Eine einfache und effiziente Methode zur In Vivo Cardiac-spezifische Genmanipulation durch Injektion von Intramyocardial bei Mäusen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll für Herz-Kreislauf-spezifische Genmanipulation bei Mäusen. Unter Narkose waren die Mäuseherzen durch den vierten intercostalneuralgie Raum ausgelagert. Anschließend, blot Adenoviren, die Codierung bestimmter Gene mit einer Spritze das Myokard injiziert wurden, gefolgt von Protein Ausdruck Messung via in-Vivo Bildgebung und Western Analyse.

Zusammenfassung

Genmanipulation speziell im Herzen deutlich potenzieren die Untersuchung von Herzerkrankungen Pathomechanismen und ihr Therapeutisches Potenzial. In Vivo Herz-spezifischen gen-Lieferung wird häufig durch systemische oder lokale Lieferung erreicht. Systemische Injektion über Heck Vene ist einfach und effizient bei der Manipulation von kardialen Genexpression mittels rekombinantes Adeno-assoziierten Virus 9 (AAV9). Jedoch diese Methode erfordert einen relativ hohen Anteil an Vektor für effizienten Transduktion und Energiesubventionen Orgel gen Transduktion führen kann. Hier beschreiben wir eine einfache, effiziente und zeitsparende Methode des Intramyocardial Injektion für in Vivo Herz-spezifischen gen-Manipulation bei Mäusen. Unter Anästhesie (ohne Lüftung) Dur und Moll Brustmuskeln waren unverblümt seziert und Maus Herzen wurde schnell durch manuelle Externalisierung durch einen kleinen Schnitt an der vierten intercostalneuralgie Raum ausgesetzt. Anschließend wurde Adenovirus Codierung Luciferase (Luc) und Vitamin-D-Rezeptor (VDR) oder kurze Hairpin RNA (ShRNA) gezielt VDR, mit einer Spritze Hamilton in der Herzmuskel injiziert. Nachfolgende in-Vivo Bildgebung gezeigt, dass Luciferase erfolgreich überexprimieren, speziell im Herzen war. Western-Blot Analyse im übrigen bestätigt die erfolgreiche Überexpression oder Schweigen der VDR im Herzen Maus. Einmal gemeistert, kann diese Technik für Genmanipulation sowie Injektion von Zellen oder anderen Materialien wie Nanogels im Herzen Maus verwendet werden.

Einleitung

Herzerkrankung ist die häufigste Ursache von Morbidität und Mortalität weltweit^1,2. Der Mangel an effektiven Therapiestrategien für lebensbedrohlichen Herzerkrankungen wie Herzinfarkt und Herzinsuffizienz zieht intensive Auseinandersetzung des zugrunde liegenden Pathomechanismen und Identifikation von neuartigen therapeutischen Optionen³. Für diese wissenschaftliche Erkundungen ist Herz-Kreislauf-spezifischen Genmanipulation weit verbreiteten^4,5. Kardiale Genmanipulation von Genom-Bearbeitung mit Hilfe der leistungsfähigen Transkription Aktivator-ähnliche Effektor Nuklease (TALEN) erreicht werden und regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) gruppierten / CRISPR assoziierten Protein 9 (Cas9) Werkzeuge, oder durch Lieferung von ektopische genetischen Materials (z.B. Virus Vektoren mit Genen Codierung interessierender Proteine)⁶. Wenn Genom-Bearbeitung präziser und raumzeitlichen Genom Änderungen in lebenden Mäusen ermöglicht, ist es immer noch eine zeitraubende und arbeitsintensive Praxis⁶. Alternativ, Herz-Kreislauf-spezifische Genmanipulation durch Virus Vektor oder kleine störende RNA (SiRNA) komplexe Lieferung werden routinemäßig durchgeführt⁶.

Virus Vektor Lieferung an die Erwachsenen Maus Herz wird erreicht, indem etwa zwei Strategien: systemische oder lokale Injektion. Systemische Injektion Cardiotropic Serotyp des Flugabwehrpanzer wie AAV9 ist nicht-invasive kardiale spezifisches gen-Manipulation-⁷. Jedoch diese Methode erfordert einen relativ hohen Anteil an Vektor für effiziente Signaltransduktion und Genexpression notwendig, und kann zu erheblichen Transduktion von Energiesubventionen Organen wie Muskeln und Leber⁷führen. Lokalen Virus Injektion wird durch Intramyocardial Injektion oder intracoronary Lieferung⁷erreicht. Intracoronary Lieferung führt zu einer gleichmäßigeren Verteilung des Virus innerhalb des Herzens im Vergleich zu Intramyocardial Injektion. Die Nachteile dieser Technik sind jedoch die schnelle Auswaschen von viralen Vektoren auf die systemische Zirkulation und Transduktion in Energiesubventionen Organe⁸und die Anforderung von Geräten für die Druckmessung während der Operation. Im Gegensatz dazu Vektor Intramyocardial Injektion ermöglicht bessere Virus Retention in den Herzmuskel sowie ortsspezifische Lieferung, aber es versäumt, virale verteilen-⁷. Für Kleintiere ist intracoronary Lieferung technisch schwierig, ausführen, während systemische AAV9 Injektion und Intramyocardial Injektion häufiger praktizierte^{4,5,7 sind}. Obwohl systemische Injektion leicht durchzuführen ist, herkömmliche Intramyocardial Injektion erfordert mechanische Lüftung und Thorakotomie verursacht umfangreiche Gewebeschäden und ist zeitaufwendig.

In diesem Bericht beschrieben, eine einfache, zeitsparende und hocheffiziente Methode für die Intramyocardial Injektion. Adenovirus Codierung Luciferase und VDR oder ShRNA targeting VDR, injiziert wurde, um kardialen Genexpression zu manipulieren. Einmal gemeistert, kann diese Methode für Genmanipulation sowie Injektion von Zellen oder anderen Materialien im Herzen Maus verwendet werden.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden nach den nationalen Institute der Gesundheitsrichtlinien auf die Verwendung von Labortieren durchgeführt und wurden durch des Instituts-Tier-Ethik-Kommission genehmigt. Für die Experimente wurden männliche C57BL/6J Mäuse (im Alter von 8 bis 10 Wochen) verwendet. Untergebracht waren die Mäuse Pathogen-freies Bedingungen bei 24 ° C ± 4 ° C, unter einem 12 h Hell/Dunkel-Zyklus, mit freiem Zugang zu Wasser und Nahrung.

1. Vorbereitung des Adenovirus-Lösung

1. Bewahren Sie bei der Ankunft der gereinigten Adenovirus-Lösung die Lösung in einem-80 ° C Gefrierschrank auf.
   Hinweis: Die Adenovirus-Injektion erfolgte in lebensfähige Mäuse. Um die Sterilität der Adenovirus-Vektor zu gewährleisten, das Adenovirus (Codierung Luciferase, VDR oder ShRNA targeting VDR) wurden aufbereitet und gereinigt kommerziell^9,10.
2. Am Tag der Operation nehmen Sie die gereinigten Adenovirus-Lösung (3 x 10¹⁰ Plaque bildenden Einheiten [Pfu] /mL) aus dem-80 ° C Gefrierschrank, und tauen Sie Adenovirus-Vektor-Lösung auf dem Eis auf.
3. Eine Gesichtsmaske, sterile Handschuhe und sterile Kleid anziehen.
4. Bereiten Sie eine 50-µL Hamilton-Spritze, die am Tag vor der Operation sterilisiert worden.
   Hinweis: Für die Sterilisation, die Hamilton-Spritze wurde in Gaze eingewickelt und in ein hoher Temperatur/hoher Druck Sterilisator. Der Modus "Sterilisation für die solide" wurde ausgewählt und Sterilisation wurde begonnen, durch Drücken der Taste "Start".
5. Nach dem vollständigen Auftauen der gereinigten Adenovirus-Lösung, Sprühen Sie die Röhrchen mit Adenoviren Lösung mit 75 % Ethanol, und verschieben Sie die Adenovirus-Lösung in einer Laminar-Flow sterile Kapuze.
6. Aspirieren Sie in einer Laminar-Flow sterile Kapuze 50 µL Adenovirus-Lösung mit der Hamilton Spritze ohne Nadel, gefolgt durch Anbringung einer 30 G-Nadel an der Hamilton-Spritze.
7. Halten Sie die Spritze mit der 30 G-Nadel nach oben, und schieben Sie den Kolben der Spritze, bis die Nadel mit Adenoviren Lösung (bestätigt durch das Auftreten der ersten Lösung Tropfen von der Spitze der Nadel) gefüllt ist.
   Hinweis: Es dauert ungefähr 45 µL Lösung um die 30 G-Nadel, füllen so jetzt fast keine Lösung in die Spritze sichtbar ist.
8. Verwenden Sie die oben genannten vorbereitete Spritze, um eine weitere 30 µL Adenovirus Lösung sorgfältig abzusaugen, und die lose verschlossene Spritze auf Eis für eine spätere Verwendung.

(2) Anästhesie und Operative Vorbereitung

1. Fügen Sie 20 mL Isofluran in einem Verdampfer Isoflurane, und schließen Sie den Verdampfer Isoflurane an ein Sauerstoffgerät.
2. Öffnen Sie das Ventil und lassen Sie den Sauerstoff Flow aus der Sauerstofftank zum Verdampfer Isoflurane. Pflegen Sie die Sauerstoff-Durchflussmenge bei 2 L/min über ein Sauerstoff-Strömungswächter im Verdampfer Isoflurane.
3. Induzieren Sie Anästhesie der Maus mit 4 % Isofluran in 100 % Sauerstoff (2 L/min) für 2 min in einem Kunststoffkäfig verbunden zum Verdampfer Isoflurane.
4. Herausnehmen der narkotisierten Maus aus dem Kunststoff-Käfig, sichern Sie sie auf einer Kunststoff-Plattform in Bauchlage in einem Laminar-Flow sterile Haube und Anästhesie mit 2 % Isofluran in 100 % Sauerstoff (2 L/min) über eine Nase Kegel zu erhalten.
5. Bestätigen Sie ausreichende Anästhesie durch das Fehlen der Zehe Prise Antwort.
6. Eincremen Sie sterile ophthalmologischen für jedes Auge, die Hornhaut vor dem Austrocknen zu schützen.
7. Rasieren der Brust und Oberbauch. Handelsübliche Enthaarungscreme auf die rasierte Website beantragen, 1 min. entfernen die Enthaarungscreme und verbleibende Fell mit nassen Gazen.
8. Sterilisieren der Operationsstelle (linken unteren Teil der Brust) mit 3 Peelings von Jod-Chlorhexidin basierte antiseptisch (z.B. Entoiodine). Der Operationsstelle mit einem sterilen Tuch abdecken.

3. Intramyocardial Injektion von Adenovirus in Maus-Herz

1. Die Handschuhe ausziehen und ein neues Paar sterile Handschuhe anziehen.
2. Chirurgische Schere, Pinzette, ein Micro-Mosquito Gefäßklemme zu sterilisieren und Nadelhalter am Vortag Betrieb bei hoher Temperatur/hoher Druck Sterilisator (siehe Schritt 1.4 Hinweis).
3. Machen Sie einen 0,5 cm Hautschnitt entlang der Verbindungslinie der Xiphoid und Achselhöhle. Unverblümt sezieren Sie die Brust große und kleine Brustmuskeln mit Zange und ein Micro-Mosquito Gefäßklemme.
4. Setzen Sie die intercostalneuralgie Räume durch zurückziehen der Brust große und kleine Brustmuskeln. Durchbohren Sie und öffnen Sie den vierten intercostalneuralgie Raum (oder den breitesten intercostalneuralgie Raum durch Beobachtung) mit einem Micro-Mosquito Gefäßklemme.
5. Drücken Sie das Herz in Richtung der Schnitt, das Herz mit dem Zeigefinger der nichtdominanten Hand zu externalisieren, durch leichtes Drücken an der rechten Seite der Brustwand.
6. Externalisierte Herzen mit dem Zeigefinger und dem Daumen der nichtdominanten Hand sanft zu sichern.
7. Injizieren Sie insgesamt 30 µL Adenovirus-Lösung in das Myokard des linken Ventrikels an drei Standorten (ventral, dorsal und seitliche Wand des linken Ventrikels) über den Hamilton-Spritze gefüllt mit Adenoviren (Abbildung 1) mit der dominanten Hand.
8. Nach Abschluss der Injektion sofort platzieren Sie das Herz zurück in den Brustraum Raum.
9. Manuell zu evakuieren der Luft im Brustraum durch leichtes Drücken der Brustwand auf der Haut-Schnitt-Website.
   Hinweis: Erfolgreiche Luft Evakuierung kann nachgewiesen werden, von der Brust große und kleine Brustmuskeln, verursacht durch die ausgestoßene Luft flattern.
10. Schließen Sie die Haut durch horizontale Matratze Naht mit einer 5-0 Seide Naht.
    Hinweis: Die Brust große und kleine Brustmuskeln sollten nicht genäht werden weil sie nur unverblümt seziert sind und ihre anatomischen Strukturen intakt während der Operation sind.

4. die Nachbehandlung

1. Verwalten Sie Buprenorphin (3 mg/kg) zweimal täglich über subkutane Injektion, postoperativen Schmerzen für die ersten 48 Stunden nach Betrieb¹¹zu reduzieren.
2. Nach Operation sofort behalten Sie die Mäuse auf ein Heizkissen (37 ° C) bis vollständig erholt. Platzieren Sie die Maus zurück in den Käfig, nachdem es vollständig erholt.
3. Die benutzte Spritze Hamilton und 30 G Spritzennadel in einem hoher Temperatur/hoher Druck Sterilisator zu sterilisieren (siehe Schritt 1.4 Hinweis). Die sterilisierten 30 G Spritzennadel in einem Sharps Container zu sammeln.

5. in-Vivo Bildgebung zur Messung der kardialen Luciferase Ausdruck

1. Am 5. Tag nach der Injektion Adenovirus bereiten Sie eine frische Stammlösung von Luciferin bei 15 mg/mL in Dulbeccos Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (DPBS). Filtern Sie die Lösung durch einen 0,2 µm-Filter.
2. Intra peritoneally injizieren Sie die wach Mäuse mit dem Luciferin Lösung bei 150 mg/kg Körpergewicht.
3. Schalten Sie die imaging-System.
4. Nach automatischer Selbsttest der imaging-System, wählen Sie den bildgebenden Modus als "Leuchtende", und nehmen Sie folgende Einstellungen: Belichtung: Auto; Binning: 8; FStop: 1; Anregung: Block; Emission: offen.
5. 10 min nach der Injektion von Luciferin betäuben Sie die Mäuse durch Injektion Chloral Hydrate (300 mg/kg Körpergewicht). Bestätigen Sie ausreichende Anästhesie durch das Fehlen der Zehe Prise Antwort.
6. Sichern Sie die narkotisierten Mäuse auf einer beheizten bildgebenden Bühne in Bauchlage, mit der Brust auf die Kamera gerichtet.
7. Sammeln Sie Bilder (1 Bild für jede Maus) und quantifizieren Sie die Intensität der Signale durch Zeichnung identisch kreisförmige Messung Regionen von Interesse (ROI) um die Brust zu.
8. Nach der Sammlung von Bildern Opfern Sie die Mäuse zu und sammeln Sie das Gewebe zu, wie im folgenden Abschnitt beschrieben.

6. Ernte Gewebe

1. Pflegen Sie zu verschiedenen Zeitpunkten nach Virus Injektion (Abbildung 1 b) Anästhesie mit 2 % Isofluran über eine bugnase betäuben Sie die Mäuse mit 4 % Isofluran, und sichern Sie sie auf einer Kunststoff-Plattform in Bauchlage.
2. Machen Sie einen Mittellinie ventralen Einschnitt in den vorderen Hals. Aussetzen der Rechts gemeinsamen Halsschlagader durch zurückziehen der Omohyoid und sternocleidomastoideus-Muskeln.
3. Die Mäuse durch transecting direkt gemeinsame Halsschlagader und Entleeren das Blut zu opfern.
4. Machen Sie einen ventralen Mittellinie-Schnitt in den Bauch. Schneiden Sie die Rippen auf beiden Seiten des Brustkorbs entlang der Midclavicular Linie und Transekt das Zwerchfell.
5. Setzen Sie das Herz durch Anheben der Xiphoid. Finden Sie die Aorta ascendens zu und entfernen Sie vorsichtig das perivaskuläre Fettgewebe.
6. Cannulate der Aorta und doppelthebel das Herz mit einer 30 G-Nadel befestigt eine 1 mL Spritze gefüllt mit 0,5 mL 4 ° C-Phosphat-Pufferlösung (PBS) durchspülen.
7. Nach Perfusion Verbrauchsteuern Sie die Herzen, und teilen sie in der linken und rechten Ventrikel. Verbrauchsteuern Sie, Leber, Lunge und Milz.
8. Nach zwei Wäschen in kaltem PBS (4 ° C) Lagern Sie die gesammelten Gewebe separat in kryogenen Fläschchen in flüssigem Stickstoff.

7. Ermittlung der Proteinexpression

1. Bereiten Sie Homogenisierung Puffer durch Zugabe von Protease-Inhibitor-Cocktail in handelsüblichen Lyse Puffer in einem Verhältnis von 1: 100. Berechnen Sie das Gesamtvolumen, basierend auf der Anzahl der zu bearbeitenden Proben. Halten Sie den vorbereiteten Homogenisierung Puffer bei 4 ° C für eine spätere Verwendung.
2. Nehmen Sie das Gewebe aus dem flüssigen Stickstoff-Tank. Wiegen Sie das Gewebe auf Präzisions-Waage (ca. 60 mg für jedes Stück des Gewebes).
3. Übertragen Sie das Gewebe auf einen neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Fügen Sie sofort 200 µL Homogenisierung Puffer und vorgekühlte 1,5 mm Stahlkugeln (4 ° C) in den Microcentrifuge Schlauch.
4. Sichere Mikrozentrifugenröhrchen in vorgekühlte (4 ° C) Metall-Inhaber in eine automatische Gewebe Schleifmaschine und beginnen Homogenisierung durch Inbetriebnahme der Maschine mit den folgenden Einstellungen: Frequenz: 70 Hz; Zeit: 120 s.
5. Zentrifugieren Sie nach der Homogenisierung Homogenat (16.000 × g, 4 ° C), und übertragen Sie den überstand sorgfältig auf eine neue 1,5-mL-Tube mit einer 100 µL Pipette.
6. Fügen Sie laden Puffer-Lösung (5 X), das Protein Überstand bei einem Verhältnis von 1:4 und das Protein bei 100 ° C für 5 min zu denaturieren.
7. Die proteingehalte Ausdruck im Herzen und andere Organ Gewebe weiter durch Western-Blot Analyse (Vertreter, die Ergebnisse sind in Abbildung 2 und Abbildung 3gezeigt) überwacht gemäß dem Protokoll zuvor beschriebenen¹².

Ergebnisse

Das Experiment-Protokoll und einige der wichtigsten Schritte für die gemeldeten Methode sind in Abbildung 1dargestellt. 5 Tage nach Intramyocardial Injektion von Adenovirus Codierung Luciferase (Adv-Luc), angegeben in Vivo imaging im Adv-Luc injiziert Mäuse robuste Überexpression des Luciferase speziell im Herzen (Abbildung 2A, B), das war durch Western-Blot Analyse (Abbildung 2

Diskussion

Der vorliegende Bericht zeigt eine modifizierte Technik für die Intramyocardial Injektion von viralen Vektoren für kardiale Genmanipulation, die von einer Methode für die myokardiale Infarktbildung Induktion von Gao Et Al. geändert wurde ¹³ derzeit in Vivo Charakterisierung von spezifischen Genfunktionen in den meisten Fällen beinhalten die Erzeugung von Knockout oder Transgene Mäuse^3,14,15

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ausrüstungen
	Fengshi Animal Experimental  Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China)	FS-CJ-2F
Zentrifuge	Thermo Scientific (Waltham, USA)	75005282
Gewebeschleifmaschine	Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)	Scientz-48
Hochtemperatur-/Hochdrucksterilisator	Hirayama (Saitama, Japan)	HVE-50
Isofluran-Verdampfer	Matrix (Orchard Park, USA)	VIP3000
IVIS  Lumina III Bildgebungssystem	PerkinElmer (Waltham, USA)	CLS136334
Precision  Saldo	Sartorius (Gö ttingen, Deutschland)	28091873
Instrumente
Eppendorf Pipette (100 & micro; L)	Eppendorf (Westbury, USA)&	nbsp;
Eppendorf Pipette (10 & Mikro; L)	Eppendorf (Westbury, USA)&	nbsp;
Zange	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp.	JD4020
Hamilton-Spritze	Hamilton (Nevada, USA)	80501	Volumen 50 μ L
Mikro-Mücken-Hämostat	F.S.T (Foster City, USA)	13011-12	Gebogen, Spitzenbreite 1,3 mm
Nadelhalter	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)	J32110
Chirurgische Schere	F.S.T (Foster City, USA)	14002-12
1-ml-Spritze	WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China)
Materialien und Reagenzien
Anti-GAPDH-Antikörper	CST (Danvers,  USA)	#2118
Anti-Luciferase-Antikörper	Abcam (Cambridge, UK)	ab187340
Anti-Kaninchen-IgG	CST (Danvers,  USA)	#7074
Anti-VDR-Antikörper	Abcam (Cambridge, UK)	ab109234
Buprenorphin	Thermo Scientific (Waltham, USA)	PA175056
Chloralhydras	LingFeng Chemical (ShangHai, China)
Kryogene Fläschchen	Thermo Scientific (Waltham, USA)	375418	1,8 ml
Enthaarungscreme	Veet (Shanghai, China)
Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Gibco (Grand Island,  USA)	14040133
Entoiodine	LiKang (Shanghai, China)	310132
EP-Röhre	Sarstedt (Newton, USA)	PCR001
Filter	Millipore (Bedford, USA)		M
Isoflurane	Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China)
Luciferin	Promega (Madison, USA)	P1041
Lysepuffer für westliche	Blot Beyotime (Shanghai, China)	P0013J	Ohne Inhibitoren
Ophthalmic	cream Apex Laboratories ( Melbourne, Australien))
PBS	Gibco (Grand Island,  USA)	10010023
Proteasehemmer-Cocktail	Thermo Scientific (Waltham, USA)	78438
5-0 Seidennaht	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)
Stahlkugel	Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)		Breite 1,5 mm
Spritzennadel	Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China)		30 Gauge
Warme Matte	Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China )	NF-GNCW