Dieser Artikel bietet eine Methode, um die monosynaptischen Verbindungen zwischen den Neuronen durch Tetrodotoxin und Tetrodotoxin-resistente Natrium-Kanal, NaChBac testen.
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Methodenartikel
Prüfung der monosynaptische Verbindungen in Drosophila mit Tetrodotoxin resistente Natriumkanäle
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Hier ist eine neue Technik, genannt Tetrotoxin (TTX) Engineered Widerstand für Probing Synapsen (WARFTEN) angewendet, um monosynaptischen Verbindungen zwischen den Neuronen Ziel zu testen. Die Methode beruht auf Co Ausdruck einer transgenen Aktivator mit dem Tetrodotoxin-resistente Natrium-Kanal, NaChBac, in ein bestimmtes präsynaptischen Neuron. Verbindungen mit vermeintlichen postsynaptischen Partner richten sich nach ganzen Zelle Aufnahmen im Beisein von TTX, die elektrischen Aktivität in Nervenzellen blockiert, die nicht NaChBac ausdrücken. Dieser Ansatz kann geändert werden, um mit Aktivator oder Kalzium Imaging als Reporter der Verbindungen arbeiten. Terpen verleiht den wachsenden Satz von Werkzeugen für die Bestimmung der Konnektivität innerhalb von Netzwerken zur Verfügung. WARFTEN ist jedoch eindeutig, dass es auch zuverlässig Masse oder Volumen Übertragung und Spillover Übertragung meldet.
Einleitung
Ein wesentliches Ziel der Neurowissenschaften ist, ordnen Sie die Verbindungen zwischen den Neuronen zu verstehen, wie Informationen über Schaltkreise fließt. Zahlreiche Ansätze und Ressourcen haben, um funktionelle Verknüpfung zwischen den Neuronen in einer Reihe von Modell-Systeme1,2Testen verfügbar. Um die genauesten Schaltpläne mit Elektrophysiologie zu erzeugen, ist es wichtig, zu lösen, ob beobachtete Verbindungen zwischen zwei Zellen direkt und monosynaptischen versus indirekte und polysynaptische sind. Ein Gold-Standard für die Herstellung dieser Unterscheidung in Säugetier-Neuronen ist die Wartezeit z....
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Protokoll
1. bereiten Sie fliegen und identifizieren GAL4-Promotor-Linien
- Wählen Sie eine GAL4-Promotor-Linie und überqueren sie mit fliegen, die Durchführung des Transgens UAS-NaChBac und ein optogenetische Transgen für die Aktivierung.
Hinweis: FH-CsChrimson11 aufgrund seiner hohen Leitfähigkeit und die Leichtigkeit, mit der NaChBac-vermittelten Aktionspotentialen aktiviert, ausgewählt ist. FH-NaChBac und FH-CsChrimson sind aus dem Bloomington Bestände Repository verfügbar. - Bereiten Sie All-Trans Retinal als eine Stammlösung in Ethanol (35 mM) und speichern Sie die Lösung im Gefrierschrank bei-20 ° C.
- Mix-28 µL von dies....
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Ergebnisse
Terpen dient zur Unterscheidung zwischen Mono- und polysynaptische Beiträge in synaptischen Verbindungen zwischen den Neuronen. Während schwache Stimulation einer Zelle verwendet werden, um direkte Verbindungen zu testen, Rekruten fahren größeren präsynaptischen Aktivität oft polysynaptische Verbindungen (Abbildung 1A). Terpen funktioniert durch die TTX-unempfindliche Natrium-Kanal NaChBac und Aktivator optogenetische Co zum Ausdruck zu bringen, und testen Ve.......
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Diskussion
Terpen Analyse ergänzt aktuelle Techniken zur Schaltung Rissbildung durch ermöglicht die Erkennung von Synapsen zwischen bestimmten Nervenzellen verwendet. Insbesondere offenbart der Ansatz monosynaptische Verbindungen im großen und ganzen Aktionspotentiale mit TTX-Stummschaltung während der Wiederherstellung Erregbarkeit in einer ausgewählten Population von Neuronen mit dem TTX-unempfindliche Natrium-Kanal NaChBac. Synaptischen Freisetzung wird durch optogenetische Stimulation ausgelöst, während postsynaptischen Veranst.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir möchten danken Joshua Singer, Jonathan Schenk sowie durchdachte Rezensenten für Kommentare auf das Manuskript. Wir möchten auch Danke Ben White und Harold Zakon für Diskussionen über die Technik. Jonathan Schenk lieferten die Daten für die Abbildung 3A. Diese Arbeit wurde durch ein Whitehall Foundation Grant und einem NIH-R21, QG unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| UAS-csChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55135 | Wird als neuronaler Aktivator verwendet |
| UAS-NaChBac | Bloomington Drosophila Stock Center | 9466 | Resotores Erregbarkeit in Zellen in TTX |
| Tetrodotoxin | Tochris | 1078 | den Kauf von TTX kann eine Sondergenehmigung erforderlich sein, da es sich um eine kontrollierte Substanz |
| handelt. | trans-Retinal | R2500 | Co-Faktor für Kanalrhodopsin |
| schweißbarer Edelstahl 321 erforderlich Blatt, 0.002" Dick, 10" Wide | McMaster Carr | 3254K7 | Wird verwendet, um benutzerdefinierte Fliegenhalter herzustellen. Benutzerdefinierte Folie kann bei pololu.com aus der bereitgestellten PDF-Datei lasergeschnitten werden |
| Dissektionsmikroskop | Zeiss | Stemi 2000-C | Wird zum Sezieren der |
| Vorbereitung verwendet Waxer | Almore | Eectra Waxer 66000 | Wird während der Dissektion verwendet, um die Fliege in der Folie zu sichern |
| Paraffinwachs | Joann | 4917217 | Wird mit Waxer |
| Number 5 Pinzette Fine | Science Tools | #5CO | Wird zum Sezieren und Enthüllen |
| verwendet Dissektionsschere | Fine Science Tools | 15001-08 | Wird verwendet, um Teile der Nagelhaut während der Dissektion zu entfernen |
| Wolframdraht | A-M Systems | 797500 | Verwendung mit Elektrolyse zur Herstellung von geschärften Nadeln für die Dissektion |
| Umlaufpumpe Peristaltic Pump | Simply Pumps (Amazon) | PM200S | für die Umwälzung TTX |
| Speed Controller für Peristaltische Pumpe | Zitrades (Amazon) | N/A | PWM Dimmsteuerung für LED-Leuchten oder Bänder, 12 Volt 8 Ampere, einstellbare Helligkeit Lichtschalter Dimmer Controller DC12V 8A 96W für LED-Streifenlicht B |
| Versa-Mount Präzisions-Druckluftregler | McMaster Carr | 1804T1 | Zum Anlegen von Überdruck beim Patchen |
| Glaskapilare | World Precision Instruments | TW150F-3 | Für Patch-Pipetten |
| Mehrzweck-Manometer | McMaster Carr | 3846K431 | Manometer für Druckregler |
| Elektrophysiologie Kamera | Dage MTI | IR-1000 | Jede Kamera, die im IR-Bereich (850 nm) arbeitet, funktioniert. Sie möchten keine rote Beleuchtung verwenden, da dies csChrimson |
| IR LED | Thorlabs aktivieren kann | M850F2 | Für schräge Beleuchtungsfaseroptik |
| für IR-LED | Thorlabs | M89L01 | Kopplung an IR-LED-Objektiv |
| Olympus 40X | LUMPlanFLN | Dies kann auf den meisten Mikroskopen verwendet werden und eignet sich gut zur Visualisierung von Fliegenneuronen. | |
| Amber LED | Thorlabs | M590L3d | Zur Visualisierung von RFP und mCherry |
| Blue LED | Thorlabs | M470L3d | Zur Visualisierung von GFP |
| GFP Filterset | Chroma | 49011 | Zur Visualisierung von GFP oder zur Stimulation von channel2rhodopsin |
| Custom mCherry Filter Set | Chroma | et580/25x und t600lpxr (aus dem 49306-Set), jedoch mit einer et610lp Barriere-/Emissionsoptik | Verwenden Sie diese Option nur, wenn Sie identifizierte Neuronen mit channel2rhodopsin |
| Dichroic patchen möchten, um bernsteinfarbene und blaue LED-Thorlabs zu kombinieren | . DMLP550R | Verwenden Sie nur das Pflaster unter mCherry und regen Sie channel2rhodopsin mit blauem Licht an. | |
| Rote | LED-LEDSupply | Cree XPE 620 - 630 nm | Zur Ansteuerung des csChrimson |
| LED-Treibers | LEDSupply | 3021-D-E-1000 | Zur Ansteuerung von LEDs für die optogenetische |
| Stimulation Manipulator | Sutter Instruments | MP-225 | Zur Positionierung der Pipette während der Aufnahme |
| Patchclamp Amplifier | A-M Systems | Modell 2400 | Ein gleichwertiger Verstärker ist geeignet |
| Bessel Filter | Warner Instruments | LPF 202A | Hilfsfilter zum Filtern der Stromspur zum Oszilloskop während des Patchens. |
| Datenerfassungssystem | National Instruments | NI PCIe-6321 781044-01 | Zum Aufzeichnen von Daten vom Verstärker zum Computer |
| Anschlussblock - BNC-Anschluss BNC-2090A | National Instruments | 779556-01 | Zum Anschließen des Verstärkers an die Datenerfassungskarte. |
| Stahlfolie | McMaster Carr | 3254K7 | Stahlfolie für kundenspezifische Aufnahmekammer |
| Magnete | K& J Magnetics | D42 | Zum Befestigen der Aufnahmekammer am Ringständer |
| 1/16" Zelle Gegossenes Acryl Klar | Pololu | Wird verwendet, um eine benutzerdefinierte Aufnahmekammer herzustellen. Acryl kann bei pololu.com aus der bereitgestellten PDF-Datei lasergeschnitten werden |
Referenzen
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal con....
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Nachdrucke und Genehmigungen
