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Methodenartikel

Zygotic Fluoreszenz Erholung nach dem Foto-bleichen-Analyse für Chromatin Lockerheit, die volle Laufzeit Entwicklung ermöglicht

7.3K Aufrufe

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DOI:

10.3791/57068

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12. Juni 2018

 ,  ,  , 
1Faculty of Life and Environmental Sciences, Department of Biotechnology, University of Yamanashi, 2Department of Integrated Bioscience, Graduate School of Frontier Sciences, University of Tokyo, 3Advanced Biotechnology Center, University of Yamanashi

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Chromatin Lockerheit scheint das Entwicklungspotenzial der Blastomeren beteiligt zu sein. Es ist jedoch nicht bekannt, ob Chromatin Lockerheit als ein zuverlässiger Index für das Entwicklungspotenzial für Embryonen verwendet werden kann. Hier wurde ein experimentelles System in dem Chromatin Lockerheit bewertet Zygoten, volle Amtszeit entwickeln können beschrieben.

Zusammenfassung

Live Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das ermöglicht die Analyse der molekularen Ereignisse während der Ontogenese. Vor kurzem hat Chromatin Lockerheit oder Offenheit gezeigt an das zelluläre Differenzierung Potenzial der pluripotenten embryonalen Stammzellen zu beteiligen. Es wurde bereits berichtet, dass im Vergleich mit embryonalen Stammzellen Zygoten beherbergen eine extrem gelockert Chromatinstruktur, was auf seine Verbindung mit ihren Totipotenz. Allerdings ist bis jetzt nicht angesprochen worden ob diese extrem gelockert/offene Chromatinstruktur für embryonale Entwicklungspotenzial wichtig ist. In der vorliegenden Studie wurde entwickelt, um diese Hypothese zu prüfen ein experimentelles System in die, das Zygoten, die durch Fluoreszenz analysiert wurden Erholung nach dem Foto bleichen Begriff ohne erhebliche Schäden entwickeln kann. Wichtig ist, braucht dieses experimentelle System nur eine Thermoskanne-Platte Heizung neben einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop. Die Ergebnisse dieser Studie deuten, Fluoreszenz-Erholung nach Foto-bleichen-Analyse (FRAP)-Analyse verwendet werden kann, zu untersuchen, ob die molekularen Ereignisse im zygotic Chromatin für voll ausgetragenen Entwicklung wichtig sind.

Einleitung

Nach der Befruchtung die Chromatinstruktur ist dynamisch verändert und zygotic Chromatinstruktur ist dann schließlich etablierte1,2. Während dieser Zeit, im väterlichen Vorkerne wird die dominante Chromatin-Proteins von Protamin in Histon geändert. Die daraus resultierende Chromatin ist sehr verschieden von der Spermien und weibliche Eizellen in mehreren Punkten (z.B., Histon Variante Komposition, Histon-Modifikation). So wird gebildeten zygotic Chromatin gedacht, um für spätere embryonale Entwicklung wichtig sein. Jedoch trotz der Bemühungen um die Einzelheiten der zygotic Chromatinstruktur über einen längeren Zeitraum zu offenbaren, noch Methoden zur Bewertung der Qualität von Zygoten oder ihre volle Laufzeit Entwicklung im 1-Zell-Stadium vorherzusagen, durch die Analyse ihrer Chromatinstruktur war nie gegründet.

In der vorangegangenen Studie ist es entdeckt, dass Zygoten eine extrem gelockert Chromatin Struktur3. Derzeit ist Chromatin Lockerheit oder Offenheit vermutlich ein wichtiger Faktor für die zelluläre Differenzierung Potenzial embryonaler Stammzellen (ES) Zellen4. ES-Zellen weisen nicht auf Homogenität in der Natur, sondern sind eher heterogen; in ES Zelle Kolonien erwerben einige vorübergehend ein höhere Differenzierung Potenzial Blastomeren zwei-Zell-Stadium Embryos vergleichbar. Während dieses Übergangs in die zwei-Zelle wie Staat Zellen Chromatin Lockerheit in ES verwandelt sich in was mit zwei-Zell-Stadium Embryonen5vergleichbar ist. So scheint Chromatin Lockerheit wichtig sein für zelluläre Differenzierung Potenzial und es ist möglich, die ausgiebig Chromatin in Zygoten öffnen ist nützlich für die Bewertung der zygotic Entwicklungspotenzial.

Live Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das ermöglicht die Analyse der molekularen Ereignisse während der Ontogenese, da diese Methode ermöglicht eine spätere Entwicklung und sogar voll ausgetragenen Entwicklung6. Als einer der live bildgebenden Verfahren wurde FRAP Analyse zur Chromatin Lockerheit in preimplantation Embryos und ES Zellen3,4,5zu prüfen. Wenn zygotic Chromatin Lockerheit durch FRAP Analyse ohne eine nachteilige Wirkung auf voll ausgetragenen Entwicklung analysiert werden kann, kann es sein, ein wertvolles Instrument für die Bewertung der Qualität der Embryonen im 1-Zell-Stadium. Allerdings sind die Auswirkungen auf die volle Laufzeit Entwicklung von dieser experimentellen Methode nicht untersucht worden. Vor kurzem wurde ein experimentelles System mit FRAP auszuwertende zygotic Chromatin Lockerheit entwickelt. Da dies ein neues Beobachtungssystem für Zygoten war, wurde es als zygotic FRAP (zFRAP) bezeichnet. zFRAP nicht voll ausgetragenen Entwicklung kritisch auf und wurde an anderer Stelle7gemeldet. In diesem Bericht wird das Protokoll dieser experimentellen Methode beschrieben.

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Protokoll

Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen in der Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren der Universität Yamanashi durchgeführt. Das Protokoll wurde vom Ausschuss für die Ethik von Tierversuchen von der Universität Yamanashi genehmigt (Anzahl erlauben: A24-50). Alle Operationen wurden unter Tribromoethanol Anästhesie durchgeführt, und alle Anstrengungen wurden unternommen, um Leiden zu minimieren. Eine bebilderte Übersicht der Verfahren und der Zeitplan sind in Abbildung 1 und Tabelle 1, bzw. gezeigt.

1. Vorbereitung der Boten-RNA (In vitro- Transkription von mRNA eGFP-H2B)

  1. Linearisieren 5 µg DNA-pTOPO-eGFP-H2B3,7 -Vorlage mit 30 U nicht ich in 50 µL bei 37 ° C über Nacht.
  2. Sammeln Sie 1,5 µL verdaute DNA zur Bestätigung, ob durch Elektrophorese komplett verdaut.
    1. Gelten Sie 1,5 µL und 3 bis 5 µL der unverdaute DNA mit dem Farbstoff um gut 2 % Agarose-Gel, bzw. Laden und je nach Elektrophorese.
      Hinweis: Wenn vollständig verdaut, wird ein einzelnes Band (ca. 5 kb) beobachtet. Unverdaute DNA dient als ein Steuerelement, das an einer anderen Position erscheint.
  3. Hinzufügen von DdH2O 151,5 µL und 200 µL Phenol/Chloroform/Isoamyl Alkohol (25:24:1) auf die verbleibenden verdaut DNA.
    1. Mischen Sie kräftig durch Wirbel.
    2. Mit der maximalen Geschwindigkeit für 15 min zentrifugieren.
  4. Erholen Sie den überstand zu, und fügen Sie 200 µL Chloroform.
    1. Mischen Sie kräftig durch Wirbel.
    2. Bei maximaler Geschwindigkeit für 15 min zentrifugieren.
  5. Erholen Sie den überstand zu, und fügen Sie dann 20 µL 3M Natriumacetat und 1,5 µL des Ethachinmate.
    1. Mischen Sie kräftig durch Wirbel.
    2. Fügen Sie 550 µL 100 % Ethanol und mischen Sie dann kräftig durch Wirbel.
    3. Bei maximaler Geschwindigkeit für 15 min zentrifugieren.
    4. Verwerfen Sie den überstand und dann waschen Sie die Pellets mit 70 % Ethanol.
    5. Trocknen Sie das Pellet durch Verdampfung für 5-10 Minuten.
  6. Ausgefällte Plasmid-DNA in 8 µL Nuklease-freies Wasser auflösen.
  7. Plasmid-Konzentration zu beurteilen (erwartete Konzentration geht es um 300-500 ng/µL) mit Nanodrop indem Sie die folgenden Anweisungen des Herstellers.
  8. Durchführen Sie in-vitro- Transkription für mRNA Kodierung eGFP-H2B mit 1 µg der gereinigte DNA als Vorlage in 20 µL der gesamte Reaktionsvolumen durch Anweisungen des Herstellers.
    1. Nach in-vitro- Transkription 36 μl Wasser hinzufügen, dann 1,5 µL von 56 µL synthetisierte mRNA zur Analyse durch Elektrophorese (ohne Poly A) erholen.
  9. Durchführen Sie Poly-A-Tailing für synthetisierte mRNA in einer 100 µL Reaktionsvolumen durch Anweisungen des Herstellers.
  10. Die Poly ein detailliertes mRNA eGFP-H2B 60 µL Lithium-Chlorid-Niederschlag-Lösung hinzu und mischen Sie kräftig.
    1. Bei-30 ° C für 30 min kühlen.
    2. Bei maximaler Geschwindigkeit für 15 min zentrifugieren.
    3. Verwerfen Sie den überstand und dann waschen Sie die Pellets mit 70 % Ethanol.
    4. Trocknen Sie das Pellet durch Verdampfung für 5-10 Minuten.
  11. Das Pellet mit 20 µL Nuklease-freies Wasser durch Erhitzen auf 55 ° C für 30 min auflösen.
  12. Die Konzentration der ausgefällten mRNA mit Nanodrop zu beurteilen. Verdünnen Sie, 500 ng/µL mit Nuklease-freies Wasser und Store bei-80 ° C bis zur Verwendung.
  13. Bestätigen Sie bevorzugte mRNA Produktion; Thema 1 µL der mRNA mit/ohne (erhältlich in 1.8.1 und 1,12 Schritte) Poly ein Schweif mit 1,5 µL von 0,1 mg/mL Interkalation Bromid und 3 µL probenbeladung Farbstoff für die Elektrophorese-Analyse gemischt. Angewandte Volumen betrug 5,5 µL.
    Hinweis: Poly A Tailing war erfolgreich, die verschobene Band im Vergleich zu der mRNA ohne Poly eine Tailing (Abbildung 2A) hinzuweisen.

2. Vorbereitung der Vasektomierten männliche Mäuse

  1. Wiegen Sie die ICR männliche Mäuse bei 8-12 Monate unter Verwendung einer Waage.
  2. Intraperitoneale Injektion männliche Mäuse mit 0,7 - 0,9 mL 1,2 % Tribromoethanol Anästhesie.
    Hinweis: Die Höhe der Betäubung hängt von der Größe der Maus. Beispielsweise wird eine Maus mit einem Gewicht von 40 g mit 0,8 mL Tribromoethanol Betäubung eingespritzt.
  3. Befeuchten Sie die Beere mit 70 % Ethanol.
  4. Machen Sie einen kleinen Schnitt (3-5 mm) auf die Beere und dann einen Einschnitt auf der muskelwand mit Hilfe der Schere machen.
    Hinweis: Scheren und Pinzetten sollten mit 70 % Ethanol gereinigt werden vor Beginn der Operation.
  5. Greifen Sie ein Fettpolster mit der Pinzette und ziehen Sie es vorsichtig heraus. Dann erscheinen die Hoden und Samenleiter.
    Hinweis: Samenleiter ist ein u-Rohr und mit einem roten Blutgefäße.
  6. Binden Sie die Samenleiter an zwei Punkten mit chirurgischem Nahtmaterial und dann schneiden Sie den mittleren Teil zwischen den gebundenen Punkten.
  7. Sanft zurückschieben der Fettpolster und Hoden in der Beere.
    1. Wiederholen Sie die Operation mit der verbleibenden Hoden.
  8. Nähen Sie die muskelwand mit zwei Stichen mit chirurgischen Naht.

3. IVF

  1. 8 - 10 - Wochen alten weiblichen B6D2F1 zu injizieren (BDF1) Mäusen intraperitoneal mit 7,5 IU equine Chorion-Gonadotropin (EKG) und humanes Choriongonadotropin (hCG) in 46-50 h Intervall.
  2. Rechtsfähigkeit und Besamung 1 Tag vor IVF in einer 30-mm-Schale Tropfen 300 µL menschlichen tubal Fluid (HTF)8 Medien vorbereiten, diese Tropfen mit dem Mineralöl auf dem Labortisch zu decken und dann über Nacht im Brutschrank preincubate.
  3. Gereifte männlichen ICR Mäuse durch zervikale Dislokation zu opfern. Cauda Nebenhoden mit einer 27-G-Nadel zu sezieren und Samenzelle zu sammeln. Kultur sie für Rechtsfähigkeit in 300 µL HTF Medien für 1-2 h bei 38 ° C.
  4. 16 h nach hCG-Injektion, super Eisprung weibliche Mäusen durch zervikale Dislokation zu opfern. Übertragen Sie der Legedarm Ampulle in Mineralöl neben HTF Medien und ziehen Sie dann kumuluszellen und Eizellen Komplex aus dieser Eileiter Ampulle mit einer 30-G-Nadel in das preincubated Besamung-HTF-Medium.
    Hinweis: Einige weibliche Mäuse zeigen oft nicht Eisprung trotz super Eisprung Behandlung. Erweiterten Eileiter Ampulle ist ein Zeichen der Ovulation.
  5. Übertragen Sie nach der Rechtsfähigkeit 2-3 µL Hubraum Spermiums in Besamung-HTF Medien, in denen die ovulated Eizellen gesammelt wurden.
  6. 1 h nach der Besamung, die befruchteten Zygoten zu sammeln und behandeln sie mit Hyaluronidase 100 µg/ml für 10 min im CZB9 Medien.
    Hinweis: Wenn Befruchtung richtig durchgeführt wird, werden 1 h nach der Besamung, die befruchteten Zygoten mit der Polkörper 2Nd beobachtet. Wenn weniger oder qualitativ minderwertige Spermien verwendet werden, werden nur wenig Zygoten mit der Polkörper 2Nd beobachtet. Auch wenn viele Spermien für die Befruchtung verwendet werden, tritt Polyspermy. Richtige Besamung führt zu Zygoten mit männlichen und weiblichen Vorkerne. Mithilfe dieser Kriterien ist es möglich zu finden, ob Besamung gut oder nicht erfolgt ist.
    1. Nach dem Waschen im CZB Medien unterliegen Sie die Zygoten mit einem zweiten Polkörper Mikroinjektion mit eGFP-H2B mRNA.

4. Vorbereitung der Kammer und Mikroinjektion Pipetten

  1. Verdünnen Sie RNA Codierung eGFP-H2B mit Nuklease-freies Wasser um zu eine Konzentration von 250 ng/µL zu erhalten.
  2. Bereiten Sie 2-3 Tropfen des PVP-HTF eGFP-H2B Tropfen mRNA und 5-6 Tropfen Hepes gepufferten CZB (H-CZB) Tropfen auf der 60-Millimeter-Teller. Diese Tropfen mit Mineralöl zu decken.
    Hinweis: Diese Präparate können auf dem Labortisch durchgeführt werden. Es ist keine Voraussetzung für die Nutzung der laminaren Luftstrom Kabinett.
  3. Borosilikatglas mit einer Mikropipette Abzieher zu ziehen (z. B. P = 500, Wärme = 825, ziehen = 30, Vel = 120, und Zeit = 200)
  4. Biegen Sie nach dem Bruch der Pipettenspitze gezogenem Glas Mikroinjektion Pipette in der Nähe der Spitze (300er µm zurück) bei rund 30 Grad mit einem Microforge.

5. die Mikroinjektion

  1. Schalten Sie den Teller wärmer auf der Bühne des Mikromanipulator, die Tötung von Zygoten mit einem Piezo während mRNA Injektion zu verhindern.
  2. Waschen und das Innere der Injektionsnadeln in HEPES gepufferten HTF Mantel mit 10 % PVP (PVP-HTF).
  3. Sammeln der befruchteten Zygoten mit einer 2Nd Polkörper (Abb. 2 b) und 20-25 Zygoten auf der Kammer befestigt mit einem Mikromanipulator Mikroskoptisch zu übertragen.
  4. Füllen Sie die verdünnte eGFP-H2B-mRNA in Borosilikatglas Kapillaren von den Spitzen.
  5. Halten Sie die Zygote mit einer haltepipette und brechen Sie dann die Zona Pellucida und der cytosolischen Membran mit einem Piezo-Antrieb.
  6. Ca. 10 Spritzen pL von mRNA in das Zytoplasma der Zygoten. MRNA-Injektion innerhalb von 10 min zur Vermeidung von Schäden verursacht durch längere Kultivierung der Zygoten außerhalb der Inkubator zu beenden.
    Hinweis: Das Injektionsvolumen sollte so groß sein wie der Polkörper 2Nd . Wenn die Höhe der mRNA injiziert zu groß ist, ist es möglich, kostenlose eGFP-H2B-Bruch, dazu führen, dass, der mobile Bruchteil beeinträchtigen können.
  7. 10 min nach Mikroinjektion, waschen Sie in mindestens 3 Tropfen und dann Kultur der injizierten Zygoten im CZB bei 38 ° C bis zur zFRAP Analyse.

(6) zFRAP Analyse

  1. 1 h vor der zFRAP Analyse, schalten Sie den Laser und Heizplatte auf die Bühne des konfokalen Mikroskops befestigt. Stellen Sie die Temperatur bei 38 ° C.
  2. Setzen Sie 6-10 µL CZB HEPES-gepufferte Medien mit Mineralöl auf die unteren 60 mm Glasschale bedeckt und warm die Heizung bis Zygote Sammlung.
  3. 8 - 12 h nach der Besamung, vorgewärmt sammeln 5-10 eGFP H2B-exprimierenden Zygoten und Überführung in 6 bis 10 µL HEPES gepufferten CZB mittlere Drop.
    Hinweis: Um zu vermeiden, längere Kultivierung außerhalb Inkubator, wurden ca. 5-10 eGFP H2B-exprimierenden Zygoten bei jeder Analyse verwendet. 5 bis 10 Zygoten können innerhalb von 1 h analysiert werden.
  4. Legen Sie die bleichen und imaging Bedingungen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Der Fall wird ein konfokale Laser-scanning-Mikroskop (Table of Materials) unten gezeigt:
    1. Nutzung 60 X Öl-Objektiv (60 X 60 X / 1,35 Öl).
      Hinweis: Objektive mit höherer Vergrößerung (höhere numerische Apertur) zeigen höhere Empfindlichkeit.
    2. Legen Sie die Scangeschwindigkeit als 4,0 µs/Pixel und Größe als "512" auf"Übernahme" (zusätzliche Abbildung1).
    3. Digitalzoom auf "5" (zusätzliche Abbildung1) zu erhöhen.
      Hinweis: Ein höheren Zoom ist zu erkennen, ob Fokus Drift oder nicht auftritt erforderlich.
    4. Farbstoff-Liste (ergänzende Abbildung1) und wählen Sie dann "EGFP" zu öffnen. Legen Beobachtungszeit als 1,6 s (Intervall wird als "free Run" Einstellung festgelegt) (ergänzende Abbildung1)
      Hinweis: Weitere Beobachtungspunkte können detailliertere Daten verursachen, aber es kann auch dazu führen, dass Phototoxizität. In der zFRAP Analyse scheint eine 1,6 s Beobachtungszeit ausreichen, um die elterliche Asymmetrie des Chromatins Lockerheit zu erkennen.
    5. Legen Sie die Anzahl der Bilder als 12 insgesamt (ergänzende Abbildung1).
    6. Starten Sie "Stimulus" Einstellungen und klicken Sie dann auf "Main" auf UseScanner. Scan-Geschwindigkeit als 10.0 µs/Pixel festgelegt. Klicken Sie auf "Aktivierung in Serie" und legen Sie dann PreActivation als "3 Frames" und Aktivierungszeit als "5 sec" (zusätzliche Abbildung1).
    7. Klicken Sie auf "Focus 2" und setzen Sie den Fokus, und dann "Stop".
    8. Stellen Sie Bleichen und imaging Laserleistung (477 nm) bei 110 und 15 µW, bzw. durch Anpassung "Laserleistung Gage" (zusätzliche Abbildung1).
      Hinweis: Sehr stark bleichen kann einen größeren gebleichten Bereich führen, der Schwierigkeiten für die Quantitative Analyse verursacht. Verwenden Sie für die Messung der Laserleistung einen Leistungsmesser. Es ist wichtig, die Laserleistung, die Wirkung der zeitbezogene Verschlechterung der Laserleistung zu vermeiden zu bestätigen.
    9. Stimulus-Einstellungen klicken Sie auf "Clip Rect" (zusätzliche Abbildung1). Legen Sie die Region von Interesse (ROI; rot; ROI # 1 b) als 40 x 40 Pixel (7,6 µm2). Bereiten Sie eine Referenz-Region (REF; grün; ROI #2), und ein Hintergrund (BG; blau; ROI #3) mit "Kopieren ROI" und "Einfügen ROI" (Rechte Maustaste auf die Maus).
      Hinweis: Pixelgröße eingestellt werden durch "ROI-Manager", die aufgerufen werden können, indem Sie auf die Rechte Taste der Maus, wenn der Cursor auf der ROI ist. Größere ROIs werden gedacht, um besser sein, da sie die Streuung der zFRAP Partitur zu standardisieren. Jedoch kann nicht zu groß für einen ROI für diese Analyse verwendet werden, da es schwierig macht, den Nukleolus Vorläufer Körper (NPB) zu vermeiden. eGFP-H2B in diesem Fach war gedacht, um frei von Chromatin und zeigte bemerkenswerte höhere Mobilität3. ROI und REF sollte so weit wie möglich voneinander getrennt werden. Wenn diese beiden Regionen nahe beieinander liegen, kann die bleichen auch REF und Umgebung betreffen.
    10. Klicken Sie auf der Symbolleiste auf "Live" und starten Sie "Live-Plot" (zusätzliche Abbildung1).
      Hinweis: Live Plot zeigt Fluoreszenz Signalintensität innerhalb jedes ROI und dient zur Einstellung der Laserleistung mit HV. Beachten Sie, dass wenn ROI nicht aktiviert ist, keine Intensität auf Live Grundstück Panel erkannt werden würde.
    11. Bestimmung der ROI-position
      Hinweis: ROI kann durch Ziehen in die gewünschte Position in der Vorkerne verschoben werden. (1) werden sicher zu vermeiden die Nukleolus, und (2) den gesamte ROI in den Nukleoplasma passen. Enthalten Sie der Bereich außerhalb des Gebiets der Kernmembran (Zytoplasma) in ROI nicht. Die Lokalisierung von eGFP-H2B ist in das Nukleoplasma stark eingeschränkt, so dass es leicht zu finden, ob ROI Zytoplasma enthält oder nicht durch die Fluoreszenz von eGFP-H2B. Männliche Vorkerne tendenziell größer als die Weibchen, die oft in der Nähe der Polkörper 2Nd lokalisiert sind. Bei der Verwendung beurteilen dieser Kriterien die Vorkerne männlich oder weiblich.
    12. Klicken Sie auf "Focus 2" (zusätzliche Abbildung1) und passen Sie dann die HV macht Gage des Kanals für EGFP in Fluoreszenzintensität, um das Jahr 2000 (Fluoreszenzintensität im Fenster "live-Plot" gesehen werden kann).
  5. Klicken Sie auf "Time" und dann "XY" (zusätzliche Abbildung1), um die zFRAP Analyse zu starten.
    Hinweis: Wenn "Time"-Taste passend ausgewählt ist, wird "t" sur le bouton "XY".
    1. Klicken Sie auf "Serie" (zusätzliche Abbildung1), die erscheint, nachdem FRAP Bildgebung in der Nähe von den Button"XY" und dann FRAP analysiert Daten erhalten.
    2. Speichern Sie die Datei "2D Bild anzeigen XXXXX" als bevorzugte benannte Datei (Oib. Dateiformat) durch "unter Speichern" (STRG + UMSCHALT + S kann auch verwendet werden).
    3. Wählen Sie ROI "," REF "und" BG und klicken (STRG + A kann auch verwendet werden) "Serie Analysis" in "2D Ansicht" Bildfenster.
    4. Erhalten Sie Zeile FRAP Daten zu und klicken Sie dann auf "Speichern" im Fenster "live-Handlung".
      Hinweis: Zeile FRAP quantitative Daten werden als Csv-Datei gespeichert.
  6. Setzen Sie für keine zFRAP Kontrolle einige der Zygoten injiziert mit mRNA auf den Tropfen, die in der Nähe der Rand des unteren Glasschalen, die Wirkung von Fluoreszenz Beobachtung zu vermeiden.

7. Berechnung

  1. Bei der Verwendung machen der gewonnenen quantitativen Daten das Diagramm der "Recovery-Kurve" und "mobile Fraktion" von Excel wie gezeigt in der Referenzen-3,-7 mit einigen Änderungen (siehe unten und zusätzliche excel-Datei).
  2. Berechnen Sie die relative Intensität durch Subtrahieren den Wert der BG von denen der ROI und REF in 12 Bildern für jeden Zeitpunkt.
  3. Teilen Sie den Wert des ROI durch die von der REF. Dadurch erhalten Sie 12 standardisierte relative Intensität Partituren zu jedem Zeitpunkt.
  4. Berechnen Sie den Mittelwert der relativen Partitur für ROI in 3 Bilder, die vor dem Foto bleichen.
  5. Die Wiederfindungsrate zu berechnen. Kluft, die die 12 relative Partituren für ROI die Aufnahmen zu jedem Zeitpunkt (abgerufen am 7.1.2.) durch den Durchschnitt der relative Punktzahl vor Foto Bleichen (abgerufen am 7.1.3.) abschloss. Erholung-Kurve mit diesen Noten zeichnen (Abbildung 2E).
  6. Berechnen Sie die bleichende Rate.
    Hinweis: Bleaching (in%) = 100 - Verwertungsquote von 4th Bild.
  7. Berechnen Sie den mobilen Bruch (MF) mithilfe der Formel wie folgt10,11,12
    MF (%) = 12th Wiederfindungsrate (am Endpunkt) - 4th Wiederfindungsrate / bleichen Rate × 100.

8. die Embryo-Transfer

  1. Paaren Sie gereifte ICR Weibchen 8 bis 12 Monate mit vasektomierten männlichen ICR Mäuse am Vorabend des Embryos zu übertragen, indem man sie über Nacht in den gleichen Käfig sein.
  2. Sammeln Sie die Embryonen, die zFRAP analysiert und bestimmt, auf dem zwei-Zell-Stadium zu entwickeln.
  3. Intraperitoneale Injektion weibliche Mäuse mit 0,7 - 0,9 mL 1,2 % Tribromoethanol Anästhesie oder 0,35 - 0,45 mL 0.75/4/5mg/kg Medetomidine/Midazolam/Butorphanol gemischte Agenten vor dem Embryotransfer.
    Hinweis: Die Lautstärke der Anästhesie richtet sich nach dem Körpergewicht von Mäusen. Tribromoethanol: 0,2 mL/10 g Körpergewicht; Medetomidine/Midazolam/Butorphanol Wirkstoffe gemischt: 0,1 mL/10 g Körpergewicht.
    1. Diese zwei-Zell-Stadium Embryonen in den Eileiter pseudopregnant weibliche ICR-Mäuse mit einem vaginalen Stecker bei 0,5 Tage Post Coitum (Dpc) übertragen.
    2. Setzen Sie nach dem Embryotransfer die weiblichen Mäusen auf der Heizung bei 37 ° C stellen, bis sie aufwachen.
  4. Bei 18,5 Dpc der Leihmutter durch zervikale Dislokation zu Opfern und die Welpen, abgeleitet von zFRAP analysiert Zygoten per Kaiserschnitt erholen. Einige der wiederhergestellten Welpen wurden geliefert, die Pflegemutter und ihr Körpergewicht wurden jede Woche bewertet.

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Ergebnisse

zFRAP Analyse mit eGFP-H2B

Richtig produziert wurde mRNA Kodierung eGFP-H2B, das gesehen wird, da eine verschobene Band durch Poly eine Tailing (Abbildung 2A) verursacht, in das Zytoplasma der Zygoten mit einer 2. Polkörper 1-3 h nach der Insemination (Abb. 2 b) injiziert. 8 bis 12 h nach der Besamung, Zygoten mit 2 Vorkerne zeigt den Ausdruck der eGFP-H2B wurden gesammelt...

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Diskussion

Wie in dieser Studie offenbart, verursacht die zFRAP Analyse keine kritischen Schaden voll ausgetragenen Entwicklung, was darauf hindeutet, dass diese Methode ist ein sehr nützliches Tool um die Zuordnung zwischen molekularen Ereignisse und das embryonale Entwicklungspotenzial zu offenbaren. Während der Reprogrammierung, in der zwei Zellen wie Staat der ES-Zellen, die wodurch die differenzielle Potenzial dieser Zellen so hoch wie die der zwei-Zell-Stadium Embryos wird wandelt Chromatin Lockerheit, die vergleichbar mit zw...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir danken Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura und Kana Kishida für die kritischen Anmerkungen und technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise finanziert durch das Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie Programm zur Förderung der Reform der Universitäten des Landes, M.O.; der Japan Society for the Promotion of Science (16H 02593), Asada Science Foundation und der Takeda Science Foundation, t.w. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Konfokales Laser-Scanning-MikroskopOlympusFV1200FV1000 kann auch für die FRAP-Analyse verwendet werden (Referenz #7)
ThermoplatteTokai HitTP-110RH26
Inverses MikroskopOlympusIX71
Mikro-ManupilatorNarishigeMMO-202ND
Pieze Mikro-MikromanipulatorPrime techPMAS-CT150
35 mm KulturschaleFalcom35100835 x 100 mm Stil; für IVF
60 mm KulturschaleFalcom35100760 x 15 mm Stil; für Embryokultur
50 mm KulturschaleFalcom35100650 x 9 mm Stil; für die Manipulation auf dem Tisch
50 mm GlasbodenschaleMatsunamiD91040050 mm Schale, 27 mm φ Lochgröße; für die FRAP-Analyse
MineralölOrganische Spezialchemikalien625071Für die FRAP-Analyse auf der Glasbodenschale
MineralölSigmaM8410-1LFür IVF und Embryokulturen
GlaskapillareDrummond1-000-1000Für die Handhabung von Mauszygoten
BorosilikatglasPrime techB100-75-10-PTFür die Mikroinjektion von mRNA
MikropipettenabzieherSutter-InstrumentP-97/IVFZur Vorbereitung der Injektion oder zum Halten der Injektion (Durchmesser an der Außenseite: 80 & Mikro; m, Innendurchmesser: 10 µ m) 
Mikroschmiede  NarishigeMF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 TranskriptionskitThermo
Fisher scientific		AM1340
Poly (A) Tailing KitThermo
Fisher scientific		AM1350
PVP-Lösung 10% (PVP-HTF)IrvineSceientific99311HEPES gepuffertes HTF mit 10%
PVP Natrium HEPESSigmaH3784
pTOPO eGFP-H2BTemplate Plasmid für eGFP-H2B mRNA (Referenz #6)
NorthernMax Gly Probenbeladung Farbstoff Thermo
Fisher scientific		AM8551Für die Elektrophorese von in vitro transkribierter mRNA
Phenol, Chloroform, isamylalkoholnacalai tesque25970-14
Chloroformnacalai tesque  08401-65
Nicht ITOYOBONOT-111X
EthachinmateWAKO318-01793
3664 Otischer LeistungsmesserHioki3664  Leistungsmesser für Laserleistung
StereomikroskopOlympusSZX16
: , ,

Referenzen

  1. Burton, A., Torres-Padilla, M. E. Epigenetic reprogramming and development: a unique heterochromatin organization in the preimplantation mouse embryo. Brief Funct Genomics. 9, 444-454 (2010).
  2. Okada, Y., Yamaguchi, K. Epigenetic modifications and reprogramming in paternal pronucleus: sperm, preimplantation embryo, and beyond. Cell Mol Life Sci. 74, 1957-1967 (2017).
  3. Ooga, M., Fulka, H., Hashimoto, S., Suzuki, M. G., Aoki, F. Analysis of chromatin structure in mouse preimplantation embryos by fluorescent recovery after photobleaching. Epigenetics. 11, 85-94 (2016).
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