Methodenartikel

Neuartige passiv Clearing Methoden für die schnelle Produktion von optischen Transparenz im gesamten ZNS-Gewebe

DOI:

10.3791/57123

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8. Mai 2018

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1Department of Neurosurgery, Gangnam Severance Hospital, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 PLUS Project for Medical Science, Yonsei University, 3The Spine and Spinal Cord Institute, Biomedical Center, Gangnam Severance Hospital, Yonsei University College of Medicine, 4Columbia University College of Physicians and Surgeons

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier stellen wir zwei neue Methoden, PsPACT und mPACT zur Erreichung maximaler optischer Transparenz und anschließende mikroskopische Analyse des Gewebes Gefäßsystem in das intakte Nagetier ganze CNS.

Zusammenfassung

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Seit der Entwicklung von Klarheit ermöglicht ein Bioelectrochemical clearing-Technik, die für die dreidimensionale Phänotyp Zuordnung in den transparenten Geweben, eine Vielzahl von neuartigen Clearing Methoden einschließlich KUBISCH (klar, unverbaute bildgebenden Cocktails und computergestützte Analyse), SWITCH (systemweite Kontrolle der Interaktionszeit) und die Kinetik der Chemikalien, Karte (vergrößerte das Proteom-Analyse) und Pakt (passive Klarheit-Technik), eingerichtet, um das bestehende Instrumentarium für weiter ausbauen die mikroskopische Analyse von biologischen Geweben. Die vorliegende Studie zielt darauf ab, bei der Verbesserung und Optimierung der ursprünglichen Pakt-Prozedur für ein Array intakt Nagetier Gewebe, einschließlich das gesamte zentrale Nervensystem (ZNS), Nieren, Milz und ganze mausembryonen. PsPACT (Prozess-separater Pakt) und mPACT ("modifizierte Pakt") bezeichnet, bieten diese neuartige Techniken hochwirksamen Mittel mapping Zelle Schaltung und subzelluläre Strukturen in intakten normalen und pathologischen Geweben zu visualisieren. Das folgende Protokoll bieten wir eine ausführliche, schrittweise Gliederung wie maximale Gewebe Abstand mit minimaler Invasion ihre strukturelle Integrität über PsPACT und mPACT zu erreichen.

Einleitung

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Ein grundlegendes Ziel der wissenschaftlichen und klinischen Untersuchung beinhaltet ein vollständiges Verständnis der Orgel Struktur und Funktion zu erreichen; die überaus komplexe Natur der Säugetier-Organe dient jedoch oft als Hindernis für voll und ganz diesem Ziel1zu erreichen. Klarheit (klare Lipid ausgetauscht Acrylamid-hybridisiert starre Imaging-kompatible Tisssue-hYdrogel)2,3,4, der beinhaltet den Aufbau einer Acrylamid-basierte Hydrogel-Hybrid von intakten Gewebe, erreicht optische Clearance von verschiedenen Organen, einschließlich Gehirn, Leber und Milz, unter Beibehaltung ihrer strukturellen Integrität-5. Klarheit konnte somit nicht nur die Visualisierung, sondern auch die Möglichkeit, komplexe Mobilfunknetze und Gewebe Morphologien ohne Schnitt fein sezieren.

Um Gewebe Abstand zu erreichen, setzt Klarheit elektrophoretische Methoden zum Entfernen von Lipidgehalt der Probe zur Verfügung. Während Klarheit gemerkt worden ist, für die Herstellung von physikalisch stabile Gewebe-Hydrogel Hybriden, Studien haben gezeigt, dass seine Verwendung der elektrophoretischen Gewebe Clearing (ETC) Methoden unterschiedliche Ergebnisse in Bezug auf Qualität Gewebe, einschließlich gebräunt, Epitop Schaden ergibt und Protein Verlust5,6. Um diese Probleme zu beheben, wurden modifizierte Protokolle wie Pakt (PAssive Technik, Klarheit), der die usw. Behandlung mit einer passiven, Ionische Spülmittel auf der Grundlage delipidierung-Technik ersetzt, entwickelten7,8,9. Trotz eine größere Konsistenz in Ergebnisse zu erreichen, erfordert jedoch Pakt mehr Zeit zum maximalen Abstand zu erhalten. Darüber hinaus wurden keine dieser Techniken noch auf das ganze CNS-Formular oder in größere Nager-Modelle wie Ratten und Meerschweinchen übernommen.

Die vorliegende Studie versucht, diese Einschränkungen zu beheben, indem er vorschlägt neuartige Methoden, PsPACT ("Prozess-separater Pakt") und mPACT (modifizierte Pakt), für erleichtern die schnelle Abfertigung von die ganze CNS und inneren Organe bei Maus und Ratte Modelle10. Im einzelnen verarbeitet PsPACT Gewebe in 4 % Acrylamid und 0,25 % VA-044 in zwei getrennten Schritten während Hydrogel Bildung; mPACT im Wesentlichen die gleichen Schritte beinhaltet, sondern ergänzt die SDS-basierte Clearing-Lösung mit 0,5 % α-Thioglycerol als zentrale Reagens. Beide Techniken nutzen die endogenen systemische und Liquor Kreislaufsystem um den Zeitaufwand zum optischen Freiraum produzieren deutlich zu reduzieren. Als Beweis des Prinzips zeigen wir den Einsatz der konfokalen Mikroskopie, Blutgefäß-Muster in den geräumten Gewebe10zu analysieren.

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Protokoll

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Alle Verfahren wurden von der Ethikkommission der entsprechenden Forschung an der Yonsei University College of Medicine genehmigt. Alle Versuchstiere sind nach den Richtlinien des Ausschusses Labor Tierbetreuung Yonsei University College of Medicine geopfert.

1. Vorbereitung der Reagenzien

Achtung: Paraformaldehyd (PFA), Acrylamid und Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) sind giftige Reizstoffe und somit in einer Abzugshaube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA, Kittel, Handschuhe, Schutzbrille) behandelt werden.

  1. 4 % Acrylamid (A.A.) Lösung (A4P0): 180 mL 0,1 M Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) 20 mL 40 % Acrylamid-Lösung hinzufügen.
  2. 0,25 % VA-044 Lösung: Fügen Sie 0,5 g 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride (VA-044) Pulver auf 200 mL 0,1 M Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Während das VA-044-Pulver bei Raumtemperatur gelagert werden kann, muss es bei 4 ° C bei der Solubilisierung mit PBS-Puffer gespeichert werden. Bereiten Sie um beste Ergebnisse zu erzielen nur die Menge der Lösung für das Experiment benötigt.
  3. Pakt cocktail Lösung: 225 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) Lösung 10 g Acrylamid hinzu und stellen Sie die Lautstärke auf 200 mL mit 4 % PFA. Vor dem Einsatz fügen Sie 100 mg VA-044-Pulver 40 mL der Mischung in einem 50 mL konische Röhrchen hinzu.
  4. Clearing-Lösung Puffer Pakt: 350 mL 0,1 M PBS 40 g Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) hinzu und stellen Sie die Lautstärke auf 500 mL mit 0,1 M PBS. Fügen Sie 0,5 % α-Thioglycerol mPACT clearing-Lösung hinzu des Pakts Lösung Puffer löschen.
  5. Die Mäuse, die in dieser Studie verwendet wurden 2 Wochen alten BALB männliche Mäuse; die Ratten, die in dieser Studie verwendet wurden 2 Wochen alten männlichen SD-Ratten.

(2) Anästhesie und Chirurgie der Perfusion

Achtung: PFA Acrylamid giftige Reizstoffe und sind somit unter einem Abzug mit geeignete PSA behandelt werden.

  1. Betäuben Sie das Tier in einem Pathogen-freies Zimmer mit 30 mg/kg Zoletil mit einer 1 mL Spritze mit einer 26-Gauge-Nadel. Überwachen Sie das Tier für 5-10 min.
  2. Sobald das Tier eine chirurgische Ebene der Anästhesie erreicht hat, verwenden Sie die Zehe-Prise Antwort-Methode, die Tiefe der Narkose bestimmen. Bestätigen Sie Reaktionsmangel.
    Hinweis: Die folgenden Schritte mit Maus und Ratte Chirurgie folgen ein ähnliches Protokoll in einer früheren Studie11verwendet.
  3. Machen Sie einen ca. 5-6 cm Schnitt unterhalb des Brustkorbs durch das Integument und Bauchwand.
  4. Geschwungene, stumpfe Scheren ein Schnitt in das Zwerchfell, Abtasten der thorakalen Bereich um die Website der Schnitt vorher zu suchen zu verwenden.
  5. Erstrecken Sie sich des Schnittes über die gesamte Länge des Brustkorbs, der Pleurahöhle verfügbar zu machen.
  6. Verdrängen Sie sorgfältig die Lunge. Machen Sie einen Schnitt durch den Brustkorb bis zum Schlüsselbein. Mit Iris-Schere, machen Sie einen kleinen Schnitt am hinteren Ende des linken Ventrikels. Legen Sie eine Blunt - oder Olive-Kreissägeblätter Perfusion 18-Gauge-Nadel in der Aorta ascendens, durch den Schnitt Ventrikel.
  7. Sichern Sie die Nadel und klemmend Herzen mit einer Gefäßklemme verhindern Sie auslaufen zu. Alternativ können Sie eine modifizierte Gefäßklemme Klemmen die Aorta auf die Nadelspitze.
  8. Machen Sie einen großen Schnitt im rechten Vorhof, kümmert sich um minimale Schäden an der absteigenden Aorta zu gewährleisten. Die Ratte ist nun betriebsbereit Perfusion.

(3) ganze Perfusion und Präparation der Ratte

Achtung: PFA Acrylamid giftige Reizstoffe und sind somit unter einem Abzug mit geeignete PSA behandelt werden.

Hinweis: Ganze Perfusion folgendermaßen ähneln einem ein Protokoll in einer früheren Studie von Woo Et al.verwendet. (2016) 10 , 11.

  1. Legen Sie den rechten Vorhof des Herzens auf ein 18-Gauge-Nadel, kümmert sich um eventuelle Luftblasen nicht vorstellen.
  2. Mit einer 50 mL-Spritze, Pumpen Sie schnell und gleichmäßig 50 mL kalten 0,1 M-PBS-Lösung mit Heparin (10 Einheiten/mL).
  3. Die 18-Gauge-Nadel an das Rohr der peristaltischen Pumpe anschließen.
  4. Mit 200 mL kalte 0,1 M-PBS-Lösung mit Heparin (10 Einheiten/mL) bei einer Umlaufgeschwindigkeit von 10 mL/min waschen.
  5. Befestigen Sie mit 250 mL kaltem 4 % PFA-Lösung auf eine Umlaufgeschwindigkeit von 10 mL/min. Die Ratte sollte in diesem Stadium steif sein.
  6. Erheben Sie und speichern Sie die restliche PFA-Lösung für die Entsorgung.
  7. Pakt perfundieren Sie Gewebe mit einer gekühlten Pakt cocktail Lösung von 4 % PFA, 4 % Acrylamid und 0,25 % VA-044-Pulver mit einem 18-Gauge-Nadel, und entfernen Sie dann den Kopf und Wirbelsäule. Setzen Sie den Schädel durch eine Mittellinie Schnitt vom Hals, die Nase. Diese zusätzliche Perfusion Schritt ist nicht erforderlich für die PsPACT und mPACT Methoden; nach der Fixierung sofort isolieren Sie des Kopfes und der Wirbelsäule und setzen Sie des Schädels aus.
  8. Setzen Sie die Basis des Schädels durch Entfernen alle restlichen Hals und Wirbelsäule Muskel aus.
  9. Verwenden Sie Rongeurs und Schere zum abschälen des Schädels. Entfernen Sie das Gehirn und das Rückenmark.
  10. Speichern Sie das Gewebe in 4 % PFA bei 4 ° C; Gewebe können bis zu 1 Woche aufbewahrt werden.

4. Hydrogel Monomer-Infusion und Polymerisation der Ratte und Maus CNS

Achtung: Acrylamid, SDS, α-Thioglycerol und PFA sind Reizstoffe und sollte so behandelt werden, in einer Dampfhaube und mit entsprechenden PINKELN.

  1. Pakt (passiv Clearing-Technik)
    1. Isolieren und Kultur ganze ZNS (Gehirn und Rückenmark) aus festen Mäuse und Ratten zu einem 50 mL Röhrchen mit einer gekühlten Pakt cocktail Lösung von 4 % PFA, 4 % Acrylamid und 0,25 % VA-044 Pulver und Speicher bei 4 ° C für 24 h stellen Sie sicher, dass das Gewebe in der s vollständig eingetaucht ist. ösung.
    2. Die Probe in Stickstoffgas einbetten, für 10 min mit einem Gewebe Hybridisierung System an einen Stickstofftank angeschlossen gel: Stellen Sie das System auf 37 ° C. Gewebe auf eine 50 mL-Tube mit frisch kalt (4 ° C) Pakt übertragen cocktail Lösung und verbinden mit Rohr Kappe, dann schalten Sie das Vakuum.
    3. Um das Hydrogel polymerisieren, platzieren Sie das Rohr mit der Probe in einem schütteln Inkubator (150 u/min, 37 ° C) für 3 h oder bis Polymerisation abgeschlossen ist.
    4. Mit Löschpapier (siehe Tabelle der Materialien), entfernen Sie die restlichen polymerisierten Hydrogel umgebenden Gewebe.
    5. Übertragen Sie das Gewebe auf eine 50 mL-Tube mit Clearing-Lösung (8 % SDS mit 0,1 M PBS-Puffer, pH 8.0).
    6. Legen Sie die Probe in einem schütteln Inkubator stellen auf 37 ° C und 150 u/min, bis das Gewebe gelöscht wurde. Im Durchschnitt dauert es etwa 20 Tage für die Maus CNS, volle Klarheit zu erreichen.
  2. PsPACT (Prozess getrennten passiven Clearing-Technik)
    1. Das ganze ZNS (Gehirn und Rückenmark) mit Knochen Cutter und Schere aus PFA-behoben: Mäuse und Ratten auf einer sauberen Werkbank zu isolieren.
    2. Gewebe zu übertragen, eine 50 mL-Tube mit 4 % PFA und Store bei 4 ° C für 24 h sicherstellen, dass das Gewebe vollständig in das Fixiermittel eingetaucht ist.
    3. Das fixierte Gewebe für 1 h in 0,1 M PBS waschen und dann übertragen auf A4P0 Lösung (4 % Acrylamid in 0,1 M PBS). Shop bei 37 ° C für 24 h.
    4. Waschen Sie das Gewebe für 5 min in 0,1 M PBS.
    5. Tauchen Sie das Gewebe in 0,25 % VA-044 in 0,1 M PBS. Bei 37 ° C für 6-24 h speichern Sie und übertragen Sie dann auf frischen 0,25 % VA-044/PBS-Lösung.
    6. Die Probe in Stickstoffgas einbetten, für 10 min mit einem Gewebe Hybridisierung gel System (siehe Tabelle der Materialien) an einen Stickstofftank angeschlossen: übertragen Gewebe auf eine 50 mL-Tube mit frisch kalt (4 ° C) 0,25 % VA-044/PBS-Lösung, und in Verbindung mit Rohr Kappe. Schalten Sie das Vakuum.
    7. Übertragen Sie das Gewebe auf clearing-Lösung (8 % SDS mit 0,1 M PBS-Puffer, pH 8.0).
    8. Inkubieren Sie die Probe in einem schütteln Inkubator stellen auf 37 ° C und 150 u/min, bis das Gewebe gelöscht wurde. Im Durchschnitt dauert es etwa 17 Tage für Maus CNS, volle Klarheit zu erreichen.
  3. mPACT (modifizierte Passive Clearing-Technik)
    1. Das ganze ZNS (Gehirn und Rückenmark) mit Knochen Cutter und Schere aus PFA-behoben: Mäuse und Ratten auf einer sauberen Werkbank zu isolieren.
    2. Führen Sie die Schritte 4.2.2 - 4.2.8 des PsPACT-Protokolls.
    3. Übertragen Sie das Gewebe auf clearing-Lösung. Beachten Sie, dass im Gegensatz zu den Pakt und PsPACT Protokolle mPACT eine Clearing-Lösung bestehend aus 0,5 % α-Thioglycerol zusätzlich 8 % SDS mit 0,1 M PBS-Puffer, pH 8.0 benötigt. Α-Thioglycerol ist ein UN-Bräunung Mittel, das hilft Gewebe deutlich schneller und effektiver. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe vollständig in die Lösung getaucht ist.
    4. Legen Sie die Probe in einem schütteln Inkubator stellen auf 37 ° C und 150 u/min, bis das Gewebe gelöscht wurde. Im Durchschnitt dauert es ca. 2 Wochen für Maus CNS, volle Klarheit zu erreichen.

(5) Brechungsindex Matching und Immunostaining geräumte CNS

Hinweis: nFelgen (Nycodenz-basierte Brechungsindex passende Lösung) besteht aus 0,8 g/mL Nycodenz Pulver, gelöst in 30 mL Basis-URI Puffer (0,01 % Natriumazid und Tween 20 in PBS 0,1 M, pH 8,0). Es wird empfohlen, dass die Lösung sich in einem 37 ° C schütteln Inkubator befindet, um richtige Solvatation des Pulvers zu ermöglichen.

  1. Inkubieren Sie Gewebe in 0,1 % Triton x-100 in 0,1 M PBS für 2 h, dann blockieren Sie mit 2 % Rinderserumalbumin (BSA) in 0,1 M PBS für 6 h.
  2. Abschnitte in PBST dreimal waschen (0,1 % Tween 20 in PBS 0,1 M) für 2 h. Fleck Abschnitte mit primären Antikörper (in diesem Fall, ein Anti-Kaninchen PECAM-CD31 Antikörper, die Blutgefäße Flecken) für 2 Tage.
  3. Färben Sie Abschnitte mit Sekundärantikörper (in diesem Fall eine Ziege Anti-Kaninchen IgG Cy3 fluoreszierende Konjugat) in 2 % BSA für 2 Tage.
  4. Waschen mit der Bezeichnung Gewebe dreimal in PBST für 2 h und laden in 15 mL nFelgen für 2-10 Tage.
  5. Bewegen Sie vor Bildgebung beschrifteten Gewebe, eine kleine Menge von n-Felgen auf 35 oder 60 mm Gewebekultur Schalen. Befestigen Sie mit Silikon am unteren Rand der Schale.
  6. 1,5-2 mL frische nFelgen hinzugeben.

6. Bildbearbeitung

  1. Abrufen von Bildern der geräumten Gewebe mit Kachel Scannen mit einem konfokalen Laserscanning-Microscopewith 10 X Vergrößerung (siehe Tabelle der Materialien). Für Cy3 beschriftet Gewebe, verwenden Sie Wellenlängen von 550-600 nm.

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Ergebnisse

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Generation ein transparentes Modell des gesamten ZNS mit optimierten passiven Clearing-Techniken

Optische Clearance von Maus und Ratte ganze CNS-Gewebe wurde schnell erreicht mit verschiedenen Techniken der passiven Clearing (Abbildung 1). Abbildung 2Azeigt eine schematische Darstellung des Gewebes im Laufe der Zeit löschen. Im Gegensatz zu der Original...

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Diskussion

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Während die passive, nicht elektrophoretischen Extraktionsmethoden beschäftigt verbessert Pakt deutlich die Konsistenz erreicht mit früheren Gewebe clearing-Methoden wie Klarheit2,3,4,7 , 8, trägt die Technik noch mehrere Mängel auf, die dringendsten davon die Länge der Zeit benötigt, um maximale Gewebe Klarheit12zu erreichen ist. In de...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch das Gehirn Korea 21 PLUS Projekt für die medizinische Wissenschaft, Yonsei Universität unterstützt. Darüber hinaus wurde diese Arbeit durch ein Stipendium der National Research Foundation of Korea (NRF-2017R1D1A1B03030315) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Natriumdodecylsulfat (SDS)Affymetrix, Inc.75819Reinigungslösung
NycodenzAxia-Shield1002424nRIMS Lösung
40% Acrylamid LösungBio Rad Laboratories, Inc.161-0140Polymerisation (A4P0)
2,2&akut;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propan]DihydrochloridWako Pure Chemical Industries, Ltd.017-19362Polymerisation (VA-044)
1-ThioglycerolSigma-AldrichM1753-100MLClearing-Lösung (mPACT)
Tween-20Georgiachem9005-64-5nRIMS-Lösung
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-50MLImmunfärbung
Rinderserumalbumin (BSA)BovogenBSA100Immunfärbung
HeparinMerck Millipore375095Perfusion (PBS)
NatriumazidSigma-AldrichS2002-25GnRIMS-Lösung
PECAM-CD31-AntikörperSanta Cruz Biotechnology Inc.sc-28188Immunfärbendes
Anti-Kaninchen-IgG Cy3 fluoreszierendes KonjugatJackson ImmunoResearch Inc.111-165-003Immunfärbung
4% ParaformaldehydTech & InnovationBPP-9004Perfusion, Polymerisation
20X phosphatgepufferte Kochsalzlösung (pH 7,4)Tech & InnovationBPB-9121Perfusion, Puffer
10 mL StripetteCoatar4488Lösungstransfer
50 mL RöhrchenFalcon352070Clearingröhrchen
35 mm ZellkulturschaleSPL20035Bildgebung
KonfokalschaleSPL211350Bildgebung
1 mL SpritzeKorea Vaccine Co., Ltd26G 1/2Anästhesie 
50 mL SpritzeKorea vaccine Co., Ltd21G1 1/4Perfusion
AcrylamidSigma-AldrichA3553Polymerisation (A4P0)
Whatman 3MM PapierSigma-AldrichZ270849Löschpapier zur Gelentfernung
Konfokales MikroskopZeissLSM780Imaging
ZEN lite SoftwareZeissZEN 2012Imaging
Peristaltische PumpeLongerpumpBT100-1FPerfusion
EasyGelLifecanvas TechnologiesEasyGelTissue Gel-Hybridisierungssystem
, ,

Referenzen

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Gewebekl rungpsPACT MethodemPACT MethodeHydrogel PolymerisationKl rungsl sungGewebepr paration

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