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Fraktionierung für Auflösung von löslichen und unlöslichen Huntingtin-Arten

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DOI:

10.3791/57082

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27. Februar 2018

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1Department of Psychiatry and Human Behavior, University of California Irvine, 2UCI MIND, University of California Irvine, 3Department of Neurobiology and Behavior, University of California Irvine, 4Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein Verfahren ist für die Fraktionierung von löslichen und unlöslichen mutierte Huntingtin Arten aus Maus Gehirn und Zelle Kultur beschrieben. Die beschriebene Methode eignet sich zur Charakterisierung und Quantifizierung des Huntingtin-Proteins Flussmittel und hilft bei der Analyse von Protein-Homöostase in der Pathogenese der Krankheit und in Anwesenheit von Störungen

Zusammenfassung

Die Anhäufung von fehlgefaltete Proteine ist zentral für Pathologie bei Chorea Huntington (HD) und vielen anderen neurodegenerativen Erkrankungen. Insbesondere eine pathologische Hauptmerkmal der Huntington-Krankheit ist die anomale Ansammlung von mutierten HTT (mHTT) Protein in hochmolekularen komplexe und intrazelluläre Einschlusskörperchen bestehend aus Fragmenten und andere Proteine. Herkömmliche Methoden zu messen und zu verstehen, dass die Beiträge der verschiedenen Formen der mHTT-haltige Aggregate Fluoreszenz-Mikroskopie, western-Blot Analyse und Filter enthalten trap Assays.

Die meisten dieser Methoden sind jedoch bestimmte Konformation, und können daher nicht die volle staatliche mHTT Protein Wandel aufgrund der komplexen Natur der aggregierten Löslichkeit und Auflösung lösen.

Für die Identifizierung der aggregierten mHTT und verschiedene modifizierte Formen und komplexe ist Trennung und Solubilisierung der zellulären Aggregate und Fragmente obligatorisch. Hier beschreiben wir eine Methode um zu isolieren und zu visualisieren, lösliche mHTT, Monomere, Oligomere, Fragmente und eine unlösliche hochmolekularen (HMW) angesammelt mHTT Arten. HMW mHTT tracks mit Fortschreiten der Erkrankung mit Maus Verhalten anzeigen entspricht, und hat durch bestimmte therapeutische Interventionen1nutzbringend moduliert wurden. Dieser Ansatz kann mit Mausgehirn, peripheren Geweben und Zellkulturen verwendet werden aber kann auf andere Modellsysteme oder Krankheit zusammenhängen angepasst werden.

Einleitung

Die Unterbrechung der Protein-Qualitätskontrolle-Netzwerke, die korrekte Faltung sicherstellen und Abbau von zellulären Proteinen ist wahrscheinlich im Zentrum Pathologie in der Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Chorea Huntington (HD) und anderen "Protein misfolding" 2,3-Störungen. Ein detailliertes Verständnis der Proteostase-Netzwerk-Komponenten und ihre Beiträge zur Pathologie sind daher entscheidend für verbesserte therapeutische Interventionen zu entwickeln. HD wird durch die abnorme Erweiterung des CAG-Wiederholung innerhalb des Huntington-Gens, wodurch eine erweiterte Strecke der Polyglutamines (PolyQ) im Huntingtin (HTT) Protein4verursacht. Konsequente zeichnet pathologischen HD Pathogenese sich der daraus resultierenden Fehlfaltung, Anhäufung und Aggregation von HTT in Regionen des Gehirns und in peripheren Geweben, die nachweislich in mehrfacher Hinsicht stören normale Zelle Homöostase und Funktion 5 , 6. während HTT drückt sich ubiquitär, mittelgroße bedornten Neuronen im Striatum sind selektiv anfällig und meist offen betroffenen mit bemerkenswerten kortikale Atrophie, die auch im Zusammenhang mit HD Pathogenese.

Die Bildung von Aggregaten des HTT in das Gehirn von Huntington-Patienten und Tiermodellen hat in der Regel als Proxy-Marker für die Progression der Erkrankung und Dominant-Negative Verstärkung der Funktion für mHTT7serviert. Obwohl die genauen Mechanismen, durch welche, die Protein misfolding und Aggregation mHTT-induzierten Toxizität beitragen können, unklar bleiben, ist die Bildung dieser Einschlüsse im Gehirn von Huntington-Patienten und verschiedenen Tiermodellen eine Invariante und unvermeidbare Funktion. Einschlüsse auftreten, besteht weitgehend aus angesammelten HTT-Fragmente mit der N-terminalen erweitert PolyQ, darauf hinweist, dass Proteolyse und Verarbeitung von Full-length HTT sowie Alternative Spleißen8,9 spielen kann eine wichtige Rolle in der Pathogenese der HD. N-terminale HTT Fragmente kann eine pathologische Form der HTT darstellen, die schnell zu aggregieren, Siedelinie, und beschleunigen oder propagieren die Aggregation Prozess10.

Das Vorhandensein dieser Einschlüsse korreliert jedoch nicht unbedingt mit HTT-induzierten Toxizität oder Zelle Tod11. HTT ist vorgeschlagen worden, eine Aggregation von einem löslichen Monomer durch lösliche Oligomere Arten und β-Sheet Fibrillen unlösliche Aggregate und Einschlüsse12durchlaufen. Diese verschiedenen Protein-Arten über standard biochemischen Assays zu lösen ist eine Herausforderung im Bereich aufgrund ihrer Stabilität in niedrig-Reinigungsmittel-Lyse Puffer und Schwierigkeiten bei der Visualisierung mit standard biochemischen Assays gewesen. Somit sind methodische Überlegungen entscheidend bei der Aufdeckung der Grad und die Muster der kumulierten und aggregierte mHTT.

Die hier vorgestellten Protokoll stellt eine Methode zum mehrere Zwischenprodukte der HTT, speziell die Bildung einer unlöslichen HMW HTT-Spezies zu visualisieren, die offenbar eng mit HD Pathogenese und Krankheit Fortschreiten1,13 verfolgen ,14. In der Lage, zu beheben und verfolgen Sie mehrere Arten von mHTT bietet Forschern eine biochemische Tool zur Pathogenese der Krankheit untersuchen und bewerten mögliche therapeutische Interventionen durch Modulation und Auswirkungen auf die Pathogenese der Krankheit.

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Protokoll

Tier-Ethik-Anweisung - Experimente wurden durchgeführt in strikter Übereinstimmung mit der Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren von den National Institutes of Health und einer genehmigten Tierversuche-Protokoll von der institutionellen Animal Care und Use Committee ( IACUC) an der University of California, Irvine, ein AAALAC akkreditierte Institution. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um die Leiden der Tiere zu minimieren.

1. Vorbereitung der Lyse Puffer

  1. Vorbereiten "Wasserlöslich" Lyse-Puffer (10 mM Tris pH 7.4, 1 % Triton X 100, 150 mM NaCl, 10 % Glycerin) und Sterilfilter durch 0,22 µm-Filter.
    1. Für eine funktionierende "Wasserlöslich" Lyse Puffer messen N-Ethylmaleimide (NEM) und gründlich lösen sich in 100 mM Phenylmethysulfonyl Fluorid (PMSF) aufgelöst in 100 % EtOH.
      Hinweis: Lysis Puffer-Hemmer: (i) 20 mM N-Ethylmaleimide (NEM); (Ii) 0,2 mM PMSF; (Iii) 1 mM Natrium Orthovanadate (Na3VO4); (iv) 1 µg/mL Leupeptin; (V) 1 µg/mL Aprotinin; (vi) 20 mM Natriumfluorid (NaF).
      Achtung: Tragen Sie eine Gesichtsmaske bei der Arbeit mit NEM im gesamten Protokoll. Lyse Puffer arbeiten muss frische, aktive Inhibitoren zu gewährleisten erfolgen.
    2. Für lösliche Lyse Puffer mit Protease-Inhibitoren, fügen Inhibitoren in der folgenden Reihenfolge: Natriumfluorid (NaF), Volumen mit kalten Lyse Puffer, Natrium Orthovanadate (Na3VO4), Aprotinin und Leupeptin.
  2. Für "Unlösbaren" Lyse Puffer Ergänzung zu 4 % SDS durch Zugabe von 500 µL 20 % SDS auf 2 mL "Lösliche" Lyse Puffer. Lassen Sie bei Raumtemperatur.
    Hinweis: SDS wird sich überstürzen, wenn bei 4 ° C aufbewahrt; Beachten Sie dies bei Raumtemp. Endgültige Lysis Puffer Zusammensetzung: 10 mM Tris (pH 7,4); 1 % Triton x-100; 150 mM NaCl; 10 % Glycerin; 4 % SDS (nur unlösliche).

(2) lösliche/unlösliche Fraktionierung Protokoll

Hinweis: Siehe Abbildung 1 für einen Schaltplan.

  1. Zwei Sätze von Rohren für jede Probe zu kennzeichnen: "Lösliche" und "Unlöslich."
  2. Fügen Sie X µL eiskalte arbeiten lösliche Lyse Puffer mit Protease-Inhibitoren (siehe 1.1.1) Gewebe ergänzt hinzu.
    Hinweis: X = Volumen variiert je nach Gewebe; Siehe Tabelle 1.
  3. Für die Maus Hirngewebe (d.h. Striatum) beschriftet Dounce langsam 30 Mal in Glas 1 mL Douncer und Pipettieren in "Unlöslich" Rohr (halten auf Eis).
    Hinweis: Seien Sie vorsichtig, nicht zu brechen Oberfläche der Flüssigkeit nach dem Start von Douncing, wie Luftblasen bilden und möglicherweise unvollständig Homogenisierung führen.
  4. Zellen (d.h., HeLa, HEK293T) Spülen Sie in Zellen einmal mit kalten, 1 X PBS. Entfernen Sie PBS und minimalem Volumen der Lyse Puffer auf Zellen anwenden und heben mit Zelle Schaber.
    Hinweis: Für über Zell-Linien, Zellen waren vergoldet 5 x 105 Zellen pro 6-well-Platte und Konfluenz in der Nähe von gewachsen. Man ist gut vergleichbar mit Volumen für Maus Striatum verwendet.
  5. Transfer Homogenat oder Zelle lysate in beschriftet, "Unlösbaren" Röhren und lyse auf Eis 1 h (Startuhr nach letzten Rohr verarbeitet wird).
    Hinweis: Für die Zelle Lysates genannte mehrmals Zelle Klumpen vor Beginn der Inkubation aufzubrechen. Vermeidung von Blasenbildung. Vortex Puls kurz jede Probe für 1 s auf halbem Weg durch Lyse.
  6. Zentrifugieren Sie Proben bei 4 ° C bei 15.000 x g für 20 Minuten.
  7. Überstand als "Lösliche" Bruch zu erholen.
    1. Entfernen Sie mit pipettieren, achten Sie darauf, Pellet/trübe Schicht zu stören, da dies den Bruchteil verunreinigen wird. Pipettieren löslichen Anteil in "Lösliche" mit der Bezeichnung Rohr. Halten Sie auf dem Eis.
  8. Waschen Sie nach jedem Waschen Pellet mit 500 µL Puffer lyse (x2) und Zentrifuge bei 4 ° C bei 15.000 x g für 5 min; Es ist okay, wenn einige der trübe Schicht ist aus pipettiert.
  9. Nach dem letzten Waschen entfernen Sie alle verbleibenden Waschpuffer verlassen nur das Gewebe Pellet.
    Hinweis: Ab diesem Zeitpunkt sind unlösliche Proben jetzt bei Zimmertemperatur aufzubewahren.
  10. Aufschwemmen Pellet mit X-µL-Lyse-Puffer mit 4 % SDS ergänzt (Lautstärke kann eingestellt werden, je nach Größe der Pellets; siehe Tabelle 1).
  11. Beschallen Sie jede Probe für 30 s bei Raumtemperatur mit einer Sonde Sonikator (125 Watt, 20 kHz, Puls, Amplitude 40 %, siehe Tabelle der Materialien).
  12. Kochen Sie Proben (rollende Kochen) für 30 min; Zentrifugieren Sie kurz (15 s) bei 6.000 x g, jede Probe nicht zu verlieren.
  13. DC (Reinigungsmittel kompatibel) Protein Assay durchzuführen (siehe Tabelle der Materialien) oder Lowry Protein Assay, Proteinkonzentration (empfohlen begann Verdünnungen von 1/5 der Probe im jeweiligen Lyse Puffer für die Zellkultur und 1/10 für Gewebe Lysates) zu messen.
    Hinweis: Proteinkonzentrationen müssen mit einen DC oder Lowry-Assay aufgrund der hohen Konzentration Waschmittel gelesen werden.
  14. Aliquoten Proben in 50 µL Batches, Frost-Tausalz-Probleme zu vermeiden.
    Hinweis: Protokoll kann hier vor weiteren biochemischen Analyse angehalten werden, indem Sie speichern beide Fraktionen bei-20 ° C.

3. Western-Blot und Quantifizierung

  1. Führen Sie westliche Flecken wie berichtet an anderer Stelle1,13 durch Verdünnung 30 µg Probe 1:1 im Ladepuffer (1.6 x laden Farbstoff, 1 x Reduzierung).
    Hinweis: 30 µg Protein pro angebrochene reicht jedoch für optimale Auflösung eingestellt werden. 3 - 8 % Tris-Acetat Poly-Acrylamid Gele sollten für den unlöslichen Anteil verwendet werden. 4 - 12 % Bis-Tris Gele sind für die löslichen Fraktion empfohlen.
  2. Proben (rollende Kochen) für 5 min. Zentrifuge kurz kochen (15 s) bei 6.000 x g Probe zu sammeln.
  3. Bruchteile von SDS-PAGE und western-Blot, laut Protokoll des Herstellers für reduzierte Proben zu analysieren.
    Hinweis: Unlösliche Fraktion löst am besten, wenn auf 0,45 µM Nitrozellulose-Membran übertragen. 0,45 oder 0,2 µM Nitrozellulose einsetzbar für die löslichen Fraktion, abhängig von der Größe des Proteins des Interesses. Einige Optimierungen sein für beste Übertragung der HMW Materialien erforderlich.
  4. Färben Sie Membran mit ganzen Protein Fleck (z. B.MEMcode, siehe die Tabelle der Materialien), Protein laden Effizienz zu visualisieren.
    Hinweis: Westliche Flecken können durch mittlere Pixel Intensität analysiert werden. Löslichen Brüche können zu einem Haus-halten Protein am besten geeignet für das experimentelle System normalisiert werden. Unlösliche Bruch als relative Protein Fülle wurde durch reversible Protein beflecken oder Histon 3 Normalisierung auf separaten Blot überprüft.

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Ergebnisse

Auflösung von löslichen und unlöslichen Zelle Lysates nach Fraktionierung kann mit westlichen Analyse und Filter Retardierung Assays (Abbildung 2) erkannt werden. Als Beispiel HEK293T Zellen wurden transfiziert mit Transfection Reagens (z.B. Lipofectamine 2000), mit HTT Exon 1 Codierung cDNA enthält 97 Glutamin wiederholt15 gefolgt von Poly Prolin reiche Region und durften diese Zellen Express für 44 h. Zellen behandelt wurden...

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Diskussion

Für die oben genannten Protokolle, konsistente und quantitative Ergebnisse zu gewährleisten sind einige Vorsichtsmaßnahmen erforderlich. Erstens mHTT in beiden Fraktionen bilden spontan Aggregate im Laufe der Zeit auf mehrere Einfrieren-Tau-Zyklen, insbesondere in hoher Konzentration. Es ist also entscheidend für Aliquote die Protein-Preps Einfrieren und Auftauen nur das benötigte Volumen vor dem Ausführen des Tests, wie im obigen Protokoll beschrieben. Wenn unlösliche Fraktion weiß Fällungsmittel beim Auftauen ergibt, k...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch das NIH (RO1-NS090390) unterstützt. Wir möchten auch danke Dr. Joan Steffanfor technische Hilfe und Diskussion während der Entwicklung des Assays.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
SterilfilterMilliporeSCGP505RESchraubverschluss, steriler Vakuumfilter
1 mL Tissue Grinder, DounceWheaton357538
SonicatorQsonicaModell Q125
DC Protein AssayBiorad5000111Vergleichbar mit Lowry Assay
Tris 1M PufferlösungAlfa AesarJ60636
Triton X-100FisherBP151-100
NaCl 5M LösungTeknovaS0251
GlycerinFisherBP229-1
20% SDS-LösungTeknovaS0295
N-EthylmaleimidSigmaE1271
PhenylmethylsulfonfluoridSigmaP7626Herstellung einer 100mM Stammlösung in 100% EtOH, lagern bei 4°; C
NatriumorthovanadatSigmaS65080,5 M Stammlösung in Wasser herstellen
LeupeptinSigmaL288410 mg/ml Stammlösung in Wasser
herstellen AprotininSigmaA115310 mg/ml Stammlösung in Wasser herstellen
NatriumfluoridSigmaS4504500 mM Stammlösung in Wasser
herstellen Anti-HTTMilliporeMAB5492Verwenden Sie 1:1000 für Western Blot, 1:500 für den Filterretardierungsassay
Anti-GAPDHNovus BiologicalsNB100-56875Verwenden Sie 1:1000 für löslichen Western Blot

Referenzen

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Huntingtin ProteinProteinfraktionierungTrennung von l slichen und unl slichen Fraktionenhohes MolekulargewichtWestern Blot AnalyseSDS PAGEProteinassayZelllyseZentrifugationBeschallung

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