Methodenartikel

Sezieren Signalisierung Multi-Protein-komplexe durch eine Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP)

DOI:

10.3791/57109

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15. Juni 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Kinghorn Cancer Centre, Garvan Institute of Medical Research, 2Ubiquitin Signaling Group, Protein Signaling Program, The Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 3RCSI Molecular Medicine, Royal College of Surgeons in Ireland, 4Department of Epigenetics, Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics, 5School of Medical Sciences, University of New South Wales, 6St Vincent's Hospital Clinical School, University of New South Wales, 7School of Medicine and Medical Science, University College Dublin

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Manuskript beschreibt das Protokoll für Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP). Diese neuartige Methode ermöglicht bestimmte Isolierung und Charakterisierung der nachgeschalteten Proteomic zwei interagierenden Proteine während ausgenommen un komplexiert einzelne Proteine sowie komplexe mit konkurrierenden Bindungspartner gebildet.

Zusammenfassung

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Die Montage von Proteinkomplexen ist ein zentraler Mechanismus zugrunde liegt die Regulierung der vielen Zelle Signalwege. Ein wichtiger Schwerpunkt der biomedizinischen Forschung ist entziffern, wie diese dynamische Proteinkomplexe handeln, um Signale aus mehreren Quellen um eine spezifische biologische Reaktion direkt zu integrieren, und wie dies in vielen Krankheit Einstellungen dereguliert wird. Trotz der Bedeutung dieses wichtigen biochemischen Mechanismus gibt es ein Mangel an experimentellen Techniken, die die spezifisch und sensitiv Dekonvolution dieser Multi-Molekulare Signalisierung komplexe erleichtern können.

Hier richtet sich dieses Manko durch die Kombination eines Protein-Ergänzung-Assays mit einer Konformation-spezifische gemeinnützige, die wir Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP) bezeichnet haben. Diese neuartige Technik ermöglicht die spezielle Isolierung und nachgelagerten Proteomic Charakterisierung jedes Paar von interagierenden Proteine, unter Ausschluss des un-komplexiert einzelne Proteine und komplexe mit konkurrierenden Bindungspartner gebildet.

BiCAP-Technik ist anpassungsfähig an eine breite Palette von nachgelagerten experimentelle Tests und der hohe Grad an Spezifität bot durch diese Technik ermöglicht mehr differenzierte Untersuchungen in die Mechanik der Protein komplexen Baugruppe als derzeit möglich ist mit Standard-Affinität Reinigungstechniken.

Einleitung

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Protein-komplexen Baugruppe ist ein Schlüsselprozess bei der Aufrechterhaltung der raumzeitlichen Spezifität von vielen Signalisierung Wege1,2. Während die kritische Natur dieser regulatorische Rolle allgemein anerkannt ist, gibt es ein Mangel an experimentellen Techniken zur Verfügung, um diese komplexe unter die Lupe nehmen. Die meisten phänotypische Studien konzentrieren sich auf Interaktionen mit einzelne Proteine oder die sequentielle Bereicherung einzelner komplexe Komponenten. Hier präsentieren wir eine Technik für die Isolierung von einem spezifischen Protein-Dimer, während mit Ausnahme der einzelnen Moieties Komponente Proteine sowie komplexe mit konkurrierenden verbindliche Partner3gebildet. Wir haben diese Technik namens Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP), es ist eine Kombination eines bereits vorhandenen Protein Fragment Komplementierung Assays, Bimolekulare Fluoreszenz-Ergänzung (BiFC), mit dem neuartigen Einsatz von einer Konformation-spezifische rekombinante gemeinnützige GFP und seine Derivate (siehe Table of Materials).

Ein typische Protein-Fragment Komplementierung Assay stützt sich auf den Ausdruck der "Köder" und "Beute" Proteine verschmolzen um Fragmente der Reporter wie Luciferase4, β-Galaktosidase5oder grün fluoreszierendes Protein (GFP)6 ( teilen Abbildung 1A). Durch das Zusammenspiel der Köder und Beute Proteine sollen die Split-Reporter-Domänen in eine funktionale Struktur, so dass die Interaktion des Köders Umfalten und Beute Proteine visualisiert oder quantifiziert werden. BiCAP wurde von einer Version dieser Technik, die aus der Fragmente der GFP Variante Venus verwenden. Fluoreszierendes Protein-Ergänzung-Assays sind eine beliebte Methode zur Visualisierung von Protein-Protein-Interaktionen in einer live-Zelle, aber bis jetzt wurden auf diese eine Funktion7beschränkt. BiCAP stellt einen bedeutenden Fortschritt in dieser Hinsicht, da diese Technik nicht nur zur Visualisierung, aber auch die Isolation und Verhöre der daraus resultierenden Protein-Protein Interaktion erlaubt.

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Abbildung 1: die strukturelle wichtigsten hinter die BiCAP Technik. (A) ein Schema skizziert die wichtigsten hinter Bimolekulare Fluoreszenz Ergänzung zeigt "bait" und "Beute" Proteine mit der N-terminalen V1 oder V2 C-terminale Fragmente des Full-Length Venus Proteins markiert. (B) strukturelle Analyse der Interaktion (Cyan) Schnittstelle zwischen der GFP gemeinnützige (grün) und rekombinierte Venus, welche die Position der (grau) V1 und V2 (orange) Fragmente (PDB Beitritt 3OGO). Diese Zahl ist neu veröffentlichte FromCroucher Et Al.3 Abdruck mit freundlicher Genehmigung von AAAS. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

BiCAP macht Technik verwenden zwei nicht fluoreszierenden Fragmente der Venus (benannt V1 und V2), die mit einem niedrigen Grad von Affinität zu verbinden, es sei denn, eine Interaktion zwischen ihrer Fusion Partner auftritt. In diesem Fall Einspritzen die beiden geteilten Domains in die funktionale β-Fass-Struktur der Fluorophor (Abbildung 1 b)6. Die entscheidende Neuerung des BiCAP stammt aus der Einführung des rekombinanten GFP-gemeinnützige, die eine dreidimensionale Epitop auf dem β-Fass GFP (und Varianten wie Venus) erkennt, die nur auf die korrekt rekombinierte und gefalteten Fluorophor ( vorhanden ist Abbildung 1 b)8. Entscheidend ist, bindet die GFP gemeinnützige nicht entweder die einzelnen Fragmente der Venus. Dies erleichtert die Isolierung von Proteinen Dimere erst, nachdem die beiden Proteine, einen Komplex aus eigenem Antrieb gebildet haben, führt zu mehr repräsentative Ergebnisse als die erworbenen aus Methoden, die machen von chemisch induzierten, erzwungene Interaktionen9verwenden.

BiCAP ist eine leistungsstarke Technik, die speziell auf Multi-Protein-komplexe, die potenziell können, mit einer Anzahl von downstream-Anwendungen kombiniert werden, die Granularität der unser Verständnis von der Rolle zu verbessern, die diese komplexe in der Signaltransduktion spielen . Es umfasst auch das wichtige Merkmal der Visualisierung von Protein-Interaktionen in Situermöglicht. Bis heute BiCAP als eine wirksame Methode zur Analyse der Interaktom von Rezeptor-Tyrosin-Kinase (RTK) Dimere3nachgewiesen, aber die Anpassungsfähigkeit dieser Methode bedeutet, dass es in fast jedem Protein Interaktion Kontext angenommen werden kann.

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Protokoll

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(1) Plasmid Klonen

Hinweis: Um Plasmid-Vektoren mit den V1 oder V2 Tags verschmolzen, der N-Terminus oder C-Terminus des Gens von Interesse zu erzeugen, BiFC Ziel Vektoren hinterlegt worden mit Addgene [N-Terminal-Tag: pDEST-V1-ORF (#73635), pDEST-V2-ORF (#73636). C-terminale Tag: pDEST-ORF-V1 (#73637), pDEST-ORF-V2 (#73638)]. Gen/s von Interesse müssen in bestimmten Rekombination Klonen kompatibel Eintrag Vektoren (z.B. pDONR223 oder pENTR221), ohne Stop-Codons, zum Klonen fortsetzen werden. Viele kompatible Klone sind bereits im Plasmid Sammlungen, darunter die Säugetier-Genom-Sammlung (https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/) verfügbar.

  1. Führen Sie eine Rekombination Reaktion um das Gen des Interesses zwischen den AttR-Standorten des entsprechenden Vektors BiFC Ziel einzufügen:
    1. Fügen Sie in ein 0,2 mL-Tube 150 ng Eintrag Vektor, 150 ng BiFC Ziel Vektor und 8 µL TE-Puffer (pH 8,0).
    2. Fügen Sie 2 µL Rekombinase Enzym-Mix (siehe Tabelle der Materialien). Gut mischen und kurz Zentrifugieren.
    3. Inkubieren Sie die Reaktion für 1 h bei Raumtemperatur oder bei 16 ° C über Nacht.
    4. Die Reaktion von 1 µL Proteinase K-Lösung und Inkubation bei 37 ° C für 10 min zu stoppen.
  2. Hitze-Schock-kompetente Zellen (siehe Tabelle der Materialien) mit der LR Reaktionsprodukt zu verwandeln:
    Hinweis: Jede grundlegende Belastung kann denkbar an dieser Stelle verwendet werden, solange es nicht die Ccdb Gegengift, enthält die die gezielte Auswahl der Plasmide, die mit dem Einsatz verhindern würde.
    1. Kompetente Zellen auf Eis Auftauen und 50 µL Zellen in ein 14 mL Runde Talsohle Polypropylen-Rohr übertragen.
    2. Die Zellen 1 µL Reaktionsprodukt hinzufügen und vorsichtig mischen. Inkubieren Sie für 20 min auf Eis.
    3. Erhitzen Sie Schock im Wasserbad 42 ° C für 45 s. sofort wieder für 2 min Eis.
    4. Fügen Sie 1 mL LB Medien und unter Schütteln bei 37 ° C für 1 h inkubieren.
    5. Die Transformation auf eine 10 cm-Agar-Platte mit Ampicillin-Platte (100 µg/mL) und über Nacht bei 37 ° C inkubieren.
  3. Reinigung von BiFC Plasmid.
    1. Plasmid aus einer einzelnen Kolonie zu reinigen, 100 mL LB Medien zu einem großen konischen Kolben und hinzufügen Ampicillin (100 µg/mL). Mehrere Kolonien auf dem Bildschirm, Runde Talsohle Polypropylenröhrchen 14 mL 5 mL LB Medien hinzufügen und fügen Sie Ampicillin (100 µg/mL).
    2. Mit einem sterilen Impfschlinge, nehmen Sie eine einzige Kolonie von der Agarplatte. Legen Sie die Impfschlinge in den LB Medien und kurz mixen.
    3. Decken Sie die Spitze der konischen Flasche mit Alu-Folie und Inkubation über Nacht bei 37 ° C mit schütteln.
    4. Transfektion Grade Plasmid DNA mit Hilfe einer standard Maxiprep oder Midiprep Plasmid DNA zu produzieren Reinigung kit (siehe Tabelle der Materialien)10. Qualität der DNA durch Absorption Spektren zu bewerten.
      Hinweis: Sollte DNA haben ein Verhältnis von A260/A280 > 1,8 und ein Verhältnis von A260/A230 > 2.0. An dieser Stelle empfiehlt es sich, mehrere einzelne Kolonien für effiziente Ausdruck einfügen und Tag überprüfen Bildschirm.

2. Handy-Kultur und Transfektion

Hinweis: Zur Transfektion der BiFC Vektoren ist es wichtig, eine hohe Effizienz und relativ homogene Transfektion zu erreichen. Die Vektoren werden wahrscheinlich mit jedem standard Transfection Reagens kompatibel, und die Transfektion Bedingungen sollten entsprechend optimiert werden. Zum Ausführen der Massenspektrometrie Kulturzellen wir in der Regel innerhalb von 10 cm Gerichte, obwohl dies auch proportional verkleinert werden kann, kleinere Gerichte oder Platten für Experimente, die weniger Material benötigen.

  1. 1.0 × 106 HEK293T Samenzellen in einer 10 cm Schüssel mit 10 mL DMEM Medien, ergänzt mit 10 % FBS und Penicillin/Streptomycin (1: 100).
  2. Verdünnen Sie 2,5 µg von jeder BiFC Vektor in 500 µL Puffer Transfektion (siehe Tabelle der Materialien) in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
  3. Fügen Sie 10 µL Transfection Reagens (siehe Tabelle der Materialien).
  4. Vortex-Mischung für 10 s, dann kurz Zentrifuge. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  5. Die Platte, tropfenweise die DNA Transfektion Mischung hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellen für eine ausreichende Zeitspanne für die BiFC Schmelzverfahren Proteine interagieren und Venus, die Falten und Fluorophor Reifung, in der Regel ca. 8-24 h.
    Hinweis: Die Peak-Anregung für Venus ist 515 nm und seiner Peak-Emission ist 528 nm, obwohl dies ohne weiteres angesehen wird, mit einem standard Leuchtstofflampen Mikroskop so eingerichtet, dass die GFP Fluoreszenz sichtbar zu machen.

3. die Probenvorbereitung

  1. Ernte von Lysaten
    1. Vor der lysate Entnahme vorbereiten Zelle Lysis Puffer [50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % (V/V) nichtionische Reinigungsmittel (siehe Tabelle der Materialien)]. Shop bei 4 ° C.
    2. Unmittelbar vor der Ernte, 10 mL von Zelle Lysis Puffer mit Protease-Inhibitor und Phosphatase-Inhibitor (siehe Tabelle der Materialien) zu ergänzen. Halten Sie ergänzt Zelle Lysis Puffer auf Eis.
    3. Waschen Sie Zellen in eiskaltem PBS zweimal. Aspirieren der PBS und 1 mL eiskaltes ergänzt Zelle Lysis Puffer. Legen Sie die Schale auf Eis, sicherzustellen, dass der Puffer über die gesamte Fläche verteilt ist.
    4. Inkubieren Sie für ca. 5 min auf Eis, dann verwenden Sie einen Zelle Schaber (siehe Tabelle der Materialien), die Zellen zu kratzen und zu einem vorgekühlt 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch übertragen.
    5. Entfernen Sie zelltrümmer durch Zentrifugieren der gesammelten lysate auf 18.000 × g für 5 min bei 4 ° C und Übertragung gelöscht überstand in frischen Mikrozentrifugenröhrchen.
      Hinweis: an dieser Stelle die lysate können sofort eingesetzt oder bei-80 ° c gelagert Es wird auch empfohlen, eine Aliquote von Rohöl lysate zu halten, damit die Effizienz der Transfektion und der Affinitätsreinigung validiert werden kann.
  2. Affinitätsreinigung
    Hinweis: Der BiCAP Isolierung Schritt erfolgt mit der GFP-gemeinnützige konjugiert, Agarose Korne (siehe Tabelle der Materialien).
    1. Bereiten Sie die Agarose-Perlen durch eine angemessene Lautstärke (20 µL pro Probe) + 10 µL überschüssige in 1 mL PBS waschen. Die Perlen bei 300 X g zentrifugieren und den überstand zu entfernen.
    2. Jede lysate Probe 20 µL hinzufügen.
    3. Inkubieren Sie die Proben für 2 h bei 4 ° C mit End-to-End-Rotation.
      Hinweis: an dieser Stelle können die Proben für die SDS-PAGE und westliche Beflecken oder Analyse durch Massenspektrometrie vorbereitet werden.
  3. Vorbereitung der BiCAP Fließmittel für das westliche Beflecken.
    1. Zentrifugieren Sie die Perlen bei 300 x g und waschen dreimal in Zelle Lysis Puffer.
    2. Aufschwemmen der gewaschenen Perlen in 50 µL Puffer entsprechend verdünnten Probe (siehe Tabelle der Materialien) und die Proben bei 95 ° C für ca. 2-3 min erwärmen.
      Hinweis: Proben vorbereitet auf diese Weise können für mehrere Monate bei-20 ° C gelagert werden.
    3. Durchführen Sie SDS-PAGE und Western Blot-11 für den Tag V1 und V2 Tags (siehe Tabelle der Materialien), als auch wie jede andere Proteine des Interesses.
  4. Vorbereitung der BiCAP Laufmittel für die Massenspektrometrie.
    Hinweis: Für die Analyse durch quantitative markierungsfreie Massenspektrometrie (LFQ), empfiehlt es sich die Vorbereitung der Proben in mindestens vierfacher um robuste statistische Aussagekraft zu gewährleisten.
    1. Zentrifugieren Sie die Perlen bei 300 x g und sechsmal unter Zelle Lysis Puffer ohne Reinigungsmittel reinigen. Dies ist notwendig, entfernen das überschüssige Protein und das Waschmittel, das Massenspektrometrie Analyse beeinträchtigen wird. Sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren Sie, oder speichern Sie die Perlen bei-80 ° C.
    2. Trypsinize Perlen in 60 µL Puffer 1 [2 M Harnstoff, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 µg/mL Trypsin]. Lassen Sie die Perlen für 30 min bei 27 ° C in einem Thermomixer bei 800 u/min schütteln zu verdauen.
    3. Kurz Zentrifugieren Sie Perlen, dann sammeln Sie überstand und Transfer zu Mikrozentrifugenröhrchen (siehe Tabelle der Materialien).
    4. Waschen Sie die Perlen in 25 µL Puffer 2 [2 M Harnstoff, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM Dithiothreitol], um die gebundenen Proteine zu reduzieren.
    5. Bündeln Sie die Perlen und überstand in einem Microcentrifuge Schlauch. Lassen Sie die Verdauung über Nacht bei Raumtemperatur erfolgen.
    6. Alkylat Proben von jeder Probe 20 µL des Iodoacetamide (5 mg/mL Reinstwasser) hinzufügen und in der Dunkelheit für 30 min inkubieren.
    7. Hemmen Sie Verdauung durch Behandlung von jeder Probe mit 1 µL Trifluoroacetic Säure (TFA). Dieser Schritt wird auch die Proben in Vorbereitung auf die Bühne Trinkgeld Ansäuern.
    8. Konstrukt C18 Bühne kippt durch Stapeln 6 Schichten von 1 mm Festphasenextraktion C18 (Octadecyl) Membran Festplatten (siehe Tabelle der Materialien) in 200 µL Mikropipette Tipp. Bereiten Sie einen einzigen Tipp für jede Probe.
    9. Nass die Bühne Tipps mit Methanol und equilibrate mit 50 µL 0,1 % (V/V) Trifluoroacetic Säure (TFA), 80 % (V/V) Acetonitril.
    10. Waschen Sie die Spitzen mit 50 µL 0,1 % (V/V) TFA.
    11. Die gesäuerte Peptide auf der Bühne-Tipps zu laden und dann eluieren mit 0,1 % (V/V) TFA, 80 % (V/V) Acetonitril in zwei Schritten.
    12. Die Proben unter Verwendung eines Vakuum-Konzentrators zu verdampfen.
    13. Bei Bedarf speichern Sie getrocknete Peptide bei-80 ° C.

4. Massenspektrometrie.

  1. Aufschwemmen Sie Proben in 15 µL 5 % Ameisensäure, 2 % Acetonitril (in Reinstwasser).
  2. Laden Sie sorgfältig 6 µL auf ein LC-Platte und Ort in einer NanoLC-HPLC-Anlage (siehe Tabelle der Materialien).
  3. Packen Sie ein 20 cm, 75 µM Innendurchmesser Spalte mit 1,9 µm C18 stationäre Phase Partikel (siehe Tabelle der Materialien). 5 µL Peptid auf jede Spalte zu laden.
  4. Eluieren Sie Peptide mit einem linearen Farbverlauf von Acetonitril bei 250 nL/min über 140 min und von Nanoelectrospray in einem linearen Falle Quadropole (LTQ) Hybrid Massenspektrometer gekoppelt an die NanoLC-HPLC-System einführen.
  5. Tandem-MS-Daten für die Top-10 am häufigsten vorkommenden Ionen pro Scan über einen 140-Minuten-Gradienten zu sammeln. Randomisieren Sie die Reihenfolge der Datenerhebung und den Austausch mit BSA verkehren zwischen jeder Probe, zeitliche Verzerrung zu minimieren.

5. Analyse

  1. Verarbeiten Sie MS-Rohdaten mit Standardeinstellung innerhalb von MaxQuant Software-Version 1.2.7.4 zu und analysieren Sie MaxQuant über modifizierte Version des Perseus-statistische Analyse-Workflows in der R-Software-Umgebung3ausgegeben.
    Hinweis: Die statistische Analyse Workflow ab diesem Zeitpunkt wird in Abbildung 2zusammengefasst. Kurz, LFQ Intensitäten von Proteinen identifiziert, mit MaxQuant verwandelt und gefolgt von Normalisierung und Zurechnung gefiltert. Interagierenden Proteine Dimer Paare sind im Vergleich zu ein Venus-Steuerelement auszuschließende unspezifischen Hintergrund Bindemittel, mit t-Test und Benjamini-Hochberg-Korrektur für multiple Vergleiche des Schülers gekennzeichnet. Die Datenqualität wird durch Vergleiche der einzelnen Histogramme, multiplen Regression und hierarchischen clustering bestätigt.

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Abbildung 2: Gliederung der statistischen Analyse-Workflows. Flussdiagramm der statistischen Analyse Pipeline zum Analysieren der LFQ Intensitäten von Proteinen aus rohen Massenspektrometrie Daten verarbeitet, mit MaxQuant identifiziert. Grüne Kisten: Filterung, blauen Kästen: Transformation/Normalisierung/Skalierung, braun Boxen: Daten-Qualitätskontrolle, gelb-Boxen: semi-quantitativen Ausgrenzung/vergleichende Analyse, graue Kästen: Statistische Analyse. Diese Zahl ist neu veröffentlichte FromCroucher Et Al.3 Abdruck mit freundlicher Genehmigung von AAAS. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Ergebnisse

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Nach dem Einsatz von Rekombination Klonen zum Generieren von V1 und V2 tagged Gene of Interest mit BiFC pDEST Plasmide, Co-Transfektion von zwei Plasmide mit Pair interagierenden Proteine führt bei der Erzeugung von ein Fluoreszenzsignal Venus nach ca. 8-24 Stunden. Bei fehlender ein positives Signal ist es möglich, dass die Protein-Interaktion durch die Wahl der Zelllinie nicht auftreten kann, ist eine niedrige Transfection Leistungsfähigkeit oder dass die Ausrichtung der BiFC Tags nicht...

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Diskussion

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BiCAP ist eine leistungsfähige Methode zur Isolierung von spezifischen Proteins Dimere beim Ausschließen der einzelnen Komponenten und ihre konkurrierende verbindliche Partner3. BiCAP basiert auf Anpassung eines Fluoreszenz Protein-Ergänzung Assays BiFC6genannt. Bestehende Methoden, einschließlich BiFC und Nähe Ligatur-Assays, zu visualisieren und zu quantifizieren, Protein-Interaktionen in lebenden Zellen7ausgiebig, aber kein wirksames Mittel zur Is...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben

Danksagungen

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D.R.C ist Krebs Institut NSW Fellow und D.N.S war zuvor Mitglied Cancer Institute New South Wales. Die Forschungsergebnisse präsentiert in dieser Handschrift wurden von Cancer Institute New South Wales (13/FRL/1-02 und 09/CDF/2-39), NHMRC (Project Grant GNT1052963), Science Foundation Ireland (11/SIRG/B2157), New South Wales Office of Science und medizinische Forschung, Gastfamilie finanziert. Gemeinschaft und Mostyn Family Foundation. Empfänger eines australischen Postgraduate Awards waren J.F.H. und R.S.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
LR Clonase II Plus EnzymThermo Fisher ScientificRekombinase-Enzym, das für die Gateway-Klonierung (Schritt 1) in pDEST BiFC-Zielvektoren erforderlich
ist Proteinase K, rekombinant, PCR-QualitätThermo Fisher ScientificEO0491
14 mL Polypropylen-Röhrchen mit rundem BodenCorning352059
AmpicillinRoche Diagnostics Deutschland10835242001Stammlösung hergestellt bei 100 μ; g/mL in destilliertem Wasser.
Miniprep KitPromega CorporationA1330
Maxiprep KitLife Technologies AustralienK2100-07
DMEMGibco11995-073
FBSLife Technologies Australien10099-141
Penicillin/StreptomycinLife Technologies Australien15070-063
jetPRIME TransfektionspufferPolyplus114-15
jetPRIME TransfektionsreagenzPolyplus114-15
PhosSTOP (Phosphatase-Inhibitor)Sigma-Aldrich4906837001
cOmplete, Mini, EDTA-freier Protease-Inhibitor-CocktailRoche11873580001
ZellschaberSarstedt83.1832
GFP-Trap_AChromotek Gmbhgta-100GFP-Nanobody gekoppelt an Agarosekügelchen
N-terminaler monoklonaler GFP-AntikörperCovanceMMS-118PDetektion des V1-Tags in den BiFC-Vektoren
C-terminaler monoklonaler GFP-AntikörperRoche11814460001Nachweis des V2-Tags in den BiFC-Vektoren Probenpuffer
InvitrogenNP0008Ergänzt mit 1 ml β-Mercaptoethanol.
Modifiziertes Trypsin in SequenzierungsqualitätPromega CorporationV5117h
LoBind MikrozentrifugenröhrchenPoint-of-Care Diagnostik0030 108 116
IodacetamidSigma-AldrichI1149-5GHergestellt mit 5 mg/ml in Reinstwasser
Trifluoressigsäure -Fisher 10628494
3M Empore Festphasenextraktion C18 Scheiben (Octadecyl) - 4,7 cmThermo Fisher14-386-2Zur Vorbereitung der Tischspitzen schneiden Sie 1 mm Scheiben mit einem entsprechend großen Locher. Alternativ können auch vorbereitete Etappentipps erworben werden, siehe unten.
C18 Tischspitzen, 10 & Mikro; L-BettThermo Fisher87782
Ameisensäure OPTIMA für LC/MS-Qualität 50 mLThermo FisherFSBA117-50
1,9 μ m C18 ReproSil PartikelDr. Maisch GmbHr119.aq.Teilchen der stationären Phase
Acetonitril OPTIMA LC/MS Qualität Thermo FisherFSBA955-4
Easy-nLC HPLC Thermo Fisher
LTQ Orbitrap Velos ProThermo Fisher
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Nichtionisches Reinigungsmittel (100%)
DH5&alpha-ZellenThermo FisherHitzeschock-kompetente
12538120 Thermo Zellen

Referenzen

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Zusammenbau von ProteinkomplexenProtein Protein InteraktionFluoreszenzkomplementationNanobody basierte ReinigungRezeptor TyrosinkinaseHEK293T ZelltransfektionKonfokalmikroskopische Bildgebungproteomische Charakterisierung

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