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Methodenartikel

Mikro-Dissektion der Emaille-Orgel von Unterkiefer Schneidezahn von Ratten, Umweltgifte ausgesetzt

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DOI:

10.3791/57081

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29. März 2018

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1Institut National de la Santé et Recherche Médicale (INSERM) UMRS 1138, Paris-Diderot University, Pierre & Marie Curie University, Paris-Descartes University, Laboratory of Molecular Oral Pathophysiology, Cordeliers Research Centre, 2Unit of Formation and Research (UFR) of Odontology, Paris-Diderot University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Schmelz Bildung und mögliche Veränderungen zu verstehen, erfordert das Studium der Ameloblast Aktivität. Hier beschreiben wir eine zuverlässige und konsistente Methode, um Mikro-sezieren Emaille Organe mit Sekretion und Reifung-Bühne Fibrillen, die für die weitere quantitative und qualitative experimentelle Vorgehensweise verwendet werden können.

Zusammenfassung

Schmelz Mängel aufgrund von Umweltbedingungen und Lebensweisen sind öffentliche Gesundheit Bedenken wegen ihrer hohen Prävalenz. Diese Mängel ergeben sich durch veränderte Aktivität von Zellen verantwortlich für Emaille-Synthese genannt Fibrillen, die in Emaille Orgel präsentieren. Während Amelogenesis folgen Fibrillen eine spezifische und präzise Abfolge von Ereignissen der Proliferation, Differenzierung und Tod. Eine Ratte, die stetig wachsende Schneidezähne ist ein geeignetes experimentelles Modell Ameloblast Aktivität und Differenzierung Stufen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu studieren. Hier beschreiben wir eine zuverlässige und konsistente Methode, um Mikro-sezieren Emaille-Orgel von Ratten, Umweltgifte ausgesetzt. Die Mikro-seziert dental Epithelien enthalten Sekretion und Reifung-Bühne Fibrillen, die für qualitative Experimente wie Immunohistochemistry Assays und in Situ Hybridisierung, sowie für Quantitative Analysen wie verwendet werden kann RT-qPCR, RNA-Seq und westliche Beflecken.

Einleitung

Viele Entwicklungsstörungen Schmelz Mängel können Belastung durch Umweltgifte und/oder unangemessenen Lebensstil1,2,3,4ergeben. Charakterisierung der Störung Ereignisse und Moleküle der Amelogenesis mit dem derzeit beschriebenen Verfahren fördert die Nutzung der daraus resultierenden Schmelz Mängel als frühe Marker der Exposition gegenüber mehreren Schadstoffen und kann dazu beitragen, die Geschichte der Gesundheit wiederherzustellen jeder Patient während der Perinatalperiode Emaille dazu1,2 wird. Emaille-Synthese kann in vier Hauptphasen je nach Ameloblast Aktivität5unterteilt werden. Der erste Schritt enthält Vorläufer Zell- und Pre-Ameloblast Verbreitung. Im zweiten Schritt absondern differenzierte Fibrillen Emaille Matrixproteine (EMPs), vor allem Amelogenin, enamelin und Ameloblastin, die die Dicke der letzte Schmelz zu bestimmen. So führt eine Unterbrechung der EMP-Synthese auf quantitative Defekte des Zahnschmelzes. Nach der Absetzung der Dicke voller Schmelz beginnt die Reifung. Während dieser Phase kann Apatit-Kristallit-Wachstum in der Breite und Dicke den Schmelz, das höchste Mineralisierung Verhältnis gefunden in einem biologischen Gewebe, mit bis zu 96 % nach Gewicht zu erreichen. Störenden Ereignisse, die während der Reifung Bühne führen zu qualitativen auftreten Emaille Mängel. Schließlich Fibrillen in eine Phase der Post-Reifung, auch genannt Pigmentierung bei Nagetieren, eintreten und Apoptose während Zahndurchbruch machen Schmelz Mängel (falls vorhanden) nicht wieder gutzumachenden und unumkehrbar, defekte bieten somit potenzielle Retrospektive Erfassung der Ameloblast betont. Bei Nagetieren folgt Amelogenesis eine ähnliche Abfolge von Ereignissen mit der Besonderheit, die ihre Schneidezähne kontinuierlich wachsen, wodurch sie ein geeignetes Modell, den allgemeinen Prozess der Amelogenesis zu studieren. Somit entsteht eine Unterbrechung des Amelogenesis in Veränderungen der Emaille Qualität und/oder Quantität, je nach dem Zeitfenster des störenden Ereignisses. In diesem Sinne gezeigt Exposition gegenüber Dioxin, Blei und endokrine Störung Chemikalien (EDZ) wie Bisphenol A (BPA), Genistein und Vinclozolin, Emaille Hypomineralizations1,2,3 generieren ,6,7,8. Asymmetrische Weiße undurchsichtige Flecken wurden auf die Schneidezähne von Ratten ausgesetzt, eine niedrig dosierte BPA Dosis während der fetalen und den ersten Monat nach der Geburt1identifiziert. Diese Emaille-Mängel bei Ratten, und die menschlichen Molaren Schneidezahn Hypomineralization (MIH), teilen ähnliche klinische, strukturelle und biochemische Eigenschaften. MIH ist eine kürzlich beschriebenen Zahnschmelz Pathologie, für die bleibt der Ätiologie noch unklar9,10 trotz vielen ursächlichen Faktoren gewesen theoretisiert9,10,11 ,12.

Ein weiterer wichtiger Emaille Hypomineralization Pathologie auf Umweltfaktoren zurückzuführen ist Dentalfluorose (DF), die die Folge der übermäßigen Fluorid Absorption ist (> 0,1 mg/kg/Tag)13,14. Die Hauptquelle von Fluorid ist Trinkwasser, der entweder ergänzt oder natürlich mit Fluorid angereichert. Fluorid ist auch häufig verschrieben, um Karies zu verhindern, aber die prophylaktische Dosis beträgt nur 50 % niedriger als die giftigen ein (≤0.05 mg/kg/Tag). MIH und DF, zwei häufige Krankheiten, die infolge der Exposition gegenüber Umweltfaktoren, können Gemeinsamkeiten zu präsentieren, die durch die Potenzierung der Hypomineralizing Wirkung von Fluorid in Kombination mit anderen Schadstoffen wie EDZ2 gekennzeichnet werden müssen oder Amoxicillin15.

Mikro-Dissektion der Ratte Emaille Orgel mit Fibrillen in verschiedenen Differenzierung Phasen hilft um zu verstehen, den Wirkmechanismus von Molekülen Ameloblast Aktivität zu stören und dazu führen, dass Schmelz Mängel nach dem Zahndurchbruch diagnostiziert werden können. Das heißt, die Charakterisierung der Veränderungen der Emaille gen Ausdruck und Zahnschmelz Matrix Zusammensetzung durch Umweltgifte ermöglicht die Wiederherstellung der Geschichte der Exposition gegenüber Toxinen und erleichtert die Überwachung der ökologischen Sicherheit für öffentliche Gesundheit.

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Protokoll

Alle Versuchstiere in der vorliegenden Studie wurden in Übereinstimmung mit Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren vom französischen Ministerium für Landwirtschaft (A-75-06-12) beibehalten.

1. Tier Exposition gegenüber Toxinen

  1. Holen Sie vor der Durchführung dieses Protokolls der notwendigen institutionellen Genehmigung ein und achten Sie darauf, alle Tierpflege-Richtlinien entsprechen.
  2. Wenden Sie das Design der Forschungs-Protokoll, so dass die Verfassung der verschiedenen Versuchsgruppen um die Auswirkungen der Schutzmechanismus untersucht auf Ameloblast Sekretion Phase und die Ameloblast-Reifung-Phase zu testen. Hier wurden vier Gruppen von männlichen Wistar-Ratten je nach Gefährdung durch Fluorid (NaF) in Kombination oder nicht mit BPA (Abbildung 1A)2konstituiert. Alle Tiere wurden beobachtet und seziert am Tag 65 (Abbildung 1 b).

2. Präparation der Hemi-Mandibeln von erwachsenen Ratten

  1. Einschläfern Sie Ratten durch CO2 ersticken, optional gefolgt von Enthauptung auf den getrennten Kopf vom Rest des Körpers. Ratten, die CO2 für 5 min in eine eigene Box16aussetzen.
  2. Entfernen Sie die Haut von den unteren Lippen mit einem Skalpell #11 um einfachen Zugriff auf die unteren Schneidezähne zu bekommen.
  3. Mit dem gleichen Skalpell einen Einschnitt zwischen den beiden unteren Schneidezähne mit einem leichten Druck machen und der Unterkiefer wird in zwei Hälften aufgeteilt werden.
  4. Schneiden Sie das zeitliche mandibuläre Gelenk mit einem Skalpell, den Kiefer zu lösen, und halten Sie die Hemi-Unterkiefer mit einer feinen Pinzette.
  5. Schneiden Sie die umliegenden Weichteile mit einem Skalpell und entfernen Sie alle Muskeln, Sehnen und Bänder mit einem Schaber, bis die Knochen vollständig sauber ist.

3. Isolation der Schneidezahn17,18

  1. Rasieren Sie vorsichtig den Knochen indem man die Klinge parallel zur großen Längsachse der Schneidezahn ab. Starten Sie am knöchernen Kamm in der Nähe von den Spitzen der Schneidezahn (proximales Ende) bis zum Ende der Schneidezahn in der Nähe der zervikalen Schleife. Die Schnitt-Bewegung geht von der proximalen, distale Richtung.
  2. Machen Sie einen ersten Schnitt nach distal der zervikalen Schleife mit dem Skalpell zu entfernen die Gonion Hemi-Unterkiefer und Ausziehen der Schneidezahn leicht ohne Beschädigung der zervikalen Schleife oder der sekretorischen Phase der Fibrillen (rote Linie in der Abbildung 2) zu ermöglichen.
  3. Machen Sie einen zweiten Schnitt unterhalb der zweiten Molaren, und legen Sie das Skalpell zwischen den Knochen und der medialen Fläche der Schneidezahn. Wenn der basalen Knochen aufgehoben wird, der Schneidezahn nach außen zu drehen und zu Emaille vorsichtig ausziehen Organgewebe beeinträchtigen mit einer feinen Pinzette.

4. Mikro-Dissektion der Zahnschmelz-Organ unter binokularen Objektiv

  1. Tropfen Sie 200 µL der Saline Phosphatpuffer (1 X PBS) auf dem Schneidezahn mit einer Pipette. Die labiale Fläche nach oben nehmen Sie die Schneidezahn mit einer feinen Pinzette mit. Machen Sie ein Skalpell zwischen die farblose und die orangefarbenen Teile des Gewebes zu markieren. Dieses Zeichen entspricht den zugrunde liegenden weißen Fleck ist danach zu beobachten (Abbildung 2).
  2. Kratzen Sie mit einem Bagger oder gleichwertige Werkzeug der Zelloberfläche von der Skalpell-Marke auf der apikalen Ende entsprechend Sekretion Bühne (farblos) Fibrillen, und von der Skalpell-Marke an der Spitze der Schneidezahn für die Reifung Stufe (Orange) Fibrillen.
  3. Entsprechend der Übergangsphase, wie zuvor beschrieben192-mm-Gewebe zu entfernen. Öffnen Sie den Schneidezahn nicht während Emaille Orgel Dissektion zur Vermeidung von Kontaminationen durch das Mesenchym.
  4. Schneiden Sie die zervikale Schleife befindet sich unmittelbar am apikalen Teil der Schneidezahn (Abbildung 2) als zuvor beschriebenen20.
  5. In 10 % Formalin oder Lyse Lösung für weitere Untersuchungen (siehe Tabelle der Materialien) sammeln.

(5) Sammlung von getrennten Emaille Organ Gewebe für weitere Untersuchungen

  1. Fallen Sie 200 µL PBS 1 X Puffer auf die Schneidezähne.
  2. Trennen Sie mit einer Skalpellklinge #11 sorgfältig dental Epithelzellen allmählich im Puffer, separat für jede Stufe mit Hilfe der zuvor Skalpell-Marke.
  3. Legen Sie für Zelle RNA und Protein-Extraktionen das Gewebe in eine Lyse Lösung, die Gewinnung von Proteinen und RNAs ermöglicht (siehe Tabelle der Materialien).
    Hinweis: Bereiten Sie hochwertige RNAs durch Drehen des Gewebe-Baggers in der Röhre, und dann schleifen die Zellen bis eine homogene Mischung zu erhalten. Die Mischung ist bereit für RNA und Protein Extraktion des Verfahrens des Herstellers, die zuvor beschriebenen2,8,17Jahre alt war. In der Regel über 5-10 µg Gesamt RNAs und 150 µg Gesamt Proteine wurden für jede Zubereitung erhalten.
  4. Für histologische Analysen setzen Immunhistochemie (IHC) und in Situ Hybridisierung (ISH), die Zellschicht in 10 % Formalin für 2 h, dann bei 4 ° C mit 1 X PBS-Puffer-Speicher. Das Gewebe kann dann in Wachs/Paraffin oder Gewebe OCT für Gefrierschnitte eingebettet werden.
  5. EMP-Extraktionen dauern Sie die Schneidezahn mit einer feinen Pinzette. Nach einer kurzen Exposition gegenüber Luft (leichte Dehydrierung) ist ein weißer Fleck um den mittleren Teil der labiale Fläche der Schneidezahn sichtbar die Einleitung der Emaille-Mineralisierung darstellt. Dieser weiße Fleck entspricht Übergang- / frühen Reife-Phase der Fibrillen, also verwenden Sie es als ein Indikator für die Extraktion von EMPs21.

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Ergebnisse

Viele Mängel, Emaille, wie z. B. Dentalfluorose12,13, kann vor Umwelteinflüssen durch übermäßige Fluorid Absorption oder Emaille Hypomineralization ähnlich MIH aufgrund der Exposition gegenüber einigen EDZ-1, 7,22. Diese Entwicklungsstörungen Schmelz Mängel können experimentell auf Ratten (Abbildung 1)

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Diskussion

Veränderte Ameloblast Aktivität und/oder gestörten Ameloblast Proliferation, Differenzierung und Reifung Prozesse führen zu irreversiblen Schmelz Mängel und im Gegenzug, die Charakterisierung der Schmelz Mängel kann helfen entwickeln Verständnis für die geänderten Ameloblast Aktivität während Amelogenesis. So sind die Studien an isolierten Emaille Orgel Determinante, die pathologische Ereignisse führt zu defekten unabhängig ihrer Herkunft, Umwelt- oder genetische Schmelz aufzuklären.

Diese Tec...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Universität Paris-Diderot, der französische National Institute of Health und medizinische Forschung (INSERM) und das französische Institut für zahnärztliche Forschung (IFRO) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Bisphenol ASigma Aldrich, Saint Louis MO239658
Formalin 10%Sigma-Aldrich, Saint Louis, MOHT5012
Tri-ReagenzEuromedex, FrankreichTR118
RLT-PufferQiagen, Les Ulis, Frankreich74126RNeasy Protect Mini Kit
Androgenrezeptor-AntikörperSanta Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)sc-816polyklonaler Kaninchen-Antikörper
PBS 10xEUOMEDEXET330. A
Natriumfluorid (NaF)Sigma-Aldrich, Saint Louis, MOS-1504
paraplast reguläreLeica microsystems, Nanterre cedex,  Frankreich39601006im Textgewebe als was/parafin bezeichnet
OCTVWR, Fontenay-sous-Bois, Frankreich411243
Extra feine Bonner Schere - Gerade/8,5 cmPHYMEP , Paris, Frankreich14084-08
Griff für Skalpellklingen - 12,5 cmPHYMEP, Paris, Frankreich10035-12
Gebogene SkalpellklingePHYMEP , Paris, Frankreich10035-20
Präpariermesser - Feine/gerade SpitzePHYMEP , Paris, Frankreich10055-12
KreismesserPHYMEP, Paris, Frankreich10059-15
Skalpellklingen n° 11 Swann-MortonVWR, Fontenay-sous-Bois, Frankreich233-0024
binokulare LinseLeica biosystems, Nanterre cedex,  FrankreichMZFLIII

Referenzen

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