Method Article

Quantitative Analyse der neuronalen dendritischen Arborization Komplexität in Drosophila

DOI:

10.3791/57139

⸱

January 7th, 2019

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1Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital, Mass General Institute of Neurodegenerative Disease, 2Department of Geriatric Neurology, Nanlou Clinical Division, PLA General Hospital

In This Article

Summary

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Dieses Protokoll konzentriert sich auf Quantitative Analyse der neuronalen dendritischen Arborization Komplexität (NDAC) in Drosophila, die für Studien der dendritischen Morphogenese verwendet werden können.

Abstract

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Dendriten sind die verzweigten Projektionen eines Neurons und dendritischen Morphologie spiegelt synaptischen Organisation während der Entwicklung des Nervensystems. Drosophila Larven neuronalen dendritischen Arborization (da) ist ein ideales Modell für das Studium Morphogenese der neuronalen Dendriten und Genfunktion in der Entwicklung des Nervensystems. Es gibt vier Klassen von da Neuronen. Klasse IV ist das komplexeste mit einem verzweigten Muster, die fast den gesamten Bereich der Larven Körperwand abdeckt. Wir haben bisher die Wirkung der Stummschaltung der Drosophila Ortholog der SOX5 Klasse IV neuronalen dendritischen Arborization Komplexität (NDAC) mit vier Parametern charakterisiert: die Länge der Dendriten, die Fläche der Dendrit-Abdeckung, die Gesamtzahl der Filialen und der Verzweigungsstruktur. Dieses Protokoll stellt den Workflow der NDAC Quantitative Analyse, bestehend aus Larven Dissektion, konfokale Mikroskopie und Bild Analyseverfahren mit ImageJ-Software. Weitere Einblicke in da neuronale Entwicklung und ihre zugrunde liegenden Mechanismen verbessert das Verständnis der neuronalen Funktion und Aufschluss über die grundlegenden Ursachen der neurologischen und Entwicklungsstörungen des.

Introduction

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Dendriten, die die verzweigten Projektionen eines Neurons sind, umfassen das Gebiet, das das Neuron sensorischen und synaptischen Eingänge von anderen Neuronen1,2umfasst. Dendriten sind ein wichtiger Bestandteil der Synapse Bildung und spielen eine kritische Rolle bei der Integration der synaptischen Eingänge, sowie die Vermehrung der elektrochemischen Stimulation in einem Neuron. Dendritische Arborization (da) ist ein Prozess, der durch den Neuronen neue dendritischen Bäume und Äste zum Erstellen neuer Synapsen bilden. Die Entwicklung und Morphologie der da, wie dichte Verzweigung und Gruppierung Muster ergeb....

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Protocol

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(1) experimentelle Vorbereitung

  1. Die folgenden Reagenzien vorzubereiten: Dulbeccos Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS); Triton x-100; 0,2 % PBST (PBS + 0,2 % Triton x-100); 32 % Paraformaldehyd (PFA), in 4 % vor Gebrauch verdünnt; Silikon-Elastomer-Basis und Härtemittel; Antifade Montage Medium (z. B.verlängern Gold); und Nagellack.
  2. Bereiten Sie die folgende Ausrüstung: Dissektion Mikroskop, zwei scharfe Pinzette und eine Schere für Mikrodissektion, eine Anzahl von Pins für Mikrodissektion, einer Petrischale zur Herstellung der Dissektion Gericht, Objektträger und Deckgläsern, ein confocal Mikroskop und eine Computer mit Fidschi ImageJ....

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Results

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Die Dendriten der Nervenzellen da waren da neuronale Soma und dendritischer Dorne für GFP Fluoreszenz imaging Analyse von co-überexprimierenden GFP (FH-GFP; Ppk-GAL4) bezeichnet. Die Morphologie der da Neuron Dendriten wurde von einem inversen confocal Mikroskop (Abbildung 2) abgebildet.

Die Dendriten der Nervenzellen da wurden mit Fidschi ImageJ-Software verfolgt. Die Datei wurde zur Schätzung der .......

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Discussion

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Dendriten, die die Epidermis innervieren sind die Eingabe Regionen von Neuronen und ihre Morphologien bestimmen, wie Informationen empfangen und verarbeitet von einzelnen Neuronen. Entwicklung Dendrit Morphologie spiegelt gen Modulation der Dendrit-Organisation. Die Drosophila Larven da Neuron des peripheren Nervensystems ist ein wichtiges Modell für das Studium Dendrit Entwicklung: 1) die funktionale Ähnlichkeit mit Säugetieren11,12; (2) vier Klassenunt.......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

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Wir möchten William A. Eimer für bildgebende technische Unterstützung zu danken. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Heilung der Alzheimer Krankheit Fonds [R.E.T], das National Institute of Health [R01AG014713 und R01MH60009, R.E.T; R03AR063271 und R15EB019704, A.L.], und die National Science Foundation [NSF1455613, A.L.].

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Gibco Life Sciences10010-023
TritonX-100Fisher Scientific9002-93-1
Paraformaldehyd (PFA)ElektronenmikroskopieSciences 15714-S
Sylgard 184 Silikonelastomerbasis und HärterDow Corning Corporation3097366-0516; 3097358-1004
ProLong Gold Antifading-EindeckmittelThermo Fisher ScientificP36931
Fingernagellack CVS72180
StereomikroskopNikonSMZ800
KonfokalmikroskopNikonEclipse Ti-E
PetrischaleFalcon353001
PinzetteDumont11255-20
Schere Roboz Chirurgisches Instrument CoRS-5611
Insektenstifte Roboz Surgical Instrument CoRS-6082-25
Objektträger und DeckgläserFisher Scientific15-188-52

References

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  1. Wassle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).
  2. MacNeil, M. A., Masland, R. H. Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).
  3. Losonczy, A., Makara, J. K.,....

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Dendritic ArborizationNeuronal MorphologyDrosophila LarvaeConfocal MicroscopyImageJ AnalysisDendrite Length MeasurementSurface Area CalculationBranching Structure AnalysisSOX5 Gene SilencingZ series Imaging

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