Dreidimensionale Darstellung und Analyse der Immunolabeled, geklärt menschlichen Plazenta Zotten vaskulärer Netzwerke

Summary

Diese Studie stellt ein Protokoll für die reversible Gewebe, clearing, Immunostaining, 3D-Darstellung und Analyse von vaskulären Netzwerken im menschlichen Plazenta Zotten Proben in der Größenordnung von 1 bis 2 mm³.

Abstract

Nährstoff- und Gas-Austausch zwischen Mutter und Fötus erfolgt an der Schnittstelle von der mütterlichen intervillous Blut und die riesigen Zotten engmaschiges Netz, aus denen sich ein Großteil der Parenchym der menschlichen Plazenta. Die distale Zotten Kapillarnetzes ist die Endstation der fetalen Blut-Versorgungsmaterial nach einigen Generationen der Verzweigung von Schiffen aus der Nabelschnur. Dieses Netzwerk hat einen zusammenhängenden zellulären Mantel, syncytial Trophoblast Sperrschicht, die verhindert, dass der fetalen Blut mischen und dem mütterlichen Blut in dem es ständig gebadet wird. Beleidigungen, die Integrität der plazentaren Kapillarnetzes auftretenden Störungen wie mütterlicher Diabetes, Bluthochdruck und Übergewicht, haben Konsequenzen dieser vorliegenden schwerwiegende gesundheitliche Risiken für den Fötus, Säugling und Erwachsenen. Um die strukturellen Auswirkungen diese Beleidigungen besser zu definieren, entwickelte ein Protokoll für diese Studie, die Kapillarnetzes Struktur in der Größenordnung von 1 bis 2 mm³ erfasst, wobei man seine topologischen Eigenschaften in ihrer ganzen Komplexität untersuchen kann. Um dies zu erreichen, werden Cluster von terminal Zotten aus Plazenta seziert und der Trophoblast-Schicht und die Kapillaren Gefäßendothelien sind Immunolabeled. Diese Proben werden dann geklärt, mit einem neuen Tuch clearing-Prozess, der es ermöglicht, konfokale Bild Stapeln bis Z-Tiefe von ~ 1 mm erwerben. Die dreidimensionale Darstellungen von diesen Stapeln dann verarbeitet und analysiert, um grundlegende Kapillarnetzes Maßnahmen wie Volumen, Anzahl der Kapillare Niederlassungen und Kapillare Verzweigungspunkte zu Ende, als Bestätigung der Eignung dieses Ansatzes für generieren engmaschiges Netz Charakterisierung.

Introduction

Unser Verständnis von der entwickelnden Plazenta und seine Krankheiten ist in hohem Maße begrenzt, räumliche Beziehungen zwischen benachbarten Zotten und enthaltenen Kapillaren histologischen Abschnitten abgeleitet abgeleitet. In dieser Studie haben wir dieses Problem angesprochen, durch die Entwicklung der Mittel, um dreidimensionale (3D) Darstellungen der menschlichen Plazenta Kapillare Netzwerke zu generieren, die für Analysen der Kapillare Netzwerk-Features (z. B. Verzweigungen, Festigkeit) geeignet sind. Zu diesem Zweck haben wir zusammengefasst, immunofluorescent Färbung mit zwei kommerzielle Gewebe Clearing-Produkte, Visikol-1 und Visikol-2 (im folgenden genannt als Lösung 1 und Lösung 2).

Die menschliche Plazenta ist einen riesigen Komplex von Blutgefäßen befindet sich an der Schnittstelle zwischen intervillous Blut der Mutter und den sich entwickelnden Fötus. Heraus aus ihrer Einfügung in die Chorion Platte erstreckt, verzweigt sich die Nabelschnur in ein Netz von Arterien und Venen, die zur Deckung die Chorion Oberfläche mit einem aufwendigen vaskuläre Netzwerk ramify. Ihre Enden dann nach unten in den innen- oder Tiefe der plazentaren Scheibe wo sie mehrere Generationen mehr Verzweigungen zu unterziehen und am Ende in die Klemme Zotten und ihre enthaltenen Kapillare Netzwerke, die Website für den Austausch von Gasen, Nährstoffe, eindringen und Stoffwechselerkrankungen Abfall zwischen fetalen und mütterlichen Blut.

Beleidigungen, die Plazenta Kapillarnetzes während der Entwicklung haben langfristige Folgen für die Gesundheit des Fötus, Neugeborenen und die emergent Erwachsene ^1,2,3. Im Hinblick auf Schwangerschaft zusammenhängenden Pathologien wie Fehlschlag, intrauterine Wachstumsretardierung, Präeklampsie und mütterlichen Diabetes ^4,5,6 gibt es ist ein hoher Wert gelegt auf die Entwicklung von Methoden zur Messung und Charakterisierung der Plazenta Zotten Kapillare Netzwerke. Ein großes Hindernis ist, dass die plazentale vaskuläre Netzwerken umfassen ein breites Spektrum der Skala. Die Oberfläche vaskulärer Netzwerke können so groß wie 4-5 mm im Durchmesser sein. Die terminal Zotten Kapillaren sind in der Größenordnung von 10 -20 µm im Durchmesser; die Plazenta enthält über 300 km Blutgefäße ⁷. Derzeit gibt es einige einfach zu bedienende und schnelle Techniken, die diesen extremen Schiff Skala erfasst werden können. Durch Mikroskopie kann bisher nur eine kleine Anzahl von Villi gerendert werden. Zum Beispiel fokussiert Jirkovska Et Al. die Plazenta Villus bei Laufzeit, kombiniert konfokale Mikroskopie mit optischen Schnittserien in 1 µm Abständen von 120 µm dicke Abschnitte erhalten; keine Angaben über die Zahl der untersuchten Proben noch Statistiken wurden ⁸. Kapillare Strukturen wurden identifiziert und Konturen der Zotten und Kapillaren waren handgezeichnete, mit Umzeichnungen zur Bildanalyse exportiert. Während die Autoren diskutieren die Folgen ihrer Erkenntnisse für das "wachsende Zotten vaskuläre Netzwerk", sind solche Schlussfolgerungen problematisch, wenn nur "Begriff" (36 + Woche Gestationsalter) Gewebe untersucht wird. In ähnlicher Weise Mayo et einl. und Pearce Et Al. stützte sich auf das Gewebe im gleichen Alter, für ihre Simulationen von Blut und Sauerstoff-Transfer, aber ihre Analysen beschränkten sich auf nur wenige Begriff terminal Zotten ^9,10 . Stereologie wurde auch auf die Studie der Struktur der Zotten Schiffe angewendet. Aber auch hier der Schwerpunkt wurde in der Regel auf spätere Schwangerschaften liefern Liveborn Säuglinge mit einem oder mehreren Schwangerschaft Komplikationen ^11,12.

Bis vor kurzem beschränkte konfokalen Mikroskopie, Bildgebung, Gewebe Tiefen von 100-200 µm wegen Absorption der Anregung und Emission der Fluoreszenz durch das darüber liegende Gewebe ¹³ . Wenn Gewebe clearing und 3D Histologie häufig in der Literatur beschrieben wurden und es gibt gibt zahlreiche Methoden für Gewebe löschen viele ungeeignet für die Verwendung mit Gewebe in der Regel irreversibel beschädigt werden zelluläre Morphologie durch die hyperhydration von Proteinen oder Entfernung von Lipiden. Daher ist es nicht möglich zu überprüfen, ob diese Ergebnisse bezeichnend für das Gewebe selbst und keine Artefakte sind aus der Verarbeitung unserer Gewebe clearing-Prozess eine reversible Technik ist, die gegen traditionelle Histologie überprüfen kann. Gewebe-Clearing beinhaltet in der Regel einer der drei wichtigsten Ansätze: 1) einheitliche Abgleich des Brechungsindex (RI) der Gewebeanteile durch Untertauchen in RI passende Lösungen, die die kumulative Lichtstreuung verursacht durch kontinuierlichen lensing entfernt Schwankungen des niedrigen RI (Zytosol) und hohe RI (Protein/Lipide) Bestandteile; (2) entfernen Lipidkomponenten durch Einbettung in Hydrogel und Nutzung von Elektrophorese/Diffusion Lipidkomponenten entfernen; (3) Ausbau/Denaturierung von Protein-Struktur zum verstärkten Eindringen von Lösungsmitteln Förderung der Einheitlichkeit der RI ¹³. Während dieser Ansätze können Gewebe transparent zu machen und für 3D-Darstellungen von Biomarkern generiert werden, sind diese 3D-Darstellungen von zweifelhaftem klinischen Wert, da es schwierig ist, festzustellen, ob diese Bilder bezeichnend für Gewebeeigenschaften sind oder des Gewebes clearing-Prozess. Auf der anderen Seite, da unsere Gewebe löschen rückgängig gemacht werden kann Standard histologischen und/oder Immunohistochemistry einsetzbar des gleichen Gewebes zu beurteilen, ob die Veränderungen klinisch bedeutsam sind.

Diese Studie enthält eine Analyse der 47 distalen Zotten Proben aus insgesamt 23 klinisch normal und wahlweise abgebrochene Schwangerschaften zwischen 9-23 abgeschlossener Wochen Schwangerschaft und zwei voll ausgetragenen normale Lieferungen. Immunfluoreszenz Kennzeichnung der Trophoblast und Gefäßendothelien ermöglichte eine quantitative und automatisierte Analyse der Veränderungen in den Zotten vaskulären Netzwerken und ihrer Komplexität.

Mit diesem Protokoll wir isoliert und analysiert zuvor terminal Zotten und ihre Kapillare Netzwerke auf einer Skala nicht möglich. Dieser Ansatz, wenn Zotten und Kapillare Netzentwicklung über Schwangerschaft angewendet werden diese Eigenschaften identifizieren, die die Grundlage für die Geburt eines gesunden Kindes sind. Bei Anwendung auf Studien von komplizierten Schwangerschaften wird es auch klären, wann und wie die plazentalen Pathologien zu ändern, die Zotten Bäume und die Kapillare Netzwerke, die sie Scheide und wie diese fetalen Wohlbefinden beeinträchtigen.

Protocol

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des New York State Institute for Basic Research in Developmental Disabilities Humanforschung Ethikkommission.

(1) Zotten Baum Dissektion

1. Spülen Sie Formalin fixiert Plazenta-Gewebe mit Phosphat poliert Kochsalzlösung (PBS)¹⁴ zu entfernen das Formalin und platzieren in einer Petrischale auf der Bühne eines Mikroskops Dissektion. Verwenden Sie Skalpell und feine Pinzette um das Plazenta-Gewebe auseinander zu necken, um Zotten Bäume (weiße fadenförmigen verzweigte Strukturen) zu finden. Sezieren Sie Stücke aus Villus Baum (mehrere mm lang) und übertragen Sie das Gewebe auf ein Micro-Schlauch mit ~ 1 mL PBS.

2. immunofluorescent Färbung

1. Entfernen Sie mit einer Pipette die PBS zu und ersetzen Sie durch frische PBS. Mit gelegentlichen wirbelnden 10 min. ruhen lassen. Wiederholen Sie noch einmal.
   Hinweis: Dieser Schritt und alle weiteren Schritte sind bei Raumtemperatur außer der primären Antikörper Inkubationszeit durchgeführt.
2. Mit einer Pipette, entfernen und ersetzen der PBS mit PBS + 0,1 % Triton-X100 + 2 % Ziegenserum (PBS-T-GS), um die Gewebe und Block unspezifische Bindung der Sekundärantikörper permeabilize. 30 min inkubieren.
3. Ersetzen Sie die PBS-T-GS mit PBS, enthält 2 % Ziegenserum, beide Maus monoklonalen Anti-CK7 und Kaninchen Anti-CK7.
   1. Gewebe über Nacht bei 4 ° c inkubieren
   2. Entfernen Sie die restlichen Antikörper durch Waschen mit PBS-GS für 10 Minuten mit gelegentlichen wirbeln.
   3. Die PBS-GS zu entfernen und ersetzen Sie durch PBS-GS mit beiden Ziege Anti-Maus IgG gepaart mit einer grünen emittierende (520 nm) Fluorophor und Ziege Anti-Kaninchen IgG gekoppelt, ein Infrarot-Emission (652 nm) Fluorophor.
   4. Entfernen Sie die Antikörper durch Wiederholung von Schritt 2.1.
   5. Speichern Sie das Immunolabeled Gewebe bei Raumtemperatur im Dunkeln.

3. Klärung des Gewebes

1. Waschen Sie die Proben mit PBS 3 Mal im 10 Minuten-Takt.
2. Das Gewebe zu entwässern, durch Entfernen der PBS mit einer Pipette und ersetzt es mit 50 % Ethanol (Methanol kann auch verwendet werden). Inkubation für 10 min. zu ersetzen, mit frischen 50 % Ethanol und inkubieren Sie für 10 min. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch einmal für eine Gesamtmenge von 3 Inkubationen. Wiederholen Sie die Inkubationen mit 70 %. Dann ersetzen Sie mit 100 % Ethanol und 15 Minuten lang inkubieren (Alternativ Methanol verwendet werden).
3. Mit einer feinen Spitze Pinzette übertragen Gewebe auf eine frische Micro-Schlauch mit ~ 1 mL Lösung 1 für 4 h.
4. Mit feinen Spitzen Pinzette übertragen Gewebe zu einem frischen Mikro-Rohr enthaltenden Lösung-2 für ~ 4 h.
   Hinweis: Bei Lagerung im Dunkeln ist die Immunfluoreszenz stabil bei Raumtemperatur für mindestens 6 Monate.
5. Verwechseln Sie nicht mit einer wässrigen Lösung (z.B. Eindeckmittel), wie die Lichtung gehen verloren.

4. Montage für die Mikroskopie

1. Montieren Sie das Gewebe zwischen einer standard-Glas-Folie und einem Deckgläschen nicht, wie das Gewebe weich und leicht verformt.
2. Siehe Abbildung 5B und das Gewebe in einer Sykes-Moore-Kammer wie folgt montieren;
   1. Legen Sie mit feinen Spitzen Pinzette ein 25 mm Runde Deckglas in der Kammer Basis.
   2. Legen Sie mit einer feinen Spitze Pinzette die Gummidichtung in der Basis auf dem Deckglas.
   3. Geben Sie mit einer Pipette einen Tropfen (~ 40 µL) Lösung-2 in der Mitte das Deckglas.
   4. Mit den feinen Spitzen Pinzette eine Stück Gewebe übertragen von Lösung 2 bis zum Tropfen in der Mitte das Deckglas.
   5. Legen Sie eine zweite Deckglas auf der Oberseite der Dichtung.
   6. Fädeln Sie den Sicherungsring in der Oberseite des Sockels komprimieren Deckgläsern und Dichtung bis Sie fest.
      Hinweis: Achten Sie darauf, nicht zu überdrehen oder das Deckglas zerbricht.
   7. 22-Gauge Nadel an einem Anschluss auf der Basis und durch die Dichtung.
   8. Füllen Sie eine 3-mL-Spritze mit ~ 1,5 mL der Lösung 2.
   9. Montieren Sie eine 25-Gauge-Nadel auf die Spritze.
   10. Legen Sie die Spritzennadel in den gegenüberliegenden Hafen und durch die Dichtung.
   11. Stellen Sie sicher, dass die Luft in der Kammer durch die anderen 25-Gauge-Nadel Entlüftung ist, sanft Lösung-2und Füllung der Kammer zu injizieren.
   12. Entfernen Sie die Nadel und Spritze und der Kammers auf ein großes Glas-Folie auf der Bühne confocal Mikroskop.
3. Alternativ schneiden Sie benutzerdefinierte Brunnen aus Silikon PDMS.
   1. Mit einer Schere schneiden ein 25,4 × 25,4 mm² Stück aus dem PDMS-Blatt.
   2. Mit einem Skalpell schneiden ~ 12,7 × 12,7 mm² auch im Stück.
   3. Drücken Sie das Stück fest auf einen Objektträger.
   4. Füllen Sie den Brunnen an die Spitze mit Lösung 2.
   5. Übertragen Sie das Stück Gewebe aus der Mikro-Tube in die Mitte des Brunnens.
   6. Legen Sie mit feinen Spitzen Pinzette ein Deckglas oben auf dem Brunnen, so dass der untere Teil des Deckglases benetzt mit Lösung 2 ist.
   7. Montieren Sie die Sykes Moore Kammerversammlung mit dem Gewebe auf der Bühne confocal Mikroskop.

5. der konfokalen Mikroskopie

1. Bringen Sie das Gewebe in der Kammer in den Fokus mit einem 10 X-Objektiv.
2. Bewegen Sie den Mikroskoptisch rauf und runter durch die Brennebene zum Messen des Abstands zwischen der Ober- und Unterseite des Gewebes.
3. Verschieben Sie die Phase in 2,5 µm Schritten eine konfokale Image-Datei enthält eine Reihe von Bildern durch das Gewebe von oben nach unten zu sammeln.

(6) Umkehrung der Lichtung

1. Umkehren der Lichtung des Gewebes auf eine Mikro-Rohr mit > 20 x das Volumen von 100 % Ethanol zu übertragen. 1 h ersetzen Intervalle mit 70 % Ethanol, danach 50 % Ethanol und PBS. Bei 4 ° C im Dunkeln lagern.
   Hinweis: Jetzt verarbeiten Sie das Gewebe für die Einbettung von standard Paraffin strukturierendes und histologischen oder Immuno-histochemische Färbung.

(7) Dekonvolution

Hinweis: Für die folgenden Schritte sind Software-Befehlen, Tabs und Drop-Down-Menüs kursiv gesetzt.

1. Starten Sie die Software Dekonvolution und öffnen Sie der Image-Datei zu.
2. Geben Sie im Fenster"Summary" aufgeführten Parameter.
   1. Für "Abstände geben Sie die Voxel x-, y- und Z-Dimensionen in µm.
   2. Wählen Sie für jeden Farbkanal der fluoreszierenden Farbstoffs für die Immunostaining aus dem Dropdown-Menü verwendet.
   3. Für die "Modalität", wählen Sie aus der Drop-Down-Menü konfokale Laser Scanning.
   4. Für die "Objektiv, 10 X aus der Drop-Down-Menü auswählen.
   5. Für die "Immersion Medium', Luft aus der Drop-Down-Menü auswählen.
   6. Klicken Sie auf die "anwenden" Taste.
3. Klicken Sie auf die Registerkarte"Deconvolution" ".
4. Klicken Sie auf '3D Dekonvolution " in der Drop-Down-Menü.
5. In der "3D - Dekonvolution" Fenster zu versichern, dass die Einstellungen sind: (1) Adaptive PSF Blind, 2) theoretische PSF, (3) Nutzung (Standard-Adaptive PSF, 10 Iterationen, mittlere Lärm), (4) Basis-Namen.
6. Klicken Sie auf die "grüne Häkchen" zum Starten des Programms.
7. Wenn Sie fertig sind, wiederholen Sie die Schritte 7,3-7.6 das Programm neu starten. Wenn Sie fertig zum dritten und letzten Mal neu starten.
8. In der "Data Manager" Fenster, klicken Sie auf die Datei, die mit dem Präfix "10-10 - 10-".
9. Klicken Sie auf die "Datei" Registerkarte, und klicken Sie auf "Speichern unter.
10. Wählen Sie im Fenster'Save As' '8-Bit-Ganzzahl ohne Vorzeichen " aus der"Datentyp " Drop-Down-Menü und klicken Sie auf speichern.

8. die Bildverarbeitung

1. Starten Sie Fidschi-Software.
   1. Klicken Sie auf "Datei", klicken Sie auf "offen" und wählen Sie die Deconvolved-Image-Datei und klicken Sie auf die "offen" Taste der "Open" Fenster.
   2. Klicken Sie auf "Bild/Farbe/Split Kanäle und konvertieren das dreifarbige Bild-Datei in drei neue Dateien, die nur eine Farbe enthält. Speichern Sie die roten Image-Datei, die die Immunolabeled Zotten Kapillare Bild enthält. Die grünen und blauen Image-Dateien zu löschen.
   3. Subtrahieren Sie die Hintergrundfluoreszenz aus der roten Bild-Datei mit: "Prozess/subtrahieren Hintergrund '.
   4. In der Drop-Down-Menü legen Sie Rolling Ball Radius 10 Pixel.
   5. Lassen Sie die 4 Menüoptionen deaktiviert und klicken Sie auf "" OK "".
   6. Klicken Sie auf 'Ja im Menü Prozess-Stack.
   7. Entfernen fester Gewebe Fluoreszenz (Autofluoreszenz) durch die Eröffnung der "Bild/anpassen/Helligkeit-Kontrast" Menü und die Minimum-, Maximum-, Helligkeit und Kontrast-Einstellungen anpassen. Achten Sie darauf, dass Sie nicht die Kapillare Immunfluoreszenz zu entfernen.
   8. Minimieren Sie verbleibende irrelevant Fluoreszenz durch die Eröffnung der "Bild/anpassen/Threshold" Menü und die Schiebereglern anpassen, so dass die Kapillare Immunfluoreszenz markiert ist. Überprüfen Sie die "dunklen Hintergrund" box und klicken Sie auf "anwenden '. Auf der "Konvertieren in binären Dropdown-Liste" Menü überprüfen die "schwarzen Hintergrund" box und klicken Sie auf "" OK "". Speichern Sie die schwarz / weiß (binär) Bild-Datei für Analysen unten.

9. Analyse

1. Objekt zu zählen und Skelettierung.
   1. Wählen Sie die binäre Image-Datei in Schritt 8.1.8 erstellt.
   2. Klicken Sie auf "Analyze/3D OC-Optionen und überprüfen Sie nur"Volume " und"Store führt... " Kästen in der Drop-Down-Menü. Versichern Sie, dass das Kontrollkästchen "Show-Nummern" deaktiviert ist. Klicken Sie auf die "" OK "" Schaltfläche ".
   3. CLIck auf "analysieren/3D Objekte Counter'. Legen Sie im Dropdown-Menü "Filter Größe: Min." bis 5000. Versichern, dass die "Objekte an den Rändern ausschließen -Box nicht aktiviert ist. Überprüfen Sie, dass die "ObjektsStatistik und"Zusammenfassung " Felder aktiviert. Klicken Sie auf die "" OK "" Taste.
      Hinweis: Dies kann je nach Größe und Computer Dateikonfiguration einige Minuten dauern.
   4. Der Statistiktabelle und Objekte-Map-Datei zu speichern.
   5. Wählen Sie die Objekte-Map-Datei. Klicken Sie auf "Plugins/Skelett/Skeletonize 2D-3D" , skeletonize Kapillarnetzes in der Binärdatei. Klicken Sie auf "Datei/speichern als. Wählen Sie "Tiff..." in der Drop-Down-Menü. In der speichern als TIFF-Fenster hinzufügen "Skel-" Objekt Karte Dateinamen und klicken Sie auf die "Speichern" Taste.
   6. Klicken Sie auf "analysieren/Skelett/analysieren Skelett 2D-3D". In der Drop-Down-Menü die Standardeinstellungen übernehmen, und klicken Sie auf die "" OK "" Taste. Speichern Sie die Verzweigung "Informationen" Tabelle, die " Ergebnistabelle und zwei Ausgabe-Dateien (Skel-Objekte-beschriftet - Skelette und Tagged Skelett).

Results

Die generierten 3D-Renderings der Kapillaren in Clustern von terminal Villi in menschlichen Plazenta von 8 Wochen gestational Alter Begriff Lieferung wurden als einzelne Cluster gezählt und skelettiert für Netzwerk-Analyse. Die Funktionseinheiten der Plazenta (Abb. 1A) sind die Villus Bäume, die eine Verlängerung der Überwasserschiffe sind, wo sie die Plazenta Parenchym (Abbildung 1Bund erweitert...

Discussion

Institutional Review Board genehmigt die Auflistung der Plazenta Zotten Gewebe für Formalin Fixierung von wahlweise abgebrochene Schwangerschaften. Bevor die Verfahren durchgeführt wurden, ein kurzer Überblick über die Krankenakte mütterliches Alter, Parität, festgestellt und bestätigt das Fehlen einer zugrunde liegenden medizinischen (z.B.Bluthochdruck, Diabetes und Lupus) oder fetalen (strukturelle oder chromosomalen Anomalien, abnorme Wachstum) wurde durchgeführt. Das Datenblatt und alle gesammelten Exemplare...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formaldehydlösung (w/v) in wässrigem Phosphatpuffer	Macron Fine Chemicals	H-121-08	Allgemeines Fixiermittel, gebrauchsfertige Formel, seien Sie vorsichtig, da Dämpfe giftig sind
Skalpellklingen	ThermoFisher Scientific	08-916-5B Nr. 11
Skalpell	ThermoFisher Scientific	08-913-5
Feinzange	Elektronenmikroskopie Dienstleistungen	78354-119
Mikroröhrchen (1,7 mL)	PGC Scientifics	505-201
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Sigma	D8537	PBS
Pipette	VWR	52947-948	Einweg, 3ml Transferpipette
Triton X-100	Boehriner Mannheim	789 704	Verdünnung auf 0,1% ab Lager
Ziegenserum	Gibco	16210-064	Verdünnen auf 2% in PBS-Lösung
Maus monoklonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Klon OV-TL 12/30)	ThermoFisher Scientific	MS-1352-RQ
Kaninchen Anti-CD31 Antikörper	Abcam	ab28364
grün emittierend (520 nm) Fluorochrom	Invitrogen	A11017	Alexa-Fluor 488
infrarotemittierendes (652 nm) Fluorochrom	Invitrogen	A21072	Alexa Fluor 633
Ethanolalkohol 200 proof	Pharmco-Aaper	111000200	Bedarf mit PBS auf niedrigere Konzentrationen verdünnen
Lösung-1	Visikol Inc.		Visikol Histo-1
Lösung-2	Visikol Inc.		Visikol Histo-2
Skyes-Moore-Kammern	BellCo Glass Inc.	P/N 1943-11111
25-Gauge-Nadel	ThermoFisher Scientific	14-826AA	BD Precision Glide Benötigt
3 mL	Spritze ThermoFisher Scientific	14-823-40	BD Einwegspritze
PDMS Silikonfolien	McMaster-Carr	P/N 578T31
Konfokalmikroskop	Nikon Inc.		Nikon C1 Konfokalmikroskop
Dekonvolutionssoftware	Media Cybernetics		AutoQuant X22
Fiji Bildbearbeitungssoftware			kostenlose, quelloffene Software erhältlich bei https://fiji.sc
Hämatoxylin	Leica Biosystems	3801570	Komponente 1 von SelecTech H& E Färbesystem
Alkoholisch Eosin	Leica Biosystems	3801615	Komponente 2 von SelecTech H& E Färbesystem
Blue Buffer	Leica Biosystems	3802918	Komponente 3 von SelecTech H& E Färbesystem
Aqua Define MCX	Leica Biosystems	3803598	Komponente 4 von SelecTech H& E-Färbesystem
Immunhistochemisches Detektionssystem	ThermoFisher Scientific	TL-125-QHD	UltraVision Quanto Detektionssystem HRP DAB