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Methodenartikel

Ein experimentelles Modell der Diät-induzierten metabolischen Syndroms in der Kaninchen: methodische Überlegungen, Entwicklung und Bewertung

10.5K Ansichten

DOI:

10.3791/57117

20. April 2018

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Bei Kaninchen, die mit einer fettreichen, hohen Saccharose Diät beschreiben wir Methoden, um ein experimentelles Modell des Diät-induzierten metabolischen Syndroms (MetS) zu entwickeln. Tiere entwickelte zentrale Adipositas, milde Hypertonie, Prä-Diabetes und Dyslipidämie, damit die wichtigsten Komponenten des menschlichen MetS zu reproduzieren. Diese chronische Modell ermöglicht Erwerb von Wissen zugrunde liegenden Mechanismen der Progression der Erkrankung.

Zusammenfassung

In den letzten Jahren Adipositas und metabolischen Syndroms (MetS) ein wachsendes Problem für die öffentliche Gesundheit und klinischen Praxis, die aufgrund ihrer erhöhten Prävalenz durch den Anstieg der Bewegungsmangel und ungesunde Essgewohnheiten geworden. Dank Tiermodellen kann Grundlagenforschung die Mechanismen pathologischer Prozesse wie MetS untersuchen. Hier beschreiben wir die Methoden verwendet, um eine experimentelle Kaninchen Modell Diät-induzierten MetS und ihrer Bewertung zu entwickeln. Nach einer Zeit der Akklimatisierung sind Tiere eine fettreiche (10 % hydriertes Kokosnussöl und 5 % Fett), hoch-Saccharose (15 % Saccharose in Wasser aufgelöst) Ernährung für 28 Wochen gefüttert. Während dieser Zeit wurden mehrere experimentelle Verfahren durchgeführt, um die verschiedenen Komponenten des MetS zu bewerten: morphologische und Blutdruck-Messungen, Glukose-Toleranz-Bestimmung und die Analyse von mehreren Plasma-Markern. Am Ende der Probezeit, Tiere entwickelte zentrale Adipositas, milde Hypertonie, Prä-Diabetes und Dyslipidämie mit niedrigen HDL, hohen LDL und eine Erhöhung der Triglyzeride (TG) so reproduzieren die Hauptkomponenten des menschlichen MetS. Dieses chronische Modell ermöglicht neue Perspektiven für das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen in der Progression der Erkrankung, die Erkennung von präklinischen und klinischen Markern, die es ermöglichen die Identifizierung von Risikopatienten, oder auch das Testen von neuen therapeutischen Ansätze für die Behandlung dieser komplexen Pathologie.

Einleitung

Adipositas und metabolisches Syndrom (MetS) sind ein wachsendes Problem für die öffentliche Gesundheit und klinischen Praxis, die aufgrund ihrer erhöhten Prävalenz durch den Anstieg der Bewegungsmangel und ungesunde Ernährung Gewohnheiten1geworden. Es gibt mehrere Definitionen der MetS, aber die meisten von ihnen beschreiben wie ein Cluster von kardiovaskulären und metabolischen Veränderungen wie abdominale Adipositas, reduzierte HDL und erhöhten LDL-Cholesterin, erhöhte Triglyceride, Glukoseintoleranz und Bluthochdruck2 ,3,4. Die Diagnose erfordert, dass drei dieser fünf Kriterien vorhanden sind.

Aufgrund Tiermodellen konnte Grundlagenforschung untersuchen die Mechanismen pathologischer Prozesse wie MetS. Verschiedenen Tiermodellen verwendet worden, aber es ist von entscheidender Bedeutung, dass das Modell der Wahl die wichtigsten klinischen Manifestationen der menschlichen Pathologie (Abbildung 1) wiedergibt. Mit diesem Ziel worden betrachtet ähnlich wie Menschen, vor allem Hunde und Schweine, Tiermodelle entwickelt (siehe Verkest5 und Zhang & Lerman6 zur Überprüfung). Canine Modelle zeigen jedoch nicht alle Komponenten des MetS, angesichts der Tatsache, dass die Entwicklung von Atherosklerose oder Hyperglykämie bei Hunden durch die Ernährung fraglich5ist. Schweine-Modelle präsentieren die anatomischen und physiologische Ähnlichkeit mit den Menschen und bieten somit signifikante Vorhersagekraft für die Aufklärung der Mechanismen, die MetS, sondern deren Instandhaltung und die Komplexität der experimentellen Verfahren nutzen Dieses Modell sehr intensive und kostspielige6.

Auf der anderen Seite Nager-Modelle (Maus und Ratte), Diät-induzierten spontane und transgenen, ausgiebig benutzt worden in der Literatur für das Studium der Fettleibigkeit, Bluthochdruck, und MetS und deren pathologischen folgen in verschiedenen Organen und Systemen (siehe Wong Et al. 7 zur Überprüfung). Obwohl der Einsatz dieser Modelle günstiger als Hunde oder Schweine ist, haben sie wichtige Nachteile. In der Tat, abhängig von der Sorte Tiere entwickeln einige Komponenten der MetS, während andere wie Hypertonie, Hyperglykämie und Hyperinsulinämie abwesend7sind. Darüber hinaus eine der Hauptkomponenten des MetS, Fettleibigkeit, in einigen genetisch veränderten Stämmen hängt nicht nur Faktoren im Zusammenhang mit der Ernährung, vielmehr wurde nachgewiesen, dass einige Tiere mit normalen oder sogar weniger Nahrung Aufnahme8fettleibig werden. Zu guter Letzt Mäuse und Ratten zeigen einen natürliche Mangel in Cholesteryl-Ester-Transfer-Protein (CETP) und HDL zu verwenden, als die wichtigsten Transportmittel Cholesterin, wodurch sie relativ resistent gegen die Entwicklung von Atherosklerose. Dies ist ein wichtiger Unterschied im Fettstoffwechsel mit Menschen, die express CETP und transportieren ihre Cholesterin vor allem im LDL-9.

Umgekehrt stellt die Labor Kaninchen eine Zwischenstufe zwischen den größeren Tier- und Nager-experimentelle Modelle. Die Kaninchen können so leicht auf verschiedene Arten von Protokollen mit minimalen Anforderungen des Personals und Wartung, leichter als größere Tiermodelle in experimentellen Verfahren verarbeitet werden eingereicht werden. Darüber hinaus wurde berichtet, dass Kaninchen, die mit einer fettreichen Diät gefüttert ähnliche hämodynamische und neurohumoralen Veränderungen als übergewichtige Menschen8,10,11 haben. Der Hinweis auf Fettstoffwechsel die Kaninchen hat reichlich CETP im Plasma und profilieren Lipoprotein LDL-reichen12, auch ist ähnlich wie beim Menschen. Darüber hinaus entwickeln Kaninchen Hyperlipidämie recht schnell angesichts der Tatsache, dass als Pflanzenfresser, sie sehr empfindlich auf diätetische Fette13 sind.

figure-introduction-1
Abbildung 1: Vergleich der MetS Tiermodellen. Siehe Verkest5, Zhang und Lerman6und Wong Et al. 7 zur Überprüfung. "figure-introduction-2" zeigt einen Vorteil und "figure-introduction-3" zeigt einen Nachteil. *umstritten ist, richtet sich nach der Studie, *wie gesagt, von Carroll Et Al. 8, fettleibig einige gentechnisch veränderter Stämme unabhängig von der Nahrungsaufnahme. CEPT: Cholesteryl-Ester-Transfer-Protein. GTT: Glucose-Toleranz-Test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Um die grundlegenden Mechanismen der pathologischen Umbau produziert von MetS in den verschiedenen Organen und Systemen aufzuklären und zu dieser komplexen Pathologie, die Wahl der ein experimentelles Modell verstehen, das die wichtigsten Komponenten des reproduziert menschlichen MetS ist unerlässlich. Die Kaninchen bieten viele Vorteile aufgrund seiner Ähnlichkeit mit der menschlichen Physiologie und die Erschwinglichkeit von Einsatz in chronischen Protokolle und Messungen. In dieser Linie wurden einige Diät-induzierten Kaninchen-Modelle mit hohem Fettgehalt und hohem Saccharose Diät verwendet14,15,16,17,18,19 (Tabelle 1), und eine Charakterisierung der verschiedenen Komponenten des MetS ist von großer Bedeutung, wenn ein Phänotyp mit der Orgel Umgestaltung im Zusammenhang mit. Hauptziel dieses Artikels soll so beschreiben die Methoden, um ein Modell von Diät-induzierten MetS bei Kaninchen, die ermöglicht die Untersuchung von seiner Pathophysiologie und Auswirkungen in Orgel Umgestaltung zu entwickeln.

StudieErnährungDauerRasseMetS-Komponenten
ObHTHGDL
Yin Et Al. (2002)14·    10 % Fett24 Wochen·      Männliche NZWfigure-introduction-4-figure-introduction-5figure-introduction-6
·    37 % Saccharose·      2 kg
Zhao Et Al. (2007)15·    10 % Fett36 Wochen·      Männliche JWfigure-introduction-7figure-introduction-8figure-introduction-9figure-introduction-10
·    30 % Saccharose·      16 Wochen
Helfestein Et Al. (2011)16·    10 % Fett24 Wochen·      Männliche NZWfigure-introduction-11-figure-introduction-12figure-introduction-13
·    40 % Saccharose·      12 Wochen
·    0,5-0,1 Cholesterin
Ning Et Al. (2015)17·    10 % Fett8-16 Wochen·      Männliche WHHLfigure-introduction-14-figure-introduction-15figure-introduction-16
·    30 % Fruktose *·      12 Wochen
Liu Et Al. (2016)18·    10 % Fett48 Wochen·      Männliche NZWfigure-introduction-17-figure-introduction-18figure-introduction-19
·    30 % Saccharose·      12 Wochen
Arien-Mutis Et Al. (2017)19·    15 % Fett28 Wochen·      Männliche NZWfigure-introduction-20figure-introduction-21figure-introduction-22figure-introduction-23

Tabelle 1: Diät-induzierten MetS Kaninchen Modelle mit fettreichen, hohen Saccharose Diät. Das Symbol "figure-introduction-24"deutet auf fehlen,"figure-introduction-25" Präsenz, und "-" nicht ausgewertet. * eingeschränkt. WHHL, Watanabe erblich Hiperlipidemic Kaninchen. JW, japanische weiße Kaninchen. Ob, Adipositas. HT, Bluthochdruck. HG, Hyperglykämie. DL, Dyslipidämie.

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Protokoll

Tierpflege und experimentelle Protokolle, die in dieser Studie verwendeten EU Richtlinie 2010/63 über den Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere eingehalten, und wurden durch die institutionelle Tier Pflege und Use Committee (2015/VSC/Erbse/00049) genehmigt.

Hinweis: Das Protokoll besteht die chronische Verabreichung von einer fettreichen, hohen Saccharose Ernährung 28 Wochen und die Bewertung der wichtigsten Komponenten des MetS. Wir haben 11 erwachsenen männlichen New Zealand White (NZW) Kaninchen mit einem Gewicht von 4,39 ± 0,14 (s.d.) kg, 20-22 Wochen alt zu Beginn des experimentellen Protokolls waren. Sie wohnten in einem Zimmer mit Feuchtigkeit (50 ± 5 %) und kontrollierter Temperatur (20 ± 1,5 ° C) Bedingungen mit einem 12-h-Licht-Zyklus. Die Worte "Chow" und "Ernährung" können in der Protokoll-Schritte werden austauschbar.

1. Ernährung Verwaltung

  1. Zu erhalten oder bereiten Sie Diäten
    1. Besorgen Sie eine handelsübliche fettreiche Ernährung mit zusätzlichen hydriertes Kokosnussöl (10 %) und Schmalz (5 %)19. Diese Diät wird 3,7 Kcal·g-1bieten.
    2. Bereiten Sie 5 bis 15 % Saccharose-Lösungen durch Auflösen der entsprechenden Mengen an Saccharose in sterilisierten Wasser (z.B.Gebrauch 300 g Saccharose in 2 L Brühe für eine 15 % Saccharose-Lösung). Eine 15 % Lösung 0,6 Kcal·mL-1.
    3. Erhalten Sie eine handelsübliche Steuerung Diät19, die 2,7 Kcal·g-1bietet.
  2. Gewöhnen Sie die Tiere für 4 Wochen
    1. Jedes Futtermittel in der Kontrollgruppe 120 g Kontrolle Ernährung täglich. Bieten Sie Wasser Ad Libitum.
    2. Füttern Sie die Tiere in MetS Gruppe 250 g Chow, beginnend mit einer 50 %-ige Kontrolle und 50 % High-Fat Chow, schrittweise Erhöhung auf 100 % High-Fat Chow bis Ende der Woche 4.
      Hinweis: Das Ziel würde sein, dass: (i) Kontrolle von 35 % und 65 % High-Fat Chow bis Ende der Woche 1; (Ii) Kontrolle 25 % und 75 % High-Fat Chow bis Ende der Woche 2; (Iii) 15 % und 85 % High-Fat Chow bis Ende der Woche 3. (iv) 100 % High-Fat Chow bis Ende der Woche 4.
    3. Den Tieren in die MetS Gruppe Wasser mit 5 % Saccharose zu Beginn, und erhöhen Sie Saccharose-Konzentration auf 15 % bis Endeder Woche 4 zu.
    4. Registrieren Sie die tägliche Einnahme von Chow und Saccharose Lösung Kalorienzufuhr entsprechend in 1.1.1 angegebenen Werte zu berechnen. und 1.1.2.
  3. Induzieren Sie MetS (28 Wochen)
    1. Jedes Futtermittel in Kontrollgruppe 120 g des Steuerelements Chow und Wasser Ad Libitum täglich.
    2. Füttern Sie die Tiere in der MetS Gruppe 250 g von fettreichen Chow und 15 % Saccharose in Wasser. Ersetzen Sie täglich Chow und die Saccharoselösung jeden dritten Tag.
    3. Wiegen Sie die verbleibenden Chow und Wasser täglich, Tagesdosis zu schätzen.

2. morphologische Beurteilung

  1. Tierische Körpergewicht auf einer wöchentlichen Basis zu messen.
  2. Messen Sie Höhe, Länge, Abdominal-Konturund tibiale Längeund schätzen Sie BMI vor der Verabreichung der experimentellen Ernährung und in den Wochen 14 und 28 bei narkotisierten Tieren.
    1. Cannulate rechtes Ohr marginal Vene mit einem sterilen Einweg-Katheter (18-22 G) und Propofol (8 Mgkg-1) gefolgt von 1,5 mL 0,9 % NaCl-Lösung zu injizieren. Führen Sie bei anästhesierten Kaninchen die Messungen in den nachfolgenden Schritten aufgeführt.
    2. Maß Höhe und Länge. Maßband, Maßnahme und Aufzeichnung der Abstand von der Nase bis zur Ferse verwenden in seitlichen Dekubitus Position (Länge). Nehmen Sie in der gleichen Position die Entfernung aus dem schulterdach in der Schulter bis zur Spitze der Pfote (Höhe).
    3. Berechnen der Body-mass-Index (BMI)20 als Körpergewicht (kg) · [Länge (m) x Körpergröße (m)] -1.
    4. Legen Sie das Maßband sanft um die Abdominal-Kontur und nehmen Sie eine Messung mit dem Tier in Rückenlage.
    5. Messen Sie tibiale Länge aus dem unteren Teil des Kniegelenks, die Einfügung der Achillessehne.

3. Fasten Glycemia und intravenösen Glukosetoleranztest (IVGTT)

Hinweis: Es ist ratsam, um die Verfahren der gleichen Tageszeit (d.h. 2-15:00).

  1. Bereiten Sie eine Glukose-Stammlösung (60 %) mit 60 g Glucose in 100 mL 0,9 % NaCl-Lösung.
  2. Schnell das Tier für 7 h (Entfernen von Nahrung und Pflege Wasser), dann legen Sie die bewusste Kaninchen in eine einschränkende in Bauchlage. Blutzuckermessgerät (legen Sie einen neuen Streifen in das Messgerät) vorzubereiten, und die erste Probe von der linken Ohr marginal Vene mit einer Lanzette um einen Tropfen Blut zu bekommen. Berühren Sie dann die Blutstropfen mit der Test-Streifen und Maßnahme Blutzuckerwerte mit dem Blutzuckermessgerät Fasten Glycemia bestimmen.
  3. Cannulate rechtes Ohr marginal Vene mit einem Einweg-Katheter (18-22 G) und injizieren einen Bolus von einer 60 % Glukoselösung (0,6 G·kg-1).
    Hinweis: Um den Bolus vorzubereiten, fügen Sie 1 mL/kg Glukose-Lager.
  4. Nehmen Sie Blutproben mit der Lanzette (ein Tropfen Blut) auf 15, 30, 60, 90, 120 und 180 min nach Injektion von Glukose und analysieren sie mit dem Blutzuckermessgerät wie in 3.2.
  5. Entfernen Sie Einweg-Katheter und Klemmen Sie die Website der Katheter Einfügung mit einer Gaze. Sobald Blut geronnen ist, entfernen Sie die Gaze und überprüfen Sie den Status des Tieres.

4. Blutdruck

  1. Bereiten Sie das Erfassungssystem, einschließlich einem Druckaufnehmer, eine 10-mL-Spritze mit 0,9 % NaCl, ein drei-Wege-Hahn, einen Verstärker und einen PC/Laptop mit der Datenerfassungs-Software (für Blutdruck-Aufzeichnung).
  2. Stellen Sie das Gerät. Zunächst legen Sie die drei-Wege-Hahn und die Spritze in der Drucksensor, zwischen dem Schallkopf und der Katheter und schließen Sie der Drucksensor an den Verstärker an. Dann den Verstärker an den PC/Laptop anschließen.
  3. Durchführen Sie Wandler druckkalibrierung gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
  4. Legen Sie das bewusste Tier in ein Kaninchen Restrainer in Bauchlage. Das Ohr vor Kanülierung Aufwärmen, dann topisch angewendet ein Lokalanästhetikum (2,5 % Lidocain/Prilocain) im Ohr auf dem Gelände der Einfügung. Klopfen Sie leicht den Bereich wo die vaskuläre Paket ausgeführt wird, auf einfache Weise die Arterie. Dann legen Sie einen sterilen Katheter (18-22 G) in der linken Ohr central Artery. Lösen Sie die Fesseln und lassen Sie das Tier ruhig 30 Minuten bleiben.
  5. Aufzeichnen der Blutdruck kontinuierlich für 20 min direkt vom arteriellen Katheter, Platzierung der Drucksensor neben das Tier auf die Herzhöhe positioniert (Sampling-Frequenz: 1 KHz, siehe Abbildung 5 b).
    Hinweis: Um den Blutdruck (BP) Aufnahmen frei von Blut gerinnen Störungen zu halten (BP Signal Amplitude verliert oder verschwindet), NaCl (0,9 %) Injektion erfolgen. Mit der drei-Wege-Hahn, schließen Sie die Schaltung, die geht aus den Schallkopf des Katheters, öffnen Sie die Schaltung, die aus der Spritze des Katheters geht, und 1-2 mL Spritzen. Dadurch werden Blutgerinnsel, die sich bilden, können in den Katheter entfernt. Dann öffnen Sie die Schaltung zwischen den Schallkopf und Katheter und fortsetzen Sie die Aufnahme, sobald das Signal wieder aufgefunden wurde.
  6. Sobald die Aufnahme beendet ist, entfernen Sie den Katheter und Klemmen mit einer Gaze auf der Website der Katheter Einfügung, Blutverlust zu stoppen. Sobald das Blut geronnen ist, entfernen Sie die Gaze und überprüfen Sie den Status des Tieres.

(5) Plasma Messungen

Hinweis: Es ist ratsam, um die Verfahren der gleichen Tageszeit (d.h. 2-15:00).

  1. Schnell das Tier für 7 h (Entfernen von Nahrung und Pflege Wasser), dann legen Sie das bewusste Tier in eine einschränkende in Bauchlage und legen Sie eine sterile Nadel 21 G in das linke Ohr marginal Vene. Sobald Blut beginnt zu Tropfen, verwerfen Sie den ersten Tropfen und sammeln Sie die Blutproben in EDTA-Röhrchen bis zur Ebene angegeben in der Röhre. Speichern Sie die Proben auf Eis.
  2. Zentrifugieren Sie Blutproben bei 1.500 x g, 15 min, 4 ° C. Nach Zentrifugation Saug das Plasma mit einer Pipette und Aliquote von 250 µL vorzubereiten.
  3. Sofort die frischen Proben analysieren. Grundlegende Steuerungsparameter lauten wie folgt: Gesamt-Cholesterin, Triglyceride, HDL und LDL Cholesterin.
    Hinweis: Nicht frisch analysierte Proben ist sofort in einem-80 ° C Gefrierschrank aufzubewahren. Bei Interesse bei der Analyse des Blutzuckers von Plasma-Proben sollten die Blutzuckermessung Röhren mit Fluorid Oxalat anstelle von EDTA verwenden.

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Ergebnisse

MetS repräsentiert eine Gruppe von Stoffwechsel- und Herz-Kreislauf-Anomalien, deren Studium durch den Einsatz von experimentellen Modellen erleichtert werden kann. In der Tat, um die Mechanismen der pathologischen Umbau produziert von MetS zu erhellen, ist die Wahl von einem experimentellen Modell, das entsprechend ähnelt die conditio humana und eignet sich für die Forschung von entscheidender Bedeutung. Hier präsentieren wir Ihnen die Methoden, um die MetS in Kaninchen mit einer Diät re...

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Diskussion

Die Einrichtung eines geeigneten experimentellen Modells bieten eine konsistente und zuverlässige Methode, um die Entwicklung des MetS zu studieren, und es ist auch notwendig, die grundlegenden Mechanismen zu verstehen, die den Organen und Systemen Umbau zugrunde liegen. Hier beschreiben wir die Methoden zur Entwicklung eines relevanten experimentellen Modells der Diät-induzierten MetS und wie die Hauptkomponenten dieses Clusters von Stoffwechsel- und Herz-Kreislauf-Anomalien zu bewerten, die dieses Modell zu charakteris...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Generalitat Valenciana (GV2015-062), Universitat de València (UV-INV-PRECOMP14-206372), MZ, Generalitat Valenciana (PROMETEOII/2014/037) und Instituto de Salud Carlos III-FEDER Mittel (CIBERCV CB16/11/0486) FJC unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
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Animal Bio AmpAD InstrumentsFE136Verstärker
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Rückhaltesystem für KaninchenZoonlab3045601http://www.zoonlab.de/en/index.html
Fettreiche

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