Eine einfach und anpassungsfähig Brühe Microdilution Methode für das screening von Antimykotika Verbindungen und Extrakte.
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Methodenartikel
Brühe Microdilution In Vitro Screening: eine einfache und schnelle Methode, um neue Antimykotika Verbindungen erkennen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Pilzinfektionen sind in den letzten Jahrzehnten eine wichtige medizinische Voraussetzung geworden, aber die Anzahl der verfügbaren Antimykotika ist begrenzt. In diesem Szenario ist die Suche nach neuen Antimykotika notwendig. Das Protokoll berichtet hier beschreibt eine Methode, um Bildschirm Peptide für ihre antimykotischen Eigenschaften. Es basiert auf der Microdilution-Empfindlichkeitstest Brühe aus den Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3-Richtlinien mit Modifikationen an der Erforschung der antimikrobielle Peptide als potenzielle neue Antimykotika. Dieses Protokoll beschreibt einen funktionelle Assay zur Beurteilung der Aktivität von Antimykotika Verbindungen und kann leicht geändert werden, um einer bestimmten Klasse von Molekülen unter Untersuchung zu entsprechen. Da die Assays in 96-Well-Platten mit kleinen Volumina durchgeführt werden, kann eine großangelegte Screening in kürzester Zeit abgeschlossen werden, vor allem, wenn in einer Automatisierung durchgeführt. Dieses Verfahren wird veranschaulicht, wie ein standardisierte und einstellbare klinisches Protokoll die Bank-Arbeit Verfolgung neuer Moleküle, die Therapie von Pilzerkrankungen zu verbessern helfen kann.
Einleitung
Pilzinfektionen sind geworden ein wichtiges medizinisches Anliegen in den letzten Jahrzehnten haben erheblich zugenommen, vor allem auf einen Anstieg der Zahl von immungeschwächten Personen wie diejenigen in der Krebsbehandlung und Menschen mit HIV/AIDS oder transplantierten Organe1,2. Jedoch beitragen eine sehr begrenzte Auswahl an verfügbaren Antimykotika und die zunehmende Zahl von Berichten über Pilzresistenz dazu zu den großen Problemen bezüglich der Therapie der systemischen Mykosen3.
Eine potenzielle Quelle für neue antimykotische Substanzen sind antim....
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Protokoll
(1) Lösungen und Medien
- Bereiten Sie 2 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium, Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), Sabouraud-Dextrose-Bouillon und Sabouraud-Dextrose-Agar nach Tabelle 1.
(2) Pilz Inokulum Wachstumsbedingungen
- Speichern Sie alle Pilzstämmen als gefrorene Bestände in 35 % Glycerin bei-80 ° C, bis benötigt.
- Führen Sie die folgenden Schritte vor jedem Experiment.
- Für Candida Albicans -Stämme:
- Ein Lager Fläschchen Auftauen und 200 µL bis 10 mL der Sabouraud-Dextrose-Bouillon in einem sterilen 50 mL Polypropylen-Rohr mit einer Kappe ....
- Für Candida Albicans -Stämme:
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Ergebnisse
Das MIC ist definiert als die niedrigste antimikrobielle Compoundkonzentration, die vollständig sichtbare Pilzwachstum am Ende der Inkubationszeit hemmt. Da das Ziel dieses Protokolls ist es, eine schnelle Methode, um potentielle Antimykotika Bildschirm haben, jeder Brunnen mit klaren Medien ähnlich wie die leeren Brunnen ein positives Ergebnis gilt während jeder mit Trübung analog zu den negativen/Wachstum-Kontroll-Vertiefungen gut als negativ bewertet. Allerdings besteht ein Interesse d.......
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Diskussion
Microdilution Tests können potenzielle antimykotische Aktivität der Zielsubstanz mit kleinen Mengen der Substanz zu analysieren und gleichzeitig testen Sie es in den unterschiedlichsten Konzentrationen. Dementsprechend wird dieses Protokoll als ersten Schritt im Screening für potenzielle neue antimykotische Substanzen empfohlen. Die hier vorgestellten Protokoll basiert auf der M27-A3 Protokoll, ursprünglich entwickelt, um Hilfe bei der Auswahl der antimykotischen Therapie in Kliniken, und lässt sich eine Vielzahl neuer a.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir bedanken uns bei Kaps-Brasilien, CNPq-Brasilien, FAP/DF für finanzielle Unterstützung. Wir sind dankbar, Dr. Hugo Costa Paes für das Manuskript überarbeiten.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Medien und Reagenzien | |||
| RPMI 1640 Medium mit L-Glutamin, ohne Natriumbicarbonat | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-morpholino) Propansulfonsäure (MOPS) (o que a gente usa tem um só dio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Zur Pufferung von 2X RPMI Medium | |
| Natriumchlorid (NaCl) | Dinâ Glimmer | 1528-1 | 137 mM für phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) |
| Kaliumchlorid (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2,7 mM für phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) |
| Natriumphosphat zweibasisch (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM für phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) |
| Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM für phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) |
| BD Difco Sabouraud Dextrosebrühe | BD | 238230 | |
| BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
| Glycerin | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% für (soluç ã o de estoque? Criopreservaç ã o?) |
| Steriles Wasser | Para diluiç ã o das drogas na diluiç ã o seriada | ||
| Antimykotika | |||
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Fluconazol | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| Plastics | |||
| 50 mL konisches Röhrchen | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Dish Petri | J.Prolab | 0304-5 | |
| 96 Well-Platte | Corning | 3595 | |
| Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Zum Pippieren der Lösungen mit dem Mehrkanal-Pippet |
| Equipment und anderen Materialien | |||
| Optisches Mikroskop | Nikon | E200MV | |
| Zentrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
| Inkubator | Ethik Technology | 403-3D | Set auf 37°; C |
| Schüttler | New Brunswick Scientific | Excella E25 | auf 37°; C, 200 U/min |
| Zellzählkammer, Neubauer | BOECO Deutschland | BOE 13 | |
| Mehrkanalpipette | HTL | 5123 |
Referenzen
- Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS. Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).
- Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).
- Pfaller, M. A.
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Nachdrucke und Genehmigungen
