Charakterisierung und Isolierung der Maus primären Mikroglia durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung

Summary

Ein Protokoll für die Isolierung von primären Mikroglia aus murine Gehirn wird vorgestellt. Diese Technik hilft bei der Förderung des gegenwärtigen Verständnis von neurologischen Erkrankungen. Dichte-Gradienten-Zentrifugierung und magnetische Trennung werden kombiniert, um genügend Ertrag einer hochreinen Probe zu produzieren. Darüber hinaus erläutern wir die Schritte zur Charakterisierung der Mikroglia.

Abstract

Mikroglia, die ansässigen Immunzellen im Gehirn, sind die first Responder, Entzündungen oder Verletzungen in das zentrale Nervensystem. Neuere Forschungen haben Mikroglia, dynamisch, fähig, Pro-inflammatorische und Anti-inflammatory Phänotypen gezeigt. (Pro-inflammatorischen) M1 und M2 (Pro-reparative) Phänotypen spielen eine wichtige Rolle in schwere Erkrankungen wie perinatale Hirnschädigung und Ausstellung unterschiedliche in Reaktion auf bestimmte Reize aus der Umwelt Funktionen. Die Modulation der Mikroglia-Aktivierung wurde festgestellt, Neuroprotektion hindeutet, Mikroglia therapeutisches Potenzial im Hirn-Trauma haben zu verleihen. Jedoch mehr Forschung ist erforderlich, um die Rolle der Mikroglia bei der Krankheit besser zu verstehen, und dieses Protokoll ermöglicht. Das Protokoll beschriebenen verbindet einen Dichte Steigung Zentrifugierung Prozess zur Reduzierung Zelltrümmer, magnetische Trennung, Herstellung von hochreinen Probe von primären Mikroglia-Zellen, die für in-vitro- Experimente, ohne verwendet werden kann die für 2-3 Wochen Kultivierung benötigen. Darüber hinaus ergeben die Charakterisierung Schritte robuste Funktionsdaten über Mikroglia, Studien, unser Verständnis von der Polarisation besser helfen und Grundieren dieser Zellen, die starke Auswirkungen auf dem Gebiet der regenerativen Medizin hat.

Introduction

Schäden, die während der Perinatalperiode von Entzündungen, hypoxische Ischämie und Blutungen kann ein Array von langfristig Folgeerscheinungen haben. Die komplexen Pathophysiologie der perinatalen Hirnschädigung ist die Theorie, Entzündungen und Ischämie mit daraus resultierenden neuronalen und axonalen Tod¹einzubeziehen. Die angeborene Immunantwort spielt eine wichtige Rolle in der Kaskade von Ereignissen führen zu Verletzungen².

Mikroglia, die ansässigen Immunzellen in das zentrale Nervensystem (ZNS), sind die first Responder auf Verletzungen³. Mikroglia sind Kunstst....

Protocol

Die folgenden Verfahren wurden von der Tier-Ethik-Kommission an der Monash Universität genehmigt. Gesunde Neugeborene unbehandelten C57Bl6/J P3-6 Mäuse wurden verwendet, um repräsentative Ergebnisse zu generieren.

(1) enzymatische Verdauung

Hinweis: Es ist wichtig zu überlegen, Sterilität bei der Isolierung und Kultivierung von Primärzellen. Während sicherstellen, dass die Umwelt so steril wie möglich ist, können die ersten Dissektion und Ernte der murine Gehirn außerhalb laminal Fluss Kapuze, mit allen weiteren Schritten innerhalb einer Laminar-Flow-Haube abgeschlossen werden.

1. Verwendung von sterilen I....

Results

Mit den beschriebenen Methoden hier reine Bevölkerungen der Mikroglia können isoliert werden und können zur Charakterisierung mittels in-vitro- und FACS Analyse vorbereitet werden. Zunächst einmal können bis zu 18 Tiere pro Keulung, mit eine erwartete Rendite von ca. 450.000-600.000 Mikroglia-Zellen verwendet werden. Es ist wichtig, die Reinheit der isolierten Zellen zuerst bestätigen, und dazu FACS Analyse durchgeführt wurde, durch Färbung für die beiden Marker CD45 und CD11b Ke.......

Discussion

Mikroglia haben die Möglichkeit, pro- und Anti-inflammatory, werden durch Reize der Umgebung verändert. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Modulation der Mikroglia-Aktivierung Neuroprotektion verleihen kann. Ihre Fähigkeit zur Gewährung von Schutz für Neuronen und Verletzungen zu reparieren erfordert mehr Forschung, um das aktuelle Verständnis dieser komplexen Zellen zu fördern. Somit ist die Isolierung von hoher Reinheit primären Mikroglia eine wichtige und nützliche Technik. Dies ist eine relativ schnelle Methode .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, niedriger Glukosegehalt, Pyruvat	Gibco	11885084
Antibiotikum-Antimykotikum (100X)	Gibco	15240062
DNaseI Grad II aus der Rinderbauchspeicheldrüse	Sigma-Aldrich	10104159001
Papain aus Papaya-Latex, gepufferte wässrige Lösung	Sigma-Aldrich	P3125-100mg
Fötales Rinderserum, qualifiziert, hitzeinaktiviert	Gibco	16140071
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Hank's Balanced Salt Solution (1X)	Gibco	14175-103
Hank's Balanced Salt Solution (10X)	Gibco	14185052
EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit	StemCell Technologies	18770	EasySep Magnetvariante
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
EasySep Buffer	StemCell Technologies	20144
Dulbecco's Phosphat gepufferte Kochsalzlösung	Gibco	14040182
Trypsin (2,5%) (10X)	Gibco	15090-046
Gereinigte Ratte Anti-Maus CD16/CD32 (Maus BD Fc Block&Handel;)	BD Biosciences	553141
Falcon 5 ml PP-Reagenzglas mit rundem Boden und hoher Klarheit, mit Schnappverschluss, steriler	Corning	352063
175 cm & sup2; Zellkulturflasche mit abgewinkeltem Hals und Vent	Cap Corning	431080
Lipopolysaccharide aus Escherichia coli O127:B8	Sigma-Aldrich	L5024
96 Well TC-behandelte Mikrotiterplatten Größe 96 Wells, klar, Polystyrol, runder Boden	Corning	CLS3799
Paraformaldehyd (Pulver, 95%)	Sigma-Aldrich	158127
Triton-X	Sigma-Aldrich	X100
Rabbit Anti-IBA1	Wako	01919741
Ziege Anti-Kaninchen IgG H& L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077<
strong>FACS Antikörper	Company	Katalognummer
V450,Rat,Anti-Maus,CD45,30-F11,RUO	BD Biosciences	560501
PerCP-Cy5.5 CD11b	eBiosciences	45-0112-82
ZombieNIR	Biolegend	423105
pHrodo Red E. coli BioParticles Konjugat	Thermo Fisher Scientific	P35361
Annexin.V_FITC	Miltenyi Biotech	130-093-060
Propodium Iodid Lösung	Miltenyi Biotech	130-093-233