar las regiones solo trenzadas de la pesa de gimnasia, y resultados en la formación de concatemers con la repetición de múltiples lazadas16. LÁMPARA clásica de ensayos basado en turbidez o lectura por ADN intercalando tintes no es totalmente adecuado para detección de punto de atención de Zika, donde es cierto nivel de multiplexación había deseado17,18,19. Multiplexing no es fácilmente obtenido en estos sistemas, ya que son propensos a generar falsos positivos debido a amplificaciones de fuera de objetivo.
Para gestionar estos temas, la literatura agrega un componente adicional en la forma de una "sonda desplace el filamento" a la clásica lámpara RT arquitectura20,21,22. Cada sondeo tiene una región de doble cadena de secuencia-específicas y una región sola cebado. La sonda con la región monocatenario es etiquetada con un fluoróforo de 5', y la sonda complementaria se modifica con un extintor de extremo 3'. En la ausencia de un objetivo, ninguna fluorescencia se observa debido a la hibridación de los filamentos complementarios de la sonda, que trae el fluoróforo y el quencher en proximidad cercana. En presencia de un objetivo, la sola porción de la sonda fluorescente se une a su complemento en el destino y luego se extiende por un filamento desplazando polimerasa. Extensión adicional de la polimerasa por cartillas inversas provoca la separación del quencher filamento de su filamento fluorescente etiquetado complementario, permitiendo la emisión de fluorescencia ()figura 1B). Con este diseño, la señal es generada después de la formación pesa de gimnasia, reduciendo las posibilidades de las señales de falsos positivos.
La porción de la doble hebra de la sonda desplace el filamento puede ser cualquier secuencia, y cuando se aplica la multiplexación, la misma secuencia puede utilizarse con pares de diferentes fluoróforo-quencher. Con esta arquitectura, contaminados por el virus de la orina, suero o mosquito muestras aplastadas en el papel fueron introducidas directamente en el ensayo sin preparación de la muestra. Lectura de la fluorescencia tricolor visible para el ojo humano se generaron dentro de 30-45 min, y señales fueron visualizadas por un cuadro de observación impreso en 3D que utiliza un LED azul y un filtro naranja. Liofilización de los reactivos de RT-LAMP permitió el despliegue de este kit para bajar la configuración de recursos sin necesidad de refrigeración.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nota: Los mosquitos eran los únicos animales directamente utilizados en este estudio. Los procedimientos para manejar pollos, cuya sangre se utilizó para la alimentación de los mosquitos infectados, fueron aprobados como IACUC protocolo #201507682 por la propagación de atención Animal institucional de la Universidad de Florida y Committee.Virus de uso y estudios de infección del mosquito fueron realizado en las instalaciones del BSL-3 del laboratorio de Entomología médica de Florida en Vero Beach, FL. RT-LAMP experimentos fueron realizados en el laboratorio BSL-2 compartido por FfAME y Firebird Biomolecular Sciences LLC en Alachua, FL.
1. diseño de Primers y filamento desplazando las puntas de prueba
- Extraer secuencias virales de Dengue 1 de la base de datos Instituto Broad23; secuencias de Zika y chikungunya del NIAID Virus patógeno la base de datos y análisis de recursos24.
- Crear múltiples alineaciones de la secuencia (MSAs) para las secuencias de interés utilizando el software de músculo v3.8.3125. Uso generado MSAs para buscar lámpara cartillas conjuntos dentro de una región conservada de la meta y evitar objetivos no deseados o no relevantes, como distinción entre subtipos de un objetivo.
- Seguir las normas de diseño de cartillas de la lámpara como se describe en línea (http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/) y permitir el uso de bases mixtas en Imprimaciones para cubrir el virus divergencia26. Para evitar la reactividad cruzada de juegos de primer, comparar generados cartillas de lámpara a la base de datos de virus de ARN de NCBI usando BLAST del NCBI27. Comparar cada sistema para eliminar cebadores que se dimerizan en un ensayo de multiplexado usando BLAST del NCBI así.
- La porción de la doble hebra de la sonda desplace el filamento contra cualquier secuencia del genoma viral y la secuencia genomic de mosquito de la pantalla. Modificar el 5'-extremos de la punta de prueba de enlace de destino con fluoresceína amidite (FAM), HEX tinte y tinte 5-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) Zika, chikungunya y Dengue 1, respectivamente.
- Incluyen un primer control positivo para las muestras de orina. Diseño de cartillas de lámpara a ADN mitocondrial humano. Etiqueta desplace el filamento de la sonda con TET en el extremo 5'. Etiqueta extintor las puntas de prueba que son parcialmente complementarios a cada fluorescente etiquetado probe con extintor (por ejemplo, Iowa negro-FQ) en el extremo 3'-(tabla 1).
2. virus aísla e infectados muestras del Mosquito
- Uso de los aislantes del virus Zika (tensión de Puerto Rico), virus de Chikungunya (tensión de La isla o Islas Vírgenes Británicas) y el virus del Dengue serotipo 1 (cepa de Key West). Determinar los títulos virales mediante ensayo de placa28 o RT-PCR cuantitativa29. Extraer ARN viral usando comercialmente disponibles kits de extracción de RNA.
Nota: La tabla 2 representa los títulos virales de cada cepa de virus utilizados en este estudio. - Siga el artículo publicado por Yaren et para un protocolo detallado acerca de la infección de las hembras de Ae. aegypti con Zika y chikungunya virus20. Consulte la tabla 2 para la titulación viral de la muestra de mosquito infectada con el virus Zika.
3. RT-LAMP juntada con termolábiles Uracil ADN glicosilasa
-
10 x preparación de mezcla de cartilla.
- Preparar la solución madre de 100 μm de cada cebador y sonda (ver paso 1) mediante la adición de agua libre de nucleasa. Mezclar bien y conservar a-20 ° C hasta su uso.
- Para mezcla de Primer X 10 para cada μl de mezcla de 16 Zika, Dengue 1 u objetivo de ADN mitocondrial, de la FIP, 16 μl BIP, 2 μl de F3, 2 μl de B3, 5 μl de LF, 2 μl de LB, 3 μl de LB-fluorescente etiquetado sonda, 4 μL de sonda extintor y 50 μl de agua libre de nucleasa para dar un total de 100 μl.
- Para 10 X Primer mix de Chikungunya, la mezcla de 16 μl de FIP, 16 μl BIP, 2 μl de F3, 2 μl de B3, 5 μl de LB, 2 μl de LF, 3 μl de LF-fluorescente etiquetado sonda, 4 μL de sonda extintor y 50 μl de agua libre de nucleasa para dar un total de volumen de 100 μl.
Nota: La sonda concentración descrita anteriormente utiliza 300 nM de última sonda fluorescente y 400 nM de sonda extintor. Por otra parte, el uso 80 nM de sonda de fluorescencia marcada y 200 nM de su sonda extintor para análisis en tiempo real.
- Añadir 5 μl de 10 X mezcla imprimación (para 3-plex, añadir 5 μl de cada 10 X mezcla de cartilla), 5 μl de 10 X buffer de amplificación isotérmica (1 X buffer composición: 20 mM Tris-HCl tampón, pH 8.8, 50 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 8 mM MgSO4 0,1% Tween-20, 1 mM TDT), 7 μl de mezcla de dNTP (10 mM de dATP, dCTP y dGTP, dTTP y dUTP 5 mM), 16 unidades de ADN polimerasa, 15 unidades de la transcriptasa reversa, 80 unidades de inhibidor de la ribonucleasa recombinante, 2 unidades de UDG termolábil, 1-2 μl de cantidades variables de vi ral RNAs y agua para llevar el volumen total hasta 50 μl de PCR 0,25 mL del tubo (véase Tabla de materiales).
- Incluyen ensayos de control negativo en esta etapa mediante la sustitución de volumen de RNA viral con agua. Incubar muestras entre 65-68 ° C por 45 min a 1 h, y luego analizar mediante la ejecución de 5 μl de cada muestra en gel de agarosa 2,5% en buffer de X TBE 1 que contiene bromuro de etidio (0,4 μg/mL). Use un 25 bp o 50 bp ADN como marcador en el gel.
Nota: Además de una plantilla específica no es opcional. - Para detectar la presencia de patógeno ARN, probar cada juego de cartilla y su control de plantilla no variando la concentración de temperatura o magnesio, ya que cada RT-LAMP primer set fue diseñado para trabajar en diferentes temperaturas (65 ° C a 68 ° C) o magnesio concentraciones de (6 a 10 mM final). Preparar los experimentos a temperatura ambiente.
4. RT-LAMP utilizando orina de tacon de ARN Viral
- Prueba de iniciadores RT-LAMP en diversas concentraciones finales de orina (0%, 10%, 20% y 50%) en 50 μl de volumen de reacción total. Para la concentración de la orina final de 10%, añadir 1 μl de RNA viral a 5 μl de orina. Para la concentración de la orina final de 20%, añadir 1 μl de RNA viral a 10 μl de orina. Para la concentración de la orina final de 50%, añadir 1 μl de RNA viral a 25 μl de orina.
- Para monitoreo en tiempo real de la lámpara de RT en el 10% de la orina, use un instrumento PCR en tiempo real (véase Tabla de materiales) con fluoróforo diferentes filtros.
- Para leer las señales de fluorescencia de amplicones marcados con la FAM para Zika, use un filtro desde 483 a 533 nm; para amplicones marcados con HEX para chikungunya, use un filtro desde 523 568 nm; para amplicones marcados con TAMRA para Dengue 1, utilice un filtro desde 558 a 610 nm. y para amplicones marcados con TET para ADN mitocondrial, use un filtro desde 523 568 nm.
Nota: FAM tiene máximos de excitación y emisión de 495 nm y 520 nm, respectivamente. HEX tiene máximos de excitación y emisión de 538 nm y 555 nm, respectivamente. TAMRA tiene máximos de excitación y emisión de 559 nm y 583 nm, respectivamente. TET tiene máximos de excitación y emisión de 522 nm y 539 nm, respectivamente.
- Para leer las señales de fluorescencia de amplicones marcados con la FAM para Zika, use un filtro desde 483 a 533 nm; para amplicones marcados con HEX para chikungunya, use un filtro desde 523 568 nm; para amplicones marcados con TAMRA para Dengue 1, utilice un filtro desde 558 a 610 nm. y para amplicones marcados con TET para ADN mitocondrial, use un filtro desde 523 568 nm.
- Placas de uso 96 pocillos y sello de la placa con una hoja de plástico transparente, luego incubar las muestras a 65-68 ° C durante 60-90 min y registrar la fluorescencia cada 30 s usando el light cycler. Inicialmente use 80 nM de sondas fluorescente etiquetadas y prueba de los 300 nM de sondas fluorescente etiquetadas.
- Determinar el límite de detección para cada destino añadiendo en serie diluido RNAs virales en la concentración de la orina final de 10%.
Nota: Utilice lámpara de RT en tiempo real para determinar la temperatura óptima, la concentración de magnesio, sonda de fluorescencia marcada concentración y tiempo de reacción.
- Determinar el límite de detección para cada destino añadiendo en serie diluido RNAs virales en la concentración de la orina final de 10%.
- Para visualizar la fluorescencia generada por sondas desplazable hebra por el ojo, use una fuente de luz LED azul de un light cycler con excitación a 470 nm (cualquier caja de gel de electroforesis con fuente de luz azul incorporado trabajar, ver la tabla de materiales) y grabar la imagen con una cámara de teléfono celular a temperatura ambiente en la oscuridad.
Nota: Uso 300 nM de sondas fluorescente etiquetadas, cuando es necesaria la visualización de los tres colores por el ojo con LED azul.
5. Lámpara de RT en la detección de los mosquitos infectados Zika Q papel tecnología
- Preparar cuaternario amonio modificado filtro de papel (Q-), según métodos previamente publicados con ligeras modificaciones30.
- Sumergir 1 g de círculos de papel de filtro de celulosa (véase Tabla de materiales) con un diámetro de 3,5 cm en 50 mL de 1,8% de solución acuosa de NaOH durante 15 minutos para la activación.
- Recoge círculos de papel activado por filtración de vacío y luego sumergirlos en 40 mL de solución acuosa de cloruro de trimetilamonio (2, 3-epoxipropil) (0.28 g) durante la noche a temperatura ambiente.
Nota: Mantenga la relación entre la masa de cloruro de trimetilamonio (2, 3-epoxipropil) a papel de filtro en 0.28 a 1. - Recoge el papel catiónico resultante de la filtración de vacío y neutralizar con 50 mL de 1% de ácido acético.
- Lavar el papel tres veces con etanol y secar al aire bajo una campana de flujo de aire constante.
- Corte hojas de papel Q en pequeños rectángulos (3 x 4 mm) utilizando un punzón para papel o tijeras. Aplastar los mosquitos hembras de Ae. aegypti potencialmente infectados con Zika en cada papel con un mortero micro.
- Añadir a cada papel 20 μl de solución de amoníaco acuosa de 1 M (pH ≈ 12) y espere 5 minutos. Luego lave cada papel una vez con 20 μl de EtOH de 50% y otra con 20 μl de agua libre de nucleasa. Seque el papel de bioseguridad BSL-2 gabinete durante aproximadamente 1 hora.
Nota: En este punto, las muestras pueden almacenarse a-20 ° C durante la noche hasta su uso. - Utilizando pinzas, coloque cada papel en 100 μl de mezcla de reacción RT-LAMP e incubar a 65-68 ° C durante 45 minutos hace que al sumergir totalmente el papel en la solución; no debe estar flotando. Leer y registrar la fluorescencia derivadas de virus Zika con fuente de luz LED azul y filtro naranja o amarillo.
6. liofilización de reactivos de RT-LAMP para 100 μl de volumen de reacción
- Preparar mezcla de cartilla de lámpara X 10 según el artículo 3.1 y preparar la mezcla de dNTP con dUTP según el artículo 3.2. Tienda cartilla mezcla y dNTPs a-20 ° C hasta su uso.
- Preparar 10 mL de buffer de enzima diálisis para eliminar el glicerol, al mezclar 100 μl de 1 M Tris-HCl pH 7,5, 500 μl de 1 M de KCl, 2 μl de EDTA de 0,5 M, 100 μl de 10% Tritón X-100, 100 μl de 0,1 M TDT y 9,198 mL de agua libre de nucleasa. Almacenar el buffer de diálisis a 4 ° C.
Nota: Asegúrese de filtrar (filtros de 0.2 micrones) todos soluciones tampón reactivo antes de usar y almacenar a 4 ° C.- Utilizar una membrana de ultrafiltración con límite de corte de 10 kDa (véase Tabla de materiales). Colocar 350 μl de buffer de diálisis 4 μL de 32 unidades de ADN polimerasa, 2 μl de 30 unidades de la transcriptasa reversa y 2 μl de 80 unidades de inhibidor de la Rnasa a membrana de ultrafiltración y centrifugar a 14.000 xg por 5 min a 4 ° C.
- Añadir otro 350 μl de buffer de diálisis a la membrana de la ultrafiltración y la centrífuga (14.000 x g) por 5 min otra vacía el tubo de la colección y repita este paso, luego centrifugar (14.000 x g) durante 3 minutos.
- La elución, invierta la membrana y coloque en un tubo nuevo de la colección. Centrifugado a 1.000 x g durante 2 min medir el volumen de elución; Si menos de 8 μl, llevar el volumen hasta 8 μl mediante la adición de buffer de diálisis. Almacenar la elución a 4 ° C y proceder inmediatamente al siguiente paso.
Nota: Este protocolo para la liofilización de tubo único, pero preparar los tubos de reacción por lo menos 10 a la vez utilizando la misma membrana de ultrafiltración y utilizar la misma cantidad de buffer de diálisis.
- Mezclar 10 μl de cebador de lámpara X 10 si singleplex (para 3-plex, añadir 10 μl de cada 10 X mezcla de cartilla), 14 μl de mezcla de dNTP, 8 μl de mezcla de enzima dializado, 2 μl de 2 unidades de UDG termolábil y 66 μl de nucleasa libre de agua (para 3-plex utilizar 46 μL) en un tubo de microcentrífuga de 0, 5 mL y deja la tapa abierta. En su lugar, añadir otra tapa punza con una aguja para permitir que el vapor se escape.
- Inmediatamente congelar los tubos a-80 ° C por 2 h y liofilizar el tubo de 4 h. tapa de la cámara de liofilización con papel de aluminio para protección de la luz. Cuando los reactivos se desecan, quite las tapas del pinchado, cierre la tapa original y almacenar los tubos con reactivos liofilizados a 4 ° C en la oscuridad.
Nota: Los reactivos se liofilizado durante la noche, si es necesario.
7. prueba liofilizado RT-LAMP reactivos en orina y muestras de mosquitos que contengan Zika
- Utilice los siguientes elementos del kit (véase la Tabla de materiales) para Zika: liofilizado de un cuadro de observación 3D impreso con naranja (filtro pase largo, corte en ~ 540 nm), 2 pilas AAA para la observación de la caja, tubos de reacción con la etiqueta ZV para detección de Zika, y 1.1 X la rehidratación Buffer en tubos de tapa de rosca de 1,5 mL.
- Preparar 50 mL de 1.1 X buffer de la rehidratación mediante la mezcla de 5,5 mL de 10 X buffer de amplificación isotérmica que viene junto con la polimerasa de la DNA (véase la Tabla de materiales), 3,3 mL de 100 mM de MgSO4110 μl de 0,5 M TDT y 41,09 mL de agua libre de nucleasa. Mezcla bien, alícuota 1 mL de esta solución a tubos de 1,5 mL tapa de rosca y almacenar a 4 ° C hasta su uso.
- Agregar 90 μl de tampón de rehidratación de 1.1 X a cada tubo de reacción (0,5 mL). Asegúrese de que el líquido llena la parte inferior del tubo que contiene los reactivos liofilizados (disolver con mezcla por agitación, entonces brevemente desactivación (1.000 x g)). Añadir 10 μl de muestra de orina enriquecida con el ARN viral en los tubos de reacción (véase la sección 4.1 para más detalles).
- Si pruebas los mosquitos, añada un rectángulo de papel Q sostiene mosquito canales (ya preparada en los pasos descritos en las secciones 5.2 y 5.3), junto con 10 μL agua en lugar de las muestras de orina purificada.
Nota: Como alternativa, agregue 10 μl de las muestras de suero o saliva en vez de orina. Si las muestras son extraído DNA o RNA, añadir 2-5 μl de la muestra en la mezcla de rehidratado y completar con agua libre de nucleasas hasta 10 μl de volumen de la muestra final.
- Si pruebas los mosquitos, añada un rectángulo de papel Q sostiene mosquito canales (ya preparada en los pasos descritos en las secciones 5.2 y 5.3), junto con 10 μL agua en lugar de las muestras de orina purificada.
- Cierre la tapa de los tubos de reacción. Colocar en un baño de bloque de calor (o incubadora) pre-establecido a 65-68 ° C. Incubar por 30-45 min, pero no más de 1 h. Después de la incubación, retirar el tubo del fuego. Para evitar la contaminación de los ensayos futuros, asegurar que estos tubos permanecen cerrados.
- Colocar los tubos de reacción en el cuadro de observación; la temperatura descienda a la temperatura ambiente (preferiblemente 25 º C). Encienda el interruptor en la parte posterior de la caja de observación. Observar la muestra a través del filtro naranja y capturar la imagen con una cámara de teléfono celular que se lleva a cabo a una distancia donde la imagen llena el 80% del campo de visión.
Nota: Mejor visualización se logra en ambientes de luz baja. - Después de completa la visualización, apague el interruptor. Almacenar los tubos cerrados en la oscuridad, preferiblemente con refrigeración, si es necesario la visualización más adelante.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Inicialmente, las actuaciones de cada cartilla RT-LAMP (tabla 1) con su correspondiente sustrato de RNA viral así como controles negativos fueron evaluadas por electroforesis en gel. Cartillas de RT-LAMP fueron diseñados para región objetivo de NS5 (RNA polimerasa dependiente de RNA) de Zika y Dengue 1 y nsP2 región (no-estructural proteínas P2) de Chikungunya. Las plantillas eran ARN total extraído de las poblaciones virales cultivadas en células de mono verde africano (Vero) del riñón. En un caso, total de ácido nucleico (ADN y ARN) fue extraído de una hembra infectada de Chikungunya Ae. aegypti (tabla 2).
Figura 2A muestra que algunos resultados representativos con RT-lámpara realizaron con estas muestras. En tanto singleplex y casos de multiplexado (3-plexed), RT-LAMP productos aparecen como una escalera de concatemers cuando se ejecuta en gel de agarosa. Las muestras control negativo que contenga agua como muestra dio solamente las bandas para cartillas de sí mismos, incluyendo el control de destino no específicos donde el ácido nucleico total extraído de una no infectada Ae. aegypti hembra mosquito fue utilizado como plantilla.
Para encontrar las condiciones óptimas de RT-LAMP, magnesio diferentes concentraciones y temperaturas de incubación fueron probadas. Se encontró que altas concentraciones de magnesio y temperaturas más bajas podrían generar amplicones no específicas, dando lugar a falsos positivos. Por lo tanto, 8 mM de magnesio e incubación a 65 ° C fueron utilizados en todos los experimentos de ahí en adelante (figura 2B).
Electroforesis del gel requiere la apertura del tubo de reacción, que puede dar lugar a la contaminación de la siguiente serie de experimentos por amplicones generado previamente, llevando a falsos positivos. Para evitar que la contaminación avance, dTTP fue substituido por iguales proporciones de dTTP y dUTP, para que se incorporarían dUTP en RT-LAMP amplicones. Esto convierte la posible contaminación de productos en un sustrato de uracil ADN glicosilasa (UDG) durante la preparación de cualquier posterior RT-LAMP reacciones31,32. Cuando se utiliza una versión termolábil de la UDG, amplicones dU-que contienen pueden ser digeridos a temperatura ambiente las muestras RT-LAMP se están estableciendo, y la UDG se inactiva durante la amplificación isotérmica. Por otra parte, se puede abrir el tubo de reacción para un análisis posterior, cuando sea necesario. Además del uso de la digestión de la UDG, una arquitectura que utiliza sondas de conexión genera fluorescencia que puede ser leída sin necesidad de abrir el tubo de reacción.
Figura 3A entrega el resultado del límite de detección (LOD) de Zika mediante sondas fluorescentes a ARN de Zika. Los estudios de dilución seriada demostraron que tan bajo como pfu 1.42 podría detectarse dentro de 30 minutos en un ensayo singleplex o un plexed de 3 ensayos. Cuando las muestras se diluyeron más a 0.71 pfu, se observó una señal fluorescente después de 40 minutos para un ensayo singleplex y después de 50 min para mezclas de 3 plexed. Además en tiempo real RT-LAMP, se visualizó la fluorescencia después de 35 min a través de un filtro naranja, después las muestras fueron expuestas al azul de la luz con una longitud de onda de excitación de 470 nm (figura 3B). Del mismo modo, límites de detección se midieron a 37,8 copias y pfu 1.22 para Chikungunya y Dengue 1, respectivamente (figura 3-D).
Para determinar la concentración óptima de la orina, RNA viral Zika (2.85 pfu) fue agregado a diferentes concentraciones de una muestra de orina humana auténtica (0%, 10%, 20% y 50%). Presumiblemente a causa de sus electrolitos, la señal de RT-LAMP fue retrasada de 15 a 35 min cuando orina 50% se utilizó en el ensayo. orina 10% fue determinada para ser óptimo debido a que presenta un fondo inferior. En la ausencia de objetivos Zika, ninguna amplificación se observó en cualquier concentración y fluorescencia de fondo más alta se observó en las muestras con mayor concentración de la orina (figura 3E).
Para permitir la multiplexación con lecturas de colores diferentes de la fluorescencia, 80 nM de sonda desplazable strand eran marcados con diferentes fluoróforos (FAM de Zika, hexagonal de Chikungunya y TAMRA para Dengue 1), pero acompañado por el mismo extintor (Iowa negro-FQ) con una concentración de 200 nM. La célula extraída de cultura virales RNAs (2.85 pfu de Zika, 242 copias de RNA virales para Chikungunya y pfu 1.22 para Dengue 1) fueron utilizados como blancos, diluidas en la orina 10%. Análisis en tiempo real de los datos de fluorescencia demostró un retraso en la generación de señal (unos 10 minutos) para los ensayos de 3 plexed donde cartillas para todos los blancos estaban presentes. En casos de singleplex, por otro lado, la reacción se completó dentro de 10-15 min (Figura 4A-C). Cuando fluorescencia se visualizó mediante un LED azul y filtro naranja, se observaron diferencias en la intensidad de la señal para diferentes fluoróforos, donde marca FAM amplicones fueron la parte más visible. Se espera, desde la excitación a 470 nm es la más cercana a la máxima del espectro de excitación de FAM (figura 4).
Para permitir la visualización de los tres colores con una sola longitud de onda de excitación de LED (470 nm), las concentraciones de sonda desplazable se incrementaron a 300 nM y el quencher complementario sonda a 400 nM. En casos de singleplex, generación de señal se completó dentro de 10 min de Zika, 20 min para Chikungunya y 40 min para Dengue 1. En los ensayos de 3 plexed, sin embargo, se volvió a retrasar por 20 min en todos los ensayos ()figura 5A- C). Sin embargo, sacrificio en tiempo de generación de señal permitió la visualización de los tres colores con luz azul LED con filtro naranja. Se observa fluorescencia verde Zika usando puntas de prueba 5'-final con FAM, luz fluorescencia verde amarillo se asigna a Chikungunya donde la sonda es 5'-final marcado con HEX, y fluorescencia de color rojo anaranjado se utiliza para Dengue 1, donde la sonda es 5'-end etiquetada con TAMRA (figura 5).
Para las pruebas de las muestras de mosquitos con posible infección de Zika, laboratorio infectados Ae. aegypti mosquitos hembra (tabla 2) fueron aplastadas en un rectángulo de papel de Q, seguida por el tratamiento de amoníaco para esterilizar el virus y para enlazar los expuestos viral ARN en carga positiva documento Q. Brevemente, el papel fue lavado con etanol para eliminar compuestos de pterin presentes en cadáveres de mosquitos que pueden interferir con la lectura de fluorescencia33,34. Q papeles de mosquitos que contenga directamente entonces fueron sumergidos en la mezcla de RT-LAMP y después de la incubación a 65 ° C por 30 min, se observó fluorescencia verde brillante en presencia del virus Zika (figura 6).
Entregar el kit de detección sin una cadena de refrigeración y para hacer el análisis fácil de usar, reactivos de RT-LAMP fueron liofilizados y acompañados de un búfer de rehidratación y llevó un cuadro de observación impreso en 3D que utiliza una emisión de 470 nm y un Filtro anaranjado (figura 7a). 9 utilizando volúmenes de tampón de rehidratación y 1 volumen de muestra de orina, visible fluorescencia verde se puede generar dentro de 30 minutos y la imagen puede ser capturada por ninguna cámara de teléfono celular (figura 7B). Alternativamente, pueden utilizarse muestras de mosquitos en el papel Q por el análisis de la misma mediante la adición de 1 volumen de agua en vez de muestra de orina.
Figura 1: lámpara de diseño de ensayo (A) RT-LAMP cartillas y formación de una estructura con mancuernas por un filamento desplazando a polimerasa de la DNA. (B) introducción de sondas desplace el filamento para permitir lectura de multiplexación y de fluorescencia y RT-LAMP progreso en tiempo real. Reimpreso con permiso de Yaren et al 201720. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Gel análisis de electroforesis de amplicones de. (A) formato de cartillas de la lámpara de prueba en singleplex o multiplex (3-plex) con controles positivos y negativos adecuados. Positivo los controles incluyen el ARN viral purificado con los títulos siguientes: 2,85 pfu Zika (ZV), 242 copias genómicas para Chikungunya (CH) y pfu 1.22 para Dengue 1 (D1). NTC-z, NTC-c y NTC-d soporte para ningún control de plantilla para Zika, Chikungunya y Dengue 1 cartillas en formato singleplex, respectivamente. NSC está parado para el control de destino no específicos donde total xNA (ADN y ARN) se extrae de la infección-libre Ae. aegypti. M está parado para marcador (escalera de DNA de 50 pares). (B) optimización del análisis de las condiciones por la prueba a temperaturas de incubación gama de RT-LAMP (de 55 ° C a 70 ° C) y MgSO4 concentraciones (desde 4 mM a 10 mM) en múltiplex formato en la ausencia de RNA de destino. Reimpreso con permiso de Yaren et al 201720. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: lámpara de RT en tiempo real. (A) Singleplex y multiplexado límite de detección (LOD) de Zika (ZV) con 80 nM FAM-labeled desplace el filamento sonda en tiempo real usando instrumento PCR en tiempo real (canal 483-533 nm). Las muestras se incubaron a 65 º C por unos 50 minutos fluorescencia (B) fue observada sin embargo un Filtro anaranjado seguido por la excitación de las muestras a 470 nm con luz azul. Muestras de la A fueron utilizadas para la visualización. (C) análisis en tiempo real para LOD en destino de Chikungunya (CH) con 80 nM de lámpara hexagonal-cojinete sondas en formato singleplex utilizando canales de fluorescencia de 523 568 nm en un instrumento PCR en tiempo real. (D) análisis en tiempo real para LOD contra Dengue 1 (D1) blancos con 80 nM de TAMRA-cojinete lámpara sondas en formato singleplex utilizando canales de fluorescencia de 558-610 nm en un instrumento PCR en tiempo real. (E) determinación del contenido de orina máxima en la reacción de RT-LAMP. Una gama de concentraciones de orina final (0%-50%) fueron analizadas usando 80 nM FAM-labeled punta de prueba en presencia de 2.85 pfu de Zika vRNA.NTC no = control de la plantilla en todos los paneles. Reimpreso con permiso de Yaren et al 201720. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Singleplex y multiplexar de detección de virus en la orina con sonda nM 80. (A) Zika detección en orina de 10% en formato singleplex y multiplex con 2.85 pfu de RNA viral Zika (ZV) con sonda marcada con FAM (80 nM). (B) detección de Chikungunya en la orina de 10% en formato singleplex y multiplex con 242 copias de RNA viral de la fiebre Chikungunya (CH) con sonda marcados con HEX (80 nM). (C) detección de Dengue 1 en orina de 10% en formato singleplex y multiplex con 1.22 pfu de RNA viral de Dengue 1 (D1) con sonda marcada con TAMRA (80 nM). (D) reacciones de visualización de RT-lámpara con filtro naranja después de la excitación a 470 nm con luz LED azul. Reimpreso con permiso de Yaren et al 201720. NTC = no hay control de la plantilla en todos los paneles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Singleplex y multiplexar de detección de virus en la orina con sonda nM 300. (A) Zika detección en orina de 10% en formato singleplex y multiplex con 2.85 pfu de RNA viral Zika (ZV) con sonda marcada con FAM (300 nM). (B) detección de Chikungunya en la orina de 10% en formato singleplex y multiplex con 242 copias de RNA viral de la fiebre Chikungunya (CH) con sonda marcados con HEX (300 nM). ()C) detección de Dengue 1 en orina de 10% en formato singleplex y multiplex con 1.22 pfu de Dengue1 RNA viral (D1) con sonda marcada con TAMRA (300 nM). (D) reacciones de visualización de RT-lámpara con filtro naranja después de la excitación a 470 nm con luz LED azul. Como control positivo en los experimentos de la orina, se utilizó una cartilla de la lámpara conjunto dirigido a ADN mitocondrial humano (ADNmt) con sonda marcada con TET (300 nM). NTC = no hay control de la plantilla en todos los paneles. Reimpreso con permiso de Yaren et al 201720. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Flujo de trabajo para la detección de Zika de muestras del mosquito infectado con tecnología Q-papel sano y Zika infectados Ae. aegypti (ZV 9, tabla 2). Reimpreso con permiso de Yaren et al 201720. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: el cuadro de observación de. (A) la observación cuadro utiliza dos pilas AAA en la base. Estas baterías de energía cuatro luces LED que iluminan las muestras en tubos de 0.5 mL en los cuatro orificios. Las luces LED se encienden con un interruptor. Las muestras se visualizan a través del filtro naranja. In cuadro de observación de la fluorescencia (B). De izquierda a derecha: negativo, positivo para el Zika, negativa y positiva de Zika. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Virus blanco | Nombre | Secuencia (5' - 3') | Longitud | Posición de inicio | Posición final | |||
| Zika | ZV-F3 | GAGACTGCTTGCCTAG | 16 | 9905 | 9920 | |||
| ZV-B3 | CTGGGGTCTTGTCTTC | 16 | 10145 | 10130 | ||||
| ZV-LF | CAGTTGGAACCCAGTCAAC | 19 | 10028 | 10010 | ||||
| ZV-LB | GTGGAACAGAGTGTGGATTG | 20 | 10093 | 10112 | ||||
| ZV-FIP | CCATGGATTGACCAGGTAGTTTTTTCGACTGATGGCCAATG | 41 | 9974 | 10053 | ||||
| ZV-BIP | ACCACTGARGACATGCTTGTTTTTCATGTGGTCGTTYTCC | 40 | 10070 | 10129 | ||||
| ZV-LB_NatTail |
FAM-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG GTGGAACAGAGTGTGGATTG |
60 | 10093 | 10112 | ||||
| Chikungunya | CH-F3 | CGTCAACGTACTCCTAAC | 18 | 2891 | 2908 | |||
| CH-B3 | ACGTTGGCTTTRTTTTGG | 18 | 3094 | 3077 | ||||
| CH-LF | AGCGTCTTTATCCACGGG | 18 | 2968 | 2951 | ||||
| CH-LB | AYGCATCRATAATGGCGGG | 19 | 3025 | 3043 | ||||
| CH-FIP | GAAGTTTCCTTTCGGTGGGTTTTTGGAAGACACTYTCYGG | 40 | 2932 | 2993 | ||||
| CH-BIP | AAGGAGTGGGAGGTGGATTTTTTCAYTTGGTGACTGCAG | 39 | 3006 | 3063 | ||||
| CH-LF_NatTail |
HEX-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG AGCGTCTTTATCCACGGG |
58 | 2968 | 2951 | ||||
| Dengue-1 | D1-F3 | ACAGCYCTGAATGAYATGG | 19 | 9583 | 9601 | |||
| D1-B3 | GCAGTTTCTCTCAGGC | 16 | 9803 | 9788 | ||||
| D1-LF | CACTTGYTGCCARTCATTCC | 20 | 9666 | 9647 | ||||
| D1-LB | CCATGCCGYAACCAAG | 16 | 9727 | 9742 | ||||
| D1-FIP | CTGGTGGAARTGGTGTGATTTTTTGGGAACCTTCAAAAGG | 40 | 9628 | 9693 | ||||
| D1-BIP | GAAGGAYGGGAGGGAAATAGTTTTTTTAGCCCTRCCCA CAAG |
42 | 9702 | 9763 | ||||
| D1-LB_NatTail |
TAMRA-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG CCATGCCGYAACCAAG |
56 | 9727 | 9742 | ||||
| ADN mitocondrial | MtDNA-F3 | AGCCTACGTTTTCACAC | 17 | 9183 | 9199 | |||
| MtDNA-B3 | GCGCCATCATTGGTAT | 16 | 9410 | 9395 | ||||
| MtDNA-LB | GCCTAGCCATGTGATTTCAC | 20 | 9322 | 9341 | ||||
| MtDNA-LF | GGCATGTGATTGGTGGGT | 18 | 9254 | 9237 | ||||
| MtDNA-FIP | GTCATGGGCTGGGTTTTACTTTTTCTACCTGCACGACAAC | 40 | 9213 | 9228 | ||||
| MtDNA-BIP | CTCAGCCCTCCTAATGACCTTTTTGAGCGTTATGGAGTGG | 40 | 9359 | 9344 | ||||
| MtDNA-LB_NatTail |
TTE-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG GCCTAGCCATGTGATTTCAC |
60 | 9322 | 9341 | ||||
| Extintor común | CTGACCTGACGGACTGAACGGATGGCTGAGCGCA FQ negro AACCCG-Iowa |
40 | ||||||
Tabla 1: cebadores y sondas desplazable strand. Reimpreso con permiso de Yaren et al 201720. Secuencias en negrita representan la región de doble hebra del filamento desplazando las puntas de prueba. Etiquetado como FAM (visto como fluorescencia verde), marcados con HEX (visto ligera fluorescencia verde-amarillo), marcado con TAMRA (visto como fluorescencia de color rojo anaranjado) y TET (visto como fluorescencia amarilla) sondas fueron asignadas para detectar Zika, Chikungunya, Dengue 1, y ADN mitocondrial en la orina, respectivamente. FAM tiene máximos de excitación y emisión a 495 nm y 520 nm, respectivamente. HEX tiene máximos de excitación y emisión a 538 nm y 555 nm, respectivamente. TAMRA tiene máximos de excitación y emisión a 559 nm y 583 nm, respectivamente. TET tiene los máximos de excitación y emisión a 522 nm y 539 nm, respectivamente. Para habilitar el uso de un extintor único de los fluoróforos, Iowa negro-FQ fue utilizado debido a su gama amplia absorción (420-620 nm).
| Virus, cepa (GenBank número de adhesión) | Familia/género | Títulos virales |
| Zika virus (ZV), Puerto Rico (PRVABC59, KU501215.1) | Flavivirus/Flaviviridae Grupo IV, positivo, ssRNA | 2.85 x 108 pfu/mL |
| Virus chikungunya (CH), Islas Vírgenes Británicas (linaje asiático, KJ451624) | SsRNA positivo, togaviridae/Alphavirus Grupo IV, | 2.42 x 108 genomas/mL |
| Virus chikungunya (CH), La reunión (Océano Índico linaje, LR2006-OPY1, KT449801) | SsRNA positivo, togaviridae/Alphavirus Grupo IV, | 1,89 x 108 genomas/mL |
| Virus de chikungunya (CH), extraído de La Reunion NA total de Aedes aegypti hembra (linaje del océano Índico, LR2006-OPY1, KT449801) | SsRNA positivo, togaviridae/Alphavirus Grupo IV, | 3.85 x 105 genomas/mL |
| Serotipo de dengue 1 (D-1), Key West (FL) (JQ675358) | Flavivirus/Flaviviridae Grupo IV, positivo, ssRNA | 1.22 x 106 pfu/mL |
| Identidad de Mosquito Zika (ZV), cepa | Título de pierna pfu/mL | |
| ZV 9, Puerto Rico | 4,76 x 103 |
Tabla 2: títulos virales en cultivos celulares y mosquito infectado. PFU: Unidad Formadora de placa. Reimpreso con permiso de Yaren et al 201720.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Virus transmitidos por mosquitos, incluyendo Zika, chikungunya y dengue amenazan la salud pública y la reciente Zika brotes resaltan la necesidad de alternativas de detección del punto de atención de bajo costo para el diagnóstico del paciente, así como para la vigilancia de mosquitos. Se desarrollaron métodos de amplificación isotérmica como alternativas asequibles a los sistemas de polimerización en cadena-basado. Particularmente, las plataformas basadas en RT-lámpara se han aplicado para detectar una amplia gama de patógenos. Sin embargo, el uso de plataformas isotérmicas se ha limitado principalmente a la detección de blancos solo. El método divulgado aquí utiliza una lámpara de RT modificada para permitir la detección simultánea de tres objetivos diferentes en una mezcla de reacción simple, que funciona en una gama de temperaturas moderadas (65-68 ° C), demostrada para ser especialmente conveniente debido a temperaturas superiores a 60 ° C procesamiento Zika y otros virus no infeccioso30,35.
Más aún, los datos presentados aquí muestran que RT-LAMP es capaz de tolerar sustancias que pueden estar presentes en varios fluidos biológicos15inhibidoras. Esto permite RNAs virales a amplificar sin un paso adicional de purificación de RNA añadiendo la muestra directamente en la mezcla de reacción. Dependiendo del tipo de muestra, el volumen máximo de muestra permitido debe ser determinado en cuanto a no inhibir la reacción y no provocar fluorescencia del fondo (falso positivo). El estudio aquí presentado se centra en el uso del volumen final de 10% para las muestras de orina. Sin embargo, muestras de suero y saliva pueden aplicarse también para el análisis de la misma manera20. Límites de detección fueron encontrados para ser muy por encima el reportados cargas virales en orina paciente13, así como los mosquitos infectados por el virus de20,36,37.
Vigilancia de mosquitos generalmente tiene menor prioridad por los recursos de salud pública, así de bajo coste multiplexado kit encuestar a un hogar o un espacio público tendría valor especial. Por lo tanto, este juego fue modificado por la adición de Q papel para permitir la detección de virus en mosquitos cadáveres. Documento Q contiene altos niveles de grupos de amonio cuaternario covalentemente unido, que permite la captura de ácidos nucleicos virales en su superficie a través de coulombic interacciones. Aunque fue una preocupación que Q papel podría inhibir RT-LAMP, se encontró que agregando libros cadáveres de mosquitos Q papel directamente en mezcla RT-LAMP, detección de virus exitoso podría lograrse dentro de 30 minutos. Para la generación de señal de éxito, Q papel tiene que ser pequeño suficiente (p. ej., tamaño 3 x 4 mm para el volumen de reacción de 100 μL) para sumergir en la mezcla de reacción RT-LAMP. Si es demasiado grande para el tubo de reacción, o comienza a flotar en lugar de permanecer sumergido en el líquido, la reacción no tendrá lugar y resultados pueden aparecer como falsos negativos.
Para detección de éxito y diferenciación de cada virus, cada primer conjunto debe seguir las directrices para el diseño de la cartilla de RT-LAMP, las reglas de diseño para desplazar las puntas de prueba e incluyen una opción de fluoróforos de multiplexación. Cada cartilla ajuste necesita ser defendido contra diferentes objetivos para evitar la reactividad cruzada. Además, temperatura de incubación y la concentración de magnesio es necesario ser optimizado para cada sistema. Métodos presentados aquí utilizan lecturas de fluorescencia visibles por el ojo, que fue logrado mediante la introducción de sondas desplazable del filamento a la arquitectura de RT-LAMP. Tres colores distintos se pueden visualizar en un ensayo de multiplexado cuando diferentes fluoróforos fueron asignados a cada virus de destino. Esto proporciona ventajas sobre los actuales métodos de detección Zika isotérmicos, puesto que la mayoría de los métodos publicados depende de la detección de destino y el uso de colorantes intercalantes o fluorescencia, que no son secuencia-específicas y son propensos a generar inespecífica de amplicones.
Un paso crítico a considerar es la determinación de la concentración final de sondas DESPLAZANTES fluorescencia marcadas. Se encontró que 80 a 100 nM de desplazar las puntas de prueba podría generar señales de fluorescencia dentro de 15-20 min, mientras que el tiempo de la señal se retrasó cuando 300 nM de concentración de la sonda fue utilizado. Tiempo de reacción se retrasó aún más cuando los ensayos se corrieron en forma multiplexada. La razón de cambio de 80 nM a 300 nM es permitir la visualización de todos tres fluoróforos usando una sola fuente de LED. LED azul con excitación a 470 nm es conveniente para sondas marcadas con la FAM, pero es menos conveniente para sondas marcadas con HEX o TAMRA. Por lo tanto, un sacrificio se hizo en tiempo de incubación para poder visualizar todos los tres objetivos.
Uno de los problemas con la lámpara de RT es contaminación hacia adelante. RT-LAMP genera grandes cantidades de productos en un tiempo de incubación corto y amplicones podrían ser lanzado fácilmente como aerosoles. Para mitigar este problema, dUTP fue incluido junto con otros dNTPs seguido por digestión de la UDG durante instalación de ensayo. Es importante utilizar una versión termolábil de la UDG, ya que es necesario inactivar UDG para evitar la digestión de los amplicones de RT-LAMP recién generado.
Para permitir la distribución del kit sin refrigeración, todos los componentes del ensayo deben ser liofilizado y el kit se complementa con un búfer de rehidratación. Por lo tanto, cualquier glicerol presente en las enzimas comercialmente disponibles fue quitada por ultrafiltración porque glicerol no se pueden quitar por liofilización. En una alta concentración en una mezcla de glicerol puede interferir con la actividad enzimática. La única enzima no incluida en el proceso de remoción de glicerol fue la UDG termolábil. UDG es una enzima pequeña con peso molecular del kDa 24,6, haciéndolo inadecuado para experimentos de ultrafiltración. Por lo tanto, se añadió a la mezcla de la liofilización como comprados. El glicerol residual no afectó negativamente el resultado del ensayo.
Una de las limitaciones de esta técnica de RT-lámpara fluorescente es el uso de la fuente de LED. Cuando los ensayos se corrieron en formato multiplex o singleplex, concentraciones más altas de desplazar las puntas de prueba fueron necesarios para la visualización de la señal de todos los objetivos. Sin embargo, este cambio provoca retrasos en la generación de la señal de hora. Una posible forma de superar esto podría ser el uso de dos fuentes de LED para adaptarse mejor a los otros fluoróforos (HEX y TAMRA). Esta manera, menor concentración de la sonda podría utilizarse para generar una señal con tiempos de incubación más cortos.
Otra limitación que necesita consideración es juzgar el color de la fluorescencia por ojo en un ambiente tenue. Es más fácil si un destino está presente en formato multiplex, o singleplex desde cebadores fueron diseñados no para interactuar con los demás. El análisis sería más difícil interpretar si múltiples objetivos estaban presentes en un tubo de ensayo único, como un charco de mosquitos o un paciente con más de una infección viral. Esto requeriría un cambio de arquitectura de la lectura, como una pantalla digital en lugar de juzgar por el ojo.
Un posible enfoque futuro sería aumentar el nivel de multiplexación mediante la creación de un grupo más grande de arbovirus transmitidos por mosquitos. Esto requiere cuidado primer diseño para evitar interacciones de primer-imprimación y puede requerir el uso de análogos de ácidos nucleicos modificados tales como uno mismo-evitar sistemas de reconocimiento molecular (SAMRS) y ampliado artificialmente el sistema de información genética (AEGIS) a adaptarse mejor a alto nivel de multiplexación38. Por consiguiente, la solución para la lectura de la señal en un sistema multiplex mayor sería utilizar un fluoróforo único para cada sondeo desplazar y asignar una única secuencia desplazada de cada destino y capturar las sondas desplazadas sobre una superficie sólida por ADN hibridación. Esto crearía una plataforma con formato de matriz con un solo fluoróforo y LED para excitar, pero juzgar la presencia de cada destino se basa en su posición en el array39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Varios de los autores y sus instituciones poseen propiedad intelectual asociada a este ensayo.
Acknowledgments
El trabajo fue apoyado en parte por 1R21AI128188-01 FDOH-7ZK15 y NIAID. Investigación en esta publicación fue apoyada en parte por los institutos nacionales de alergias y enfermedades infecciosas y en parte por biomédica investigación programa de Florida Departamento de salud. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales del Florida Department of Health o NIH. LLC de química combinatoria dinámica es reconocido por su apoyo y contribución a este proyecto.
El virus del dengue 1 (cepa KW010 BOL) fue proporcionado por el Departamento de Florida de salud oficina de laboratorios. Zika virus y el linaje asiático del virus chikungunya fueron proporcionados gentilmente por los centros de Control y prevención de enfermedades. El linaje del océano Índico de virus chikungunya fue amablemente proporcionado por Robert Tesh (centro de referencia mundial de virus emergentes y arbovirus, a través de la rama médica de la Universidad de Texas en Galveston, Texas) a la UF-FMEL. Agradecemos a S. Bellamy, B. Eastmond, S. Ortiz, Velez D., K. Wiggins, ZimLer r. y K. Zirbel para obtener ayuda con los estudios de la infección. También agradecemos a M. S. Kim por proporcionar papel de Q.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS | Major Science | MBE-150 | Gel electrophoresis |
| G:BOX F3 | Syngene | G:BOX F3 | Gel imaging |
| LightCycler 480 Instrument II, 96-well | Roche Applied Science | 05 015 278 001 | Real-time PCR |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore Sigma | UFC501096 | ultrafiltraton membrane for dialysis |
| Eppendorf 5417C Centrifuge | Marshall Scientific | EP-5417C | centrifuge |
| Myblock Mini Drybath | Benchmark Scientific | BSH200 | drybath |
| FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System | Labconco | 7934020 | lyophilizer |
| all priers and probes | IDT | custom | RT-LAMP primers and probes |
| dNTP set | Bioline | BIO-39049 | |
| Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) | Promega | U1191 | |
| Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0538L | enzyme |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380L | enzyme |
| RNase Inhibitor, Murine | New England Biolabs | M0314L | enzyme |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372L | enzyme |
| 50bp DNA Step Ladder | Promega | G4521 | marker |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Applied Science | 4729692001 | real-time RT-LAMP analysis |
References
- Patterson, J., Sammon, M., Garg, M. Dengue, Zika and Chikungunya: Emerging Arboviruses in the New World. Western Journal of Emergency Medicine. 17 (6), 671-679 (2016).
- Faye, O., et al. Molecular Evolution of Zika Virus during Its Emergence in the 20th Century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (1), e2636 (2014).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (1952).
- Musso, D., Gubler, D. J.
- Musso, D. Zika Virus Transmission from French Polynesia to Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1887-1887 (2015).
- Gasque, P., Bandjee, M. C. J., Reyes, M. M., Viasus, D. Chikungunya Pathogenesis: From the Clinics to the Bench. The Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 5), S446-S448 (2016).
- Villamil-Gómez, W. E., et al. Zika, dengue, and chikungunya co-infection in a pregnant woman from Colombia. International Journal of Infectious Diseases. 51, 135-138 (2016).
- Sardi, S. I. Coinfections of Zika and Chikungunya viruses in Bahia, Brazil, identified by metagenomic next-generation sequencing. J Clin Microbiol. 54, (2016).
- Shukla, S., Hong, S. -Y., Chung, S. H., Kim, M. Rapid Detection Strategies for the Global Threat of Zika Virus: Current State, New Hypotheses, and Limitations. Frontiers in Microbiology. 7, 1685 (2016).
- Jesse, J. W., et al. Single-Reaction Multiplex Reverse Transcription PCR for Detection of Zika, Chikungunya, and Dengue Viruses. Emerging Infectious Disease journal. 22 (7), 1295 (2016).
- Pabbaraju, K., et al. Simultaneous detection of Zika, Chikungunya and Dengue viruses by a multiplex real-time RT-PCR assay. Journal of Clinical Virology. 83, 66-71 (2016).
- Musso, D., et al.
- Gourinat, A. C., O'Connor, O., Calvez, E., Goarant, C., Dupont-Rouzeyrol, M.
- Notomi, T.
- Edwards, T., Burke, P. A., Smalley, H. B., Gillies, L., Hobbs, G. Loop-mediated isothermal amplification test for detection of Neisseria gonorrhoeae in urine samples and tolerance of the assay to the presence of urea. J Clin Microbiol. 52, (2014).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 16, (2002).
- Tian, B., et al. Attomolar Zika virus oligonucleotide detection based on loop-mediated isothermal amplification and AC susceptometry. Biosensors and Bioelectronics. 86, 420-425 (2016).
- Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
- Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
- Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BMC Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
- Kubota, K., Jenkins, D. M., Alvarez, A. M., Su, W. W. Fret-based assimilating probe for sequence-specific real-time monitoring of loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biol. Eng. Trans. 4, 81-100 (2011).
- Kubota, R., Jenkins, D. M. Real-Time Duplex Applications of Loop-Mediated AMPlification (LAMP) by Assimilating Probes. Int. J. Mol. Sci. 16 (3), 4786-4799 (2015).
- Li, J., Macdonald, J. Advances in isothermal amplification: novel strategies inspired by biological processes. Biosens Bioelectron. 64, (2015).
- Pickett, B. E. ViPR: an open bioinformatics database and analysis resource for virology research. Nucleic Acids Res. 40, (2012).
- Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32, (2004).
- Boonham, N. Methods in virus diagnostics: from ELISA to next generation sequencing. Virus Res. 186, (2014).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215, (1990).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Journal of visualized experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
- Reiskind, M. H., Pesko, K., Westbrook, C. J., Mores, C. N. Susceptibility of Florida Mosquitoes to Infection with Chikungunya Virus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 78 (3), 422-425 (2008).
- Glushakova, L. G., et al. Detection of chikungunya viral RNA in mosquito bodies on cationic (Q) paper based on innovations in synthetic biology. Journal of Virological Methods. 246, 104-111 (2017).
- Hsieh, K., Mage, P. L., Csordas, A. T., Eisenstein, M., Tom Soh, H. Simultaneous elimination of carryover contamination and detection of DNA with uracil-DNA-glycosylase-supplemented loop-mediated isothermal amplification (UDG-LAMP). Chemical Communications. 50 (28), 3747-3749 (2014).
- Tang, Y., Chen, H., Diao, Y. Advanced uracil DNA glycosylase-supplemented real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (UDG-rRT-LAMP) method for universal and specific detection of Tembusu virus. Sci Rep. 6, 27605 (2016).
- Thomas, A. H. Fluorescence of pterin, 6-formylpterin, 6-carboxypterin and folic acid in aqueous solution: pH effects. Photochem Photobiol Sci. 1, (2002).
- Wu, D., Lehane, M. J. Pteridine fluorescence for age determination of anopheles mosquitoes. Med Vet Entomol. 13, (1999).
- Janis, A. M. Inactivation and environmental stability of Zika virus. Emerg Infect Dis J. 22, (2016).
- Poloni, T. R., et al. Detection of dengue virus in saliva and urine by real time RT-PCR. Virology Journal. 7 (1), 22 (2010).
- Jones, P., Okeoma, C. Detection of Chikungunya virus (CHIKV) in urine of infected mice: a potential non-invasive diagnostic tool for CHIKV. J Infect Dis Ther. 3 (4), 1000226 (2015).
- Glushakova, L. G., et al. High-throughput multiplexed xMAP Luminex array panel for detection of twenty two medically important mosquito-borne arboviruses based on innovations in synthetic biology. J. Virol. Methods. 214, 60-74 (2015).
- Yaren, O., Benner, S. A. Loop Mediated Amplifications with Nucleoside Analogs. US Provisional patent. , 62,381,759 (2016).
