Methodenartikel

Getrocknete Blut und Serum Spots als ein nützliches Werkzeug für die Lagerung der Probe, Cancer Biomarkers zu bewerten

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DOI:

10.3791/57113

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11. Juni 2018

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1Osteoncology and Rare Tumors Center, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy, 2Unit of Biostatistics and Clinical Trials, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy, 3Biosciences Laboratory, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy, 4Department of Oncology, Bugando Medical Center, Mwanza, Tanzania

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und nützliche Methode zum Speichern von peripherem Blut und Serum/Plasma für nachgelagerte Analysen wie Einzel-Nukleotid Polymorphie (SNP) Bewertung und ELISA-Assay.

Zusammenfassung

Blut-Sample-Qualität ist entscheidend für genaue nachgeschalteten Analysen wie Real-Time PCR und ELISA zu gewährleisten. Richtige Lagerung von biologischen Materialien ist der Ausgangspunkt, reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Alle Proben sollten auf die gleiche Weise von Blutentnahme zur Lagerung behandelt werden. Je nach den Analysen durchgeführt werden sollten Vollblut und Serumproben bis zur Verwendung bei-20 ° C oder-80 ° C gelagert werden. Blut/Serum Proben sollte auch regelmäñig, mehrere Einfrieren Auftauen zu vermeiden. Ein weiteres wichtiges Thema ist die Probe Bedingungen während des Transportes von einem Labor zum anderen. Trockeneis ist nicht verfügbar, oder die Sendung dauert länger als ein paar Tage, sind alternative Ansätze erforderlich. Eine Option ist, Filterpapier für die Blutentnahme zu verwenden. Hier schlagen wir eine Methode für Blut und Serum-Sample-Sammlung, die nutzt getrocknete Blutflecken (DBS) und getrocknete Serum Flecken (DSS). Wir entwickelten das Verfahren, um durch Real-Time PCR DNA von DBS für die nachgelagerten Bewertung der einige Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) zu extrahieren. Wir haben auch einen ELISA-Test ab Proteine eluiert von DSS optimiert. Diese Methode kann mit anderen ELISA-Assays oder Verfahren, die Bewertung von Proteinen verwendet werden.

Einleitung

Das Hauptziel der Forschung in Krebs-Biomarker ist die Identifizierung neuer biologischer Parameter, die verwendet werden können, für die Diagnose und für Vorhersage Prognose der Patienten, für die Bestimmung, ob ein Patient auf eine bestimmte Behandlung ansprechen wird. Dieses Forschungsgebiet ist von grundlegender Bedeutung für die Entdeckung des innovativen Krebstherapien und spielt eine Schlüsselrolle in maßgeschneiderte Behandlung.

Bei jedem Schritt der Biomarker-Identifizierung und Validierung durchgeführten Verfahren müssen zuverlässig und reproduzierbar sein. Ein Eckpfeiler für den Erfolg der translationalen Forschung ist die korrekte Lagerung von biologischen Proben wie Blut und Serum. Dies ist der erste Schritt zur Gewinnung qualitativ hochwertige biologische Material, das verwendet werden kann, molekularbiologische Experimente oder Protein-Tests durchführen.

Multizentrische Studien sind oft erforderlich, um genügend Patienten um aussagekräftige Daten zu erhalten. Nicht alle Institute sind in der Lage, Proben bei-80 ° C zu speichern oder Proben zu anderen internationalen Zentren in Trockeneis zu senden. Die Verwendung von Filterpapier für die Blutentnahme ist eine einfache Methode zum Speichern von Blut und Serum und erfordert keine sofortige Einfrieren der Proben1,2. Ein Tropfen Blut oder Serum kann auf das Papier, verließ über Nacht trocknen und dann für bis zu 14 Tage bei Raumtemperatur1,2gespeichert gesichtet werden. So haben Forscher Zeit senden Sie die Proben an andere Laboratorien. Die Verwendung von getrocknetem Blut Flecken (DBS) und getrocknete Serum Flecken (DSS) könnte so vereinfachen Sie die Zusammenarbeit zwischen den Instituten in Industrie-und Entwicklungsländern.

Aufgrund seiner einfachen Handhabung, ist DBS Stichproben in verschiedenen Arten von Tests für serologische oder genetische nachgeschalteten Analysen weit verbreitet. Beispielsweise wurden in der Vergangenheit häufig DBS HIV-screening in Entwicklungsländern1,2,3,4,5verwendet. Ein weiterer Vorteil dieser Speichermethode ist, dass Finger-Schwänze, so dass seine Verwendung für Neugeborenen-screening Tests 6,7,8Blutproben entnommen werden können. Einfach Probe Handhabung und Transport sind weitere Vorteile des DBS, vor allem für Proben an remote-Standorten wo gibt es keine Laborgeräte. In einer früheren Publikation verwendeten wir DBS und DSS, um Vitamin D und Vitamin-D-bindendes Protein (DBP) in einer Reihe von kaukasischen und afrikanischen Patienten9zu testen. Unsere afrikanischen Kollegen konnten nicht Trockeneis zu erhalten. Um die biologische Marker zum Verständnis der Unterschiede in der Vitamin-D-Weg zwischen den zwei ethnischen Bevölkerungen zu vergleichen, haben wir das Verfahren mit übereinstimmenden Muster gespeichert unter Standardbedingungen und auf Filterpapier weiter optimiert. Nach der Optimierung des DBS/DSS-Verfahrens, konnten wir DBP und Vitamin D im Patientenserum in beiden Kohorten analysieren. Wir haben auch eine Reihe von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) nach der Extraktion der DNA aus Vollblut für Kaukasier und DBS für Afrikaner9. Dieses Protokoll ermöglicht qualitativ hochwertige Blutproben bei Raumtemperatur gelagert werden, ohne die verschiedenen Arten der nachgeschalteten Analysen von Molekularbiologie bis hin zu ELISA-Assays. Es wird empfohlen für den Einsatz an biologischen Materialien in multizentrischen Studien verwalten oder für die Zentren, die nicht über Einrichtungen für standard Lagerbedingungen. Das folgende Protokoll stellt den Höhepunkt dieser optimierten Verfahren.

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Protokoll

Peripherem Blut und Serum wurden gesammelt und gespeichert von gesunden Spendern und Patienten, die schriftliche Einwilligungserklärung, an der Studie teilzunehmen gab. Das Studienprotokoll wurde von der lokalen Ethik-Kommission im Einklang mit den ethischen Standards gemäß der Deklaration von Helsinki 1964 genehmigt.

(1) Blut Lagerung im DBS

  1. Blut-Musterkollektion
    1. Sammeln Sie 3 mL des peripheren Blutprobe in einer 3 mL-Tube mit 5,4 mg Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA).
      Hinweis: Bewahren Sie peripherem Blut als DBS so bald wie möglich und innerhalb von 8 h.
    2. Schreiben Sie die Patienten Code-Nummer auf der unteren rechten Ecke der Karte Bildschirmschoner.
    3. Vorsichtig das Blut mit einer 5-mL-Pipette aufzuwirbeln.
  2. Blut Flecken auf DBS
    1. Pipette und einen Blutfleck (50 µL) auf die Bildschirmschoner-Karte (Table of Materials) mit 50-200 µL Spitze zu übertragen.
    2. Wiederholen Sie Schritt 1.2.1. auf insgesamt 3 – 5 Blutpunkte haben. Entsorgen Sie die alte Spitze und nehmen Sie ein neues Kennwort für jedes Blut aliquoten.
    3. Lass die DBS über Nacht trocknen bei Raumtemperatur in einer horizontalen Position über eine offene nicht saugende Oberfläche, direkten Sonneneinstrahlung zu vermeiden. Lassen Sie die Abdeckung der Bildschirmschoner Karte geöffnet Blut trocknen zu erleichtern.
      Hinweis: Partikel in der Luft oder Staub während dieser Trocknung betrifft keine downstream-Anwendungen.
    4. Speichern Sie die Karte bei Raumtemperatur in einer Plastiktüte mit Trockenmittel bis zur Verwendung.

(2) DNA-Extraktion ab DBS gemäß DNA Extraktion Kit Datenblatt (Abschnitt für getrocknete Blutflecken)

  1. Vorbereitung der Probe
    1. 3 getrocknete Blutflecken von der Karte zu verwenden. Schneiden Sie jeder der getrockneten Blutflecken von der Karte und trennen Sie sie von der Karte mit einer Pinzette. Schneiden Sie die getrennten getrocknete Blutflecken in kleine Stücke (ca. 1 mm Durchmesser).
    2. Legen Sie die kleinen Stücke in einer 1,5 mL Zentrifugenröhrchen.
  2. Probe-Verdauung
    1. Fügen Sie 180 µL Lyse Puffer 1 im Kit (Table of Materials), um das Rohr zur Verfügung gestellt. Fügen Sie 20 µL Proteinase K. Nicht mischen Sie Lyse Puffer 1 vor mit Blut beschmutzt Karte in 1,5 mL Röhrchen Pipettieren mit Proteinase k. Durch Vortexen mischen.
    2. Legen Sie das Rohr in eine Thermoincubator und bei 56 ° C für 60 min inkubieren. Wenn die Thermoincubator nicht mit einem Shaker, Wirbel der Probe ausgestattet ist alle 10 – 15 min. für mindestens 10 s, kümmert sich nicht um die Temperatur der Probe verringern lassen. Zentrifugieren Sie kurz die Rohre zum Tropfen aus dem Deckel entfernen.
  3. Waschschritt
    1. Fügen Sie 200 µL der Lyse Puffer 2 (Table of Materials) und Wirbel für 10 s.
    2. Legen Sie die Rohre in einem Thermomixer oder beheizten orbital Inkubator und bei 70 ° C für 10 min inkubieren. Wenn die Thermoincubator nicht mit einem Shaker ausgestattet ist Wirbel die Proben einmal für mindestens 10 s, kümmert sich nicht um die Temperatur der Proben verringern lassen.
    3. Wiederholen Sie Schritt 2.3.1. Die 400 µL lysate von 1,5 mL-Tube auf Elution Spalte (Table of Materials) übertragen. Zentrifugieren Sie die Spalte bei 6.000 x g für 1 min.
    4. Setzen Sie die Elution Säule in eine neue 2 mL sammelröhrchen und entsorgen Sie die alte Version.
    5. Fügen Sie 500 µL Waschpuffer 1 (Table of Materials) und Zentrifuge bei 6.000 x g für 1 min.
    6. Legen Sie die Spalte in eine neue 2 mL sammelröhrchen und entsorgen Sie die alte Version.
    7. Fügen Sie 500 µL Waschpuffer 2 (Table of Materials) und Zentrifuge bei 6.000 x g für 1 min.
    8. Legen Sie die Spalte in eine neue 2 mL sammelröhrchen und entsorgen Sie die alte Version.
    9. Zentrifugieren Sie bei 20.000 x g für 3 min um die Membran zu trocknen.
  4. Elution Schritt
    1. Legen Sie die Spalte in eine neue 1,5 mL Zentrifugenröhrchen und verwerfen Sie dem Sammelrohr zu.
    2. Platz 50 µL destilliertes Wasser in die Mitte der Membran. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    3. Zentrifugieren Sie dem Rohr auf 20.000 X g für 1 min. sammeln das Eluat und legen Sie sie wieder in der Mitte der Membran.
    4. Zentrifuge das Rohr auf 20.000 X g für 1 min. verwerfen die Membran.
    5. Messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer.
    6. Shop-DNA bei-20 ° C bis zur Verwendung.
      Hinweis: Aus DBS extrahierte DNA lässt sich mehrere Analysen wie SNP Bewertung durch Real-Time PCR oder DNA-Sanger-Sequenzierung.

3. Serum-Speicher für DSS

  1. Blut-Musterkollektion
    1. 7 mL peripherem Blut Probe in einer 7 mL Tube ohne EDTA zu sammeln. Lassen Sie die Blutabnahme, für 30 min bei Raumtemperatur gerinnen.
    2. Schreiben Sie die Patienten Code-Nummer auf der unteren rechten Ecke der Karte Bildschirmschoner.
    3. Zentrifugieren der Blutprobe auf 980 X g für 15 min bei Raumtemperatur.
      Hinweis: Bewahren Sie Serum als DSS so bald wie möglich und innerhalb von 8 h.
    4. Sorgfältig entfernen des Überstands aus der Tube und überträgt es auf eine neue 15 mL Tube. Vorsichtig das Blut mit einer 5-mL-Pipette aufzuwirbeln.
  2. Serum Schmierblutungen in DSS
    1. Pipette und eins von Serum (50 µL) auf die Bildschirmschoner-Karte zu übertragen. Wiederholen Sie diesen Schritt, um eine Gesamtmenge von 3 – 5 Blutpunkte haben.
      Hinweis: Seien Sie vorsichtig, genau 50 µL Serum in jedem Fleck pipette. Serum sollte nicht über der gestrichelten Linie der Karte hinausgehen.
    2. Lassen Sie die DSS über Nacht bei Raumtemperatur trocknen. Lassen Sie die Abdeckung der Bildschirmschoner Karte geöffnet Blut trocknen zu erleichtern.
    3. Speichern Sie die Karte bei Raumtemperatur in einer Plastiktüte mit Trockenmittel bis zur Verwendung. Wenn der Speicher länger als 14 Tage ist, speichern Sie die Karte bei-20 ° C.

4. ELISA-Assay ausgehend von DSS

  1. Eluieren Sie Protein von DSS.
    1. Bei Bedarf tauen Sie ein DSS für jede Probe auf. DSS in kleine Stücke (ca. 1 mm im Durchmesser) schneiden. Setzen Sie die Stücke in ein 1,5 mL Röhrchen mit 400 µL PBS.
    2. Schütteln Sie die Proben über Nacht bei 4 ° C.
      Hinweis: Schütteln sie bei niedriger Intensität. PBS sollte die Abdeckung des Rohres beim Schütteln nicht nass werden.
  2. Verwenden Sie das Protein Eluat als einer Serumprobe für sekretierten Proteine/Wachstum Faktorenanalyse nach ELISA Kit Anweisungen, nach entsprechenden Verdünnungen.
    Hinweis: Dieses Verfahren funktioniert gut für DBP Erkennung9. Für andere ELISA-Assays kann ein Optimierungsschritt erforderlich sein.

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Ergebnisse

Wir nutzten die DBS und DSS Verfahren zum Speichern von Blut und Serum bei Raumtemperatur ohne dass die Qualität des biologischen Materials. Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für die Protein-Karte-Saver ohne Blut und nach der Blutentnahme. Um zu bestätigen, dass die Speicherung auf Filterpapier und das Verfahren zum Blut eluieren probenqualität nicht beeinträchtigen, haben wir einen Vergleich mit Standardspeicher Methoden durchgeführt. Wir extrahierten DNA aus 3...

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Diskussion

Dieses Protokoll untersucht das Potential für die Lagerung von Blut und Serum auf Filterpapier bei die Übungseinheiten keine Mitarbeiter oder Infrastrukturen benötigt für die korrekte Handhabung von Blutproben haben. Vor allem Vollblut oder Serum gesammelt in standard Röhren oder per Finger-stechen kann mit dieser Methode gespeichert werden und gibt es keine Notwendigkeit, sofort nach der Blutentnahme Proben bei-20 ° C oder-80 ° C eingefroren. DBS/DSS können bei Raumtemperatur bis zu 14 Tage lang ohne jede Änderung im Bl...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Danksagungen

Wir möchten Gráinne Tierney für redaktionelle Unterstützung bedanken.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Whatman Protein Sparkarten 903 Protein Sparkarte, 100/pk‎SigmaZ761575Nützlich für die Lagerung von Proben bei Raumtemperatur für nachgelagerte Analysen
Falcon Serologische Pipetten, 5 mLStammzell#38003
50-200 & Mikro; L-SpitzenStar-LabS1120-8810
1,5 mL ZentrifugenröhrchenEppendorf4036-3204
QIAamp DNA MicrokitQiagen56304Dies ist ein DNA-Extraktionskit, das für die Isolierung kleiner DNA-Mengen entwickelt wurde.  
Puffer ATL (im QIAamp DNA-Mikrokit enthalten)QiagenDies wird im Text als Lysepuffer 1 gemeldet
Puffer AL (im QIAamp DNA-Mikrokit enthalten)QiagenDies wird als Lysepuffer 2 im Text
QIAamp Mini-Eluspaltengemeldet QiagenDies wird als Spalte im Text
AW1  (im QIAamp DNA Microkit enthalten)QiagenDies wird als Waschpuffer 1 im Text
AW2  (im QIAamp DNA Microkit enthalten)QiagenDies wird als Waschpuffer 2 im Text
Human Vitamin D BP Quantikine ELISA KitR& D SystemeDVDBP0

Referenzen

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