Eine Prozedur wird vorgestellt, für die Umfaltung der dCACHE periplasmatischen Liganden-bindende Domäne von Campylobacter Jejuni Chemorezeptor Tlp3 Einschlusskörperchen und die Reinigung zu Milligramm-Mengen des Proteins führen.
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Methodenartikel
Methode für effiziente Umfaltung und Reinigung des Chemorezeptor-Liganden-bindende Domäne
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Identifizierung von natürlichen Liganden der Chemorezeptoren und strukturelle Untersuchungen zur Aufklärung der molekularen Grundlagen der Liganden Besonderheit kann durch die Produktion von Milligramm-Mengen rein, gefalteten Ligand verbindliche Domains erheblich erleichtert. Versuche heterologously periplasmatischen Ligand verbindliche Domänen der bakteriellen Chemorezeptoren in Escherichia coli (E. Coli) oft zum Ausdruck bringen, führen ihre Ausrichtung in Einschlusskörperchen. Hier ist eine Methode zur Proteingewinnung aus Einschlusskörperchen, die Umfaltung und Reinigung, mit den periplasmatischen dCACHE Liganden-bindende Domäne von Campylobacter Jejuni (C. Jejuni) Chemorezeptor Tlp3 als Beispiel vorgestellt. Der Ansatz beinhaltet Expression des Proteins des Interesses mit einem spaltbaren seiner6-Tag, Isolation und Harnstoff-vermittelten Lutensol von Einschlusskörperchen, Protein Umfaltung von Harnstoff Entleerung und Reinigung durch Affinitätschromatographie, gefolgt von Tag-Entfernung und Größe-Ausschluss-Chromatographie. Die kreisförmigen Dichroismus Spektroskopie wird verwendet, um die gefalteten Zustand des reinen Proteins zu bestätigen. Es hat sich gezeigt, dass dieses Protokoll in der Regel nützlich für die Produktion von Milligramm-Mengen dCACHE periplasmatischen Ligand verbindliche Domains von anderen bakteriellen Chemorezeptoren in eine lösliche und kristallisierbaren Form.
Einleitung
Chemotaxis und Motilität haben gezeigt, eine wichtige Rolle in der Pathogenese von Campylobacter Jejuni spielen, durch die Förderung der bakteriellen Besiedelung und Invasion der Host1,2,3. Chemotaxis ermöglicht Bakterien ein optimales Umfeld für Wachstum, Richtung, wie durch chemische Signale geführt. Dieser Prozess beinhaltet die Anerkennung der intrazellulären und Umwelt chemische Signale durch eine Reihe von Proteinen bezeichnet Chemorezeptoren oder Wandler-ähnliche Proteine (Tlps). Die meisten Chemorezeptoren sind Membran eingebettet Proteine mit einer extracyto....
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Protokoll
1. Ausdruck seiner6-Tlp3-LBD in E. Coli
- 150 mL sterile Luria-Bertani (LB) Brühe enthält 50 µg mL-1 Ampicillin mit BL21-Codon-Plus (DE3) zu impfen - RIPL Zellen umgewandelt mit der pET151/D-TOPO-Vektor für Ausdruck seiner6- Tlp3-LBD (Aminosäurereste 42-291), und inkubieren sie bei 37 ° C in einem Shaker (Umlaufbahn Durchmesser, 25 mm) mit 200 u/min über Nacht.
- Bereiten Sie sechs 2 L Erlenmeyerkolben mit 800 mL sterile LB Brühe und 50 µg mL-1 Ampicillin. Jede Flasche mit 20 mL der gewonnenen Schritt 1.1 über Nacht Kultur zu impfen. Inkubieren sie bei 37 ° C mit kontinuierlichen Schütteln bei 200 u/....
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Ergebnisse
Rekombinante Expression von seinen6-Tlp3-LBD in E. Coli Protein Ablagerung in Einschlusskörperchen führte. Der Ausdruck Ertrag aus 1 L der Bakterienkultur in Schritt 2.13 berechnete war etwa 100 mg seine6-Tlp3-LBD in Einschlusskörperchen hinterlegt. Das Protein isoliert Verfahren, hier beschrieben und dargestellt in Abbildung 1, besteht aus Aluminiumionen Einschlusskörperchen, Protein Umfaltung und Reinigung durch Affinitätschro.......
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Diskussion
Ein einfaches Verfahren für Ausdruck und Umfaltung von Einschlusskörperchen der periplasmatischen LBD der bakteriellen Chemorezeptor Tlp3 wird vorgestellt. Vorbereitung des reinen Proteins beinhaltet Überexpression des Gens Haustier-Plasmid-encoded in E. Coli, Reinigung und Lutensol Einschlusskörperchen, Umfaltung des denaturierten Proteins und dessen Reinigung durch die aufeinander folgenden Affinität und Größe-Ausschluss Chromatographie Schritte. Die Harnstoff-erleichtert Denaturierung und Verdünnung/Dialyse-v.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Danksagungen
Wir danken Yu C. Liu für seine frühen Arbeiten auf der Tlp3-LBD-Produktion. Mayra A. Machuca ist verpflichtet, Departamento Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS für ein Promotionsstipendium.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Trisbase | AMRESCO | 497 | |
| Natriumchlorid (NaCl) | MERK MILLIPORE | 1064041000 | |
| Ampicillin | G-BIOSCIENCES | A051-B | |
| Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) | MERCK | 52332 | |
| Triton x-100 | AMRESCO | 694 | |
| Isopropyl β-D-thiogalactosid (IPTG) | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | ||
| Harnstoff | AMRESCO | VWRC0568 | |
| Dithiothreitol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | C-1029 | |
| L-Argininmonohydrochlorid | SIGMA-ALDRICH | A5131 | |
| Reduziertes L-Glutathion | SIGMA-ALDRICH | G4251 | |
| Oxidiertes L-Glutathion | SIGMA-ALDRICH | G4376 | |
| Natriumphosphat zweibasisch (Na2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | 7558-79-4 | |
| Monobasisches Natriumphosphat (NaH2PO4) | SIGMA-ALDRICH | 10049-21-5 | |
| Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz-Dehydrat (EDTA) | AMRESCO | VWRC20302.260 | |
| Imidazol | SIGMA-ALDRICH | I2399 | |
| Glycerin | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | ||
| Nickelchlorid (NiCl2) | SIGMA-ALDRICH | 339350 | |
| Glycin | AMRESCO | VWRC0167 | |
| Natriumdodecylsulfat (SDS) | SIGMA-ALDRICH | L4509 | |
| Ungefärbte Proteinleiter, breit Messbereich (10-250 kDa) | NEW ENGLAND BIOLABS | P7703 | |
| Amicon Ultracel Zentrifugalkonzentrator (Millipore) | MERCK | UFC901096 | |
| 50 mL Falcon Schlauch | FALCON | BDAA352070 | |
| Dialyseschlauch | LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY | Dialyseschlauch | |
| Schlangenhaut | THERMO SCIENTIFIC | 68100 | |
| Vorverpackte HiTrap Chelat-HP-Säule | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 17-0408-01 | |
| EmulsiFlex-C5 Hochdruck-Homogenisator | AVESTIN | EmulsiFlex™ - C5 | |
| Peristaltikpumpe P-1 | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 18-1110-91 | |
| Superdex 200 HiLoad 26/60 Größenausschlusssäule | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | ||
| JASCO J-815 Spektropolarimeter | JASCO | J-815 |
Referenzen
- Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
- Josenhans, C., Suerbaum, S.
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Nachdrucke und Genehmigungen
