Isolation von dendritischen Zellen aus menschlichen weiblichen Fortpflanzungsorgane für phänotypische und funktionelle Studien

Zusammenfassung

Wir beschreiben hier eine Methode um zu isolieren und reinigen von dendritischen Zellen aus verschiedenen anatomischen Fächer in der menschlichen weiblichen Fortpflanzungsorgane für die Bewertung ihrer phänotypischen und funktionellen Eigenschaften. Diese Methode kann zu anderen Immunzellen oder dendritische Zellen aus anderen Schleimhaut-Gewebe isolieren angepasst werden.

Zusammenfassung

Die Charakterisierung der menschlichen dendritischen Zellen (DCs) Wohnsitz in Schleimhaut-Gewebe ist schwierig wegen der Schwierigkeiten bei der Beschaffung von Proben und die geringe Zahl von DCs pro Gewebe zu präsentieren. Doch wie der Phänotyp und die Funktion der DCs wird durch das Gewebe Umfeld geändert, ist es notwendig zu analysieren Gewebe Wohnbevölkerung DC, da Blut DCs nicht vollständig abgeleitet spiegeln die Komplexität des DCs in Geweben. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um DCs aus der menschlichen weiblichen Fortpflanzungsorgane (FRT) mit Hysterektomie zu isolieren, die phänotypische und funktionelle Analysen ermöglicht. Das Protokoll besteht aus Gewebe Verdauung um eine einzelne Zelle gemischt Zellsuspension, gefolgt von positive magnetische Bead Auswahl zu generieren. Unsere Gewebe-Verdauung-Protokoll wird nicht Oberflächenmarker, cleave, wodurch phänotypische und funktionelle Analyse der DCs in der Steady-State, ohne Übernachtung Inkubationszeit oder Zelle Aktivierung. Dieses Protokoll kann für die Isolierung von anderen Immunzellen Typen oder Isolierung von DCs aus anderen Geweben angepasst werden.

Einleitung

Die FRT hat die doppelte Funktion der Schutz gegen Krankheitserreger gleichzeitiger Implantation und Schwangerschaft¹. Um dies zu erreichen, ist die FRT mit jeder anatomischen Region anzeigen histologischen, immunologische und funktionalen Besonderheiten¹zersplittert.

DCs bei Schleimhaut-Oberflächen machen Kontakt mit Mikroben in der Lunge, Darm und Genitalbereich, und bieten Immunüberwachung für potenzielle Krankheitserreger². DCs haben die einzigartige Fähigkeit, prime naive T-Zellen und adaptive Immunantworten³auslösen. DCs in der FRT sind auc....

Protokoll

Nach den Grundsätzen, die in der Deklaration von Helsinki zum Ausdruck gebracht wurden Studien am Menschen durchgeführt. Studien wurden vom Dartmouth College Institutional Review Board und dem Ausschuss für den Schutz der menschlichen Themen (CPHS) genehmigt. Schriftliche Einwilligung war HIV-negativ Frauen Hysterektomien am Dartmouth Hitchcock Medical Center (Libanon, NH) vor der Operation entnommen. Ausgebildete Pathologen Gewebeproben aus der EM, CX und ECX, frei von pathologischen Läsionen und weit entfernt von den Stätten der Pathologie ausgewählt. Freiwilligen gesunden Spendern am Dartmouth Hitchcock Medical Center rekrutiert wurden Blutproben entnommen. Blutspe....

Ergebnisse

Folgende Gewebe Verdauung, die Freilassung von epithelialen Blätter und Drüsen kann beobachtet werden, wie in Figur 1Adargestellt; Dies ist eine positive Kontrolle, die angibt, dass die enzymatische Verdauung erfolgreich war. Die Anzahl der insgesamt vitaler Zellen und DCs pro Gramm Gewebe wiederhergestellt werden auch in Abbildung 1 b und Abbildung 1, bzw. angezeigt. Immunzellen sind zwischen 5-30 %.......

Diskussion

Schleimhaut DCs sind eine seltene Zellpopulation stark beeinflusst durch die Gewebe-Umgebung, die deren Phänotyp und Funktion ändert, sobald sie das Gewebe³geben Sie. Während Blut abgeleitet DCs sind ein sehr nützliches Modell, sie repräsentieren nicht voll die Vielfalt der DC-Populationen in Geweben gefunden. Deshalb, um die einzigartigen Eigenschaften der Schleimhaut DCs zu verstehen, ist Isolierung von Primärzellen von Gewebe notwendig. Isolierung von DCs von verschiedenen anatomischen Standort.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Hyclone	SH30015.03
Penicillin-Streptomycin-Hyclone		SV30010
HEPES (1M)	Hyclone	15630-080
Kollagenase IV	Sigma	C5138
Desoxyribonuklease I	Worthington Biochemisches	LS002140
D-Glukose	Sigma Aldritch	50-99-7
0,22 μm Stericup 500 mL  Filter	Millipore	SCGPU05RE
100 mm x 15 mm Petrischale aus Polystyrol	Fisherbrand	FB0875712
150 mm x 15 mm Petrischale aus Polystyrol	Fisherbrand	FB0875714
150 mm x 25 mm Polystyrolschale	Corning	430599	Behandelte Zellkulturschale
Isotemp Inkubator	Fisher Scientific	FICO3500TABB	5,0% CO2
American Rotator V	American DADE	R4140
250 um Nylonnetz	Sefar	03-250/50
20 um Nylonnetz	Sefar	03-20/14
Beckman GS-6R Zentrifuge	Beckman	358702
X-VIVO 15 mit Gentamicin L-Gln, Phenolrot, 1 l	Lonza	04-418Q
Human AB Serum	Valley Biomedical	HP1022
Histopaque-1077	Sigma Aldritch	10771
Phosphatpufferlösung (PBS)	National Diagnostics	CL-253	pH 7,4
Kit zur Entfernung toter Zellen	Miltenyi Biotec	130-090-101
Vorabscheidefilter (30 μm)	Miltenyi Biotec	130-041-407
LS-Säule	Miltenyi Biotec	130-042-410
Quadro MACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
MACS Multiständer	Miltenyi Biotec	130-042-303
EDTA	USB	15694
CD1a Mikrokügelchen, menschlich	Miltenyi Biotec	130-051-001
CD14 Mikrokügelchen, Mensch	Miltenyi Biotec	130-050-201
eFluor 670 Zellproliferationsfarbstoff	eBiosciences	65-0840-85
96 Vertiefung runde Bodenplatte	Falke	9/8/2866
Zombie gelber Lebensfähigkeitsfarbstoff	Biolegend	423104
CD3 APC/Cy7, Anti-Mensch	Tonbo Biosciences	25-0038-T100
CD4 PE, Anti-Human-EBiosciences		12-0048-42
CD8a FITC, Anti-Human-Tonbo	Biosciences	35-0086-T100
Gallios Durchflusszytometer	Beckman Coulter Life Sciences	B43618	10 Farben, VBR
MACSquant Analyzer 10	Miltenyi Biotec	130-096-343	8 Farben, VBR