Summary
Pez cebra han utilizado recientemente como un sistema de modelo en vivo para el estudio de tiempo de replicación del ADN durante el desarrollo. Aquí está detallada de los protocolos para el uso de embriones de pez cebra para sincronización de replicación de perfil. Este protocolo puede ser fácilmente adaptado para el estudio de la sincronización de replicación en mutantes, tipos de células individuales, modelos de la enfermedad y otras especies.
Abstract
Sincronización de replicación de ADN es una característica celular importante, exhibiendo las relaciones significativas con tasas de mutación de ADN, la transcripción y la estructura de la cromatina. Cambios en la sincronización de replicación se producen durante el desarrollo y en el cáncer, pero la sincronización de replicación de papel desempeña en el desarrollo y la enfermedad no se conoce. Pez cebra recientemente se establecieron como un sistema de modelo en vivo para el estudio de tiempo de replicación. Aquí está detallada de los protocolos mediante el pez cebra para determinar tiempo de replicación de ADN. Después de clasificar las células de embriones y pez cebra adulto, alta resolución genoma ADN replicación sincronización los patrones pueden construirse mediante la determinación de cambios en el número de copias de ADN a través del análisis de datos de secuenciación de próxima generación. El sistema de modelo de pez cebra permite la evaluación de los cambios de sincronización de replicación que se presentan en vivo en todo el desarrollo y también puede utilizarse para evaluar los cambios en tipos de células individuales, modelos de la enfermedad o las líneas mutantes. Estos métodos le permitirá investigar los mecanismos y determinantes de la replicación sincronización establecimiento y mantenimiento durante el desarrollo de los estudios, la sincronización de replicación de papel desempeña en mutaciones y tumorigenesis y los efectos de perturbar sincronización de replicación en el desarrollo y la enfermedad.
Introduction
Para que las células dividir con éxito, debe en primer lugar con precisión y fielmente replican su genoma completo. Duplicación del genoma ocurre en un patrón reproducible, conocido como ADN replicación sincronización programa1. Sincronización de replicación del ADN se correlaciona con la organización de la cromatina, las marcas epigenéticas y gene expression2,3. Cambios en la sincronización de replicación se producen en todo el desarrollo y son programas relacionados significativamente conexos transcripcional y alteraciones en la cromatina marcas y organización4,5. Además, sincronización de replicación se correlaciona con frecuencias mutacionales, y cambios en el momento se observan en varios tipos de cáncer6,7,8. A pesar de estas observaciones, los mecanismos y determinantes de la regulación y establecimiento de tiempos de replicación son todavía en gran parte desconocidos y el papel desempeña en el desarrollo y la enfermedad es indeterminada. Además, hasta hace poco la replicación del genoma sincronización los cambios que ocurren a lo largo del desarrollo de vertebrados sólo se examinó en modelos de cultivo celular.
Pez cebra, Danio rerio, son adecuados para el estudio de replicación sincronización en vivo durante el desarrollo, como un solo par de acoplamiento puede producir cientos de embriones que se desarrollan rápidamente con muchas similitudes al desarrollo mamífero9, 10. Además, a lo largo del desarrollo del pez cebra, hay cambios en el ciclo celular, organización de la cromatina y programas transcripcionales que comparten relaciones de sincronización de replicación de ADN11. Pez cebra también son un excelente modelo genético, ya que son particularmente susceptibles a la manipulación por transgénesis, mutagénesis y mutaciones dirigidas y pantallas genéticas han identificado muchos genes necesarios para el desarrollo de vertebrados12. Por lo tanto, pez cebra puede utilizarse para identificar genes implicados en el mantenimiento y establecimiento de tiempos de replicación y observar los efectos de la desregulación de sincronización de replicación en el desarrollo de vertebrados. Líneas transgénicas pueden utilizarse también para evaluar la sincronización de replicación de tipos de células individuales aisladas en diferentes puntos de tiempo del desarrollo o en condiciones de enfermedad. Lo importante, hay varios modelos de pez cebra de la enfermedad humana que puede utilizarse para investigar la función de sincronización de replicación en enfermedad formación y progresión9,13,14.
Recientemente, se obtuvieron los perfiles de sincronización de replicación primera de pez cebra, estableciendo como sistema modelo para estudiar la replicación sincronización en vivo15. Para lograr esto, se obtuvieron células de embriones de pez cebra en varias etapas de desarrollo y en un tipo de células aisladas de pez cebra adulto. Las células fueron después ordenadas por FACS (clasificación celular activado por fluorescencia) basado en el contenido de DNA para aislar a poblaciones de fase G1 y S. Usando la muestra G1 como un control de número de copia, copia número variaciones en las poblaciones de fase S eran determinadas y deducir replicación relativo tiempo16. Cambios en la sincronización de replicación entonces se pueden comparar directamente entre diferentes muestras de desarrollo y tipos de la célula y esto fue utilizada para determinar cambios en la sincronización de replicación que se producen en vivo a lo largo del desarrollo de vertebrados. Este método ofrece varias ventajas sobre otros métodos genómicos, principalmente que no requiere de etiquetado con análogos de la timidina o inmunoprecipitación de ADN4,6.
Aquí está detallada de los protocolos de sincronización de replicación de ADN perfil genoma en alta resolución en el pez cebra. Estos protocolos se han utilizado para determinar las relaciones con las características genómicas y epigenéticas en el genoma del pez cebra, así como cambios en estas relaciones que se producen en todo el desarrollo de perfiles. Estos protocolos se adaptan fácilmente para estudiar cambios en la sincronización de replicación en cepas mutantes de pez cebra y en modelos de la enfermedad. Además, estos métodos proporcionan una base que puede ser ampliada a estudiar sincronización de replicación en tipos celulares específicos, primero clasificar los tipos de la célula individual del pez cebra. El pez cebra puede servir como un excelente en vivo sistema modelo para estudiar el tiempo de replicación y finalmente revelar las funciones biológicas de este importante rasgo de la epigenética.
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Protocol
Todos los animales se manejaron en estricta conformidad con los protocolos aprobados por la Comisión de uso y de Oklahoma Medical Research Foundation institucional Animal Care.
1. configuración del pez cebra adulto para criar
- Utilice a una cohorte grande de pez cebra macho y hembra adulto de una sola cepa de cría. Hay pequeñas diferencias en la composición genética del pez cebra de incluso una sola cepa, una cohorte grande para asegurar que los resultados son representativos de la variabilidad genética de la población y no restringida a un pequeño subconjunto de la población.
- La noche antes de que los embriones se recogerán, lugar docenas de adultos de crianza en tanques de cría, usar números aproximadamente iguales de machos y hembras. Según el experimento, utilice uno de las siguientes estrategias de crianza.
- Estrategia 1 de cría: unos peces cebra macho y hembra en tanques de cría individual, separar los machos de las hembras con un divisor. Si se utiliza este enfoque, configurar muchos tanques de cría diferentes y piscina los embriones de cada uno para que la variabilidad biológica es representativa de la población.
- Estrategia 2 de cría: combinar decenas de pez cebra macho y hembra en un tanque de cría grandes. Utilizar esta estrategia como hay un número suficientemente grande de embriones, es razonable asumir que vinieron de una variedad de fundadores y son por lo tanto genéticamente representativa de la población.
2. tiempo de apareamientos - recogida, clasificación y embriones de pez cebra para los experimentos de la vivienda
- Realizar cruzamientos programado, comenzando tan pronto como la luz de los ciclos en la mañana. Deseche cualquier embriones generados durante la noche.
- Permitir los peces para reproducirse en aguas poco profundas (3-5 cm) por un período de 10 minutos, con un falso fondo para embriones escapar a través de.
- Después de 10 min, recoger embriones por verter a través de un colador y enjuagar en una placa de 10 cm con una botella de lavado. Piscina todos los embriones recogidos en el mismo punto del tiempo, la marca con el tiempo de recolección y lugar inmediatamente en una incubadora a 28,5 ° C.
- Cientos de embriones se pueden esperar de un solo par de apareamiento en un día. Permitir que adultos criar en min 10 ciclos hasta que el número de embriones obtenidos es inferior a veinte.
- Aproximadamente 1 a 1,5 h después de la recolección, embriones de la especie para eliminar embriones muertos y no fecundados. Para ordenar los embriones, quite de la incubadora y observar bajo un microscopio de disección.
- Cuenta los embriones y lugar a una densidad de 100 embriones por placa de 10 cm.
- Agregar medio fresco de E3 (5 mM de NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM de MgSO4) y devolver los embriones a la incubadora de 28,5 ° C.
3. Dechorionate, deyolk y se fijan embriones de pez cebra
Nota: Esta sección del protocolo está diseñada para los embriones antes de la fertilización post de 48 h (hpf). No es necesario quitar las chorions de embriones en etapas posteriores del desarrollo (después de 48 hpf), como a menudo naturalmente se caen. No es necesario deyolk o eliminar el chorions de los peces más viejos los 5 días post fertilización (dpf).
- Cuando los embriones alcanzan la edad de desarrollo deseado, verificar la etapa apropiada de desarrollo morfológico al microscopio ligero según "Etapas de embrionario desarrollo del pez cebra"17.
- Transferencia de embriones etapas hasta 1500 a un tubo cónico de 15 mL y lavar varias veces con E3.
- Añadir 1 mL de E3 y 20 μl de la solución de pronasa (30 mg/mL) para cada 100 embriones y agitar suavemente. Hasta 1500 embriones pueden dechorionated en un solo tubo con 15 mL de E3.
- Ponga el tubo de costado y arreglar embriones en una capa uniforme para asegurar la máxima superficie a cociente del volumen. Frote suavemente el tubo cada 2-3 min hasta chorions todos han caído de los embriones. El tiempo total dechorionation variará dependiendo de la actividad de pronasa.
- Eliminar el sobrenadante y suavemente enjuague embriones 3 veces con 10 mL de E3. Coloque los embriones en el hielo para el resto de esta sección del protocolo.
- E3 de quitar y lavar los embriones con tampón de deyolking helado recién preparado (0,5 x solución de Ginzburg pescado Ringer sin calcio: 55 mM NaCl, 1,8 mM KCl, 1.25 mM NaHCO3).
- Añadir 1 mL de tampón de deyolking helada hasta 500 embriones.
- Utilizando P1000, suavemente pipeta embriones arriba y abajo 5 - 10 veces a interrumpir el saco de yema de huevo.
- Transferir 1 mL a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL y centrifugar a 4 ° C y 500 x g durante 5 minutos.
- Eliminar el sobrenadante y lavar pellet con 1 mL de helado de 1 x PBS (tamponada fosfato salino, pH 7.0) para eliminar la solución de Ringer. Centrifugar a 4 ° C y 500 x g durante 5 minutos.
- Cuidadosamente Quite el sobrenadante y resuspender las células en 1 mL de PBS 1 x. Coloque el tubo en hielo.
- Añadir 3 mL de helado etanol (EtOH) a un tubo cónico de 15 mL. Tubo de vórtice de EtOH suavemente en posición low.
- Usando una P1000, lentamente (1 gota por segundo) por goteo pez cebra embrión suspensión celular en EtOH al Vortex suavemente.
- Agregar un total de 1 mL de la suspensión de células de embrión, para una solución de fijación final de 75% EtOH.
- Después 1 mL de células suspensión ha sido añadido, suavemente tubo de remolino de la mezcla y a-20 ° C durante al menos 1 h. Se recomienda colocar los tubos en su parte para garantizar la máxima superficie a cociente del volumen y reducir el número de embriones y células que pegan. Almacenar las células del embrión a-20 ° C durante 2-3 semanas.
4. tinción de DNA y FACS clasificación de embriones
Nota: Esta sección del protocolo está diseñada para los embriones en 1 PD.
- Eliminar células de embrión de EtOH-fijo de-20 ° C y centrifugar a 4 ° C 1500 x g durante 5 minutos.
- Coloque el tubo en hielo y cuidadosamente eliminar sobrenadante. Usando una P1000, resuspender suavemente las células en 1 mL de recién preparado frío PBS-BSA (1 x PBS, seroalbúmina bovina al 1%).
- Centrifugar las células a 4 ° C y 1500 x g durante 5 minutos y coloque en hielo.
- Eliminar sobrenadante y resuspender las células en yoduro de propidio (PI) solución (50 μg/mL PI, 100 μg/mL Rnasa A, PBS, pH 7.0), la coloración utilizando 200 μL para cada 1000 embriones.
- Permitir a las células para incubar en la solución de PI por 30 min en hielo, mezclar suavemente cada 5 min.
- Coloque un colador de célula de nylon de 40 μm en un tubo cónico de 50 mL en hielo. Pipetee suavemente las células para mezclar y filtrar a través de la malla.
Nota: Si tubos múltiples embriones desde el mismo punto fueron recopilados en el artículo 3 del Protocolo, se combinan estos embriones en este momento para que todos ellos se ordenan juntos. - Suavemente con el plano en el extremo de un émbolo interno, interrumpir cualquier grupos restantes de las células de la malla.
- Enjuague las células a través del filtro con 500 μl de PBS-BSA frío para cada 1000 embriones.
- Coloque una malla de 40 μm en un tubo cónico de 15 mL en hielo y filtre la suspensión de la célula del tubo cónico de 50 mL una segunda vez en el tubo de 15 mL.
- Utilizando una celda correspondiente instrumento de ordenación, establezca la excitación láser detección 561 nm y emisión a 610/20 para detectar yoduro de propidio.
- Tubo de mezcla 15 mL de células brevemente por el vórtex y coloque en instrumento a 4 ° C.
- Tasa de ejecución las células a un flujo lento, idealmente de 1.0 mL/min, con el fin de obtener un perfil de ciclo celular limpio y evitar mezclar G1 o G2/M las células con la S fase población.
- En primer lugar, la puerta de la FSC-A x SSC-(área de dispersión hacia delante por la zona de dispersión lateral) para eliminar desechos (figura 1A).
Nota: Las células de los embriones pueden variar tamaños dependiendo del tipo de etapa y de la célula. El filtro de densidad neutra (ND) puede necesitar ser cambiado entre 1.0 y 1.5 dependiendo del tamaño de las células presentes. Un área grande para recoger la mayoría de las células y eliminar los desechos de la puerta. - Segunda, puerta para SSC-área (SSC-A) de área de PI (PI-A), para eliminar desechos y células dobletes (figura 1B).
- En tercer lugar, la puerta para SSC-A por SSC-W (ancho) para eliminar cualquier resto dobletes de la célula (figura 1).
- Mostrar las poblaciones cerradas en un histograma con numero de celular (cuenta) en el área de yoduro de eje y de propidio (PI-A) en el eje x. 24 embriones de hpf, esto debe dar un perfil estereotipado ciclo celular como en la figura 1.
- Para clasificar la población de fase S, encuentra la puerta del lado derecho del pico G1 a la izquierda de la cima del G2, incluyendo sólo una cantidad mínima de la G1 y G2. 24 embriones de hpf, esto típicamente abarcará unos 10-15% de la población cerrada (ver figura 1).
- Para clasificar la población de G1, fijar la puerta en el lado izquierdo del pico G1, no para pasar la parte superior del pico. Ajustar el ancho de la puerta de G1 tan estrecha como sea posible (ver figura 1).
- Nuevo puerta el G1 y S fase poblaciones para asegurar la correcta inicial bloquea (Figura 1E).
- Ordenar las poblaciones de fase G1 y S en tubos cónicos de 15 mL con 3 mL de PBS-BSA. El objetivo debe ser obtener entre 500.000 y 1 millón o más de células clasificadas por fracción (fase G1 y S).
- Vez finalizada la clasificación, centrifugar los tubos a 1500 x g y 4 ° C durante 10 minutos.
Nota: El precipitado de células pequeña será difícil de ver y es importante evitar distorsionarlo, use preferentemente un rotor oscilante de cubo sobre un rotor de ángulo fijo. - Cuidadosamente Quite el sobrenadante y resuspender el pellet con 1 mL de PBS 1 x. Transferir las células a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL y centrifugar a 6.000 x g y 4 ° C durante 5 minutos.
- Quitar todo el líquido del tubo y congelar pellet seco a-20 ° C. Guardar el sedimento a-20 ° C durante 2-3 semanas.
5. extracción de ADN, RNasa tratamiento y purificación de DNA
- Quitar el sedimento celulares del-20 ° C y en hielo.
- Añadir 400 μL de tampón de SDS (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.5% SDS) de pellets y resuspender.
- Añadir proteinasa K a una concentración final de 0,2 mg/mL y mezclar con un vórtex brevemente.
- Incubar las muestras a 56 ° C por 2 h, vortex cada 15 minutos.
- Después de 2 h, realizar extracción de fenol-cloroformo al añadir 400 μL de fenol-cloroformo (25:24:1 Alcohol fenol: cloroformo: isoamílico, saturado con 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA).
- Vortex para 20 muestra s y centrifugar a 16.000 x g durante 5 min separar las fases.
- Retire con cuidado la fase acuosa superior (400 μL) y transfiéralo a un tubo de 1,5 mL.
- Realizar EtOH precipitación mediante la adición de 40 μl de acetato de sodio de 3 M (pH 5,2), 2 μl de glucógeno y 1 mL de EtOH.
- Vortex para mezclar bien y colocar a-20 ° C durante la noche para precipitar el ADN. Muestra también puede precipitar a-80 ° C o en hielo seco durante 1 hora.
- Muestra de centrifugar a 4 ° C y 16.000 x g por 30 min a pellet de DNA.
- Descartar sobrenadante y lavar pellet con 1 mL 70% EtOH. Centrifugar a 4 ° C y 16.000 x g durante 5 minutos.
- Deseche el pellet flotante y secado al aire a temperatura ambiente durante 2-3 minutos.
- Disolver los pellets en 96 μl de agua esterilizado y añadir 4 μL de Rnasa A (2 mg/mL).
- Mezclar bien todo con un vórtex e incubar a 37 ° C durante 1 h.
- Realizar extracción de fenol-cloroformo añadiendo 100 μl de fenol-cloroformo y procedimiento en pasos 5.2.1 - 5.2.2.
- Realizar EtOH precipitación agregando 10 μl de acetato de sodio de 3 M y 1 glucógeno μl 250 μl de EtOH y siguiendo el procedimiento de pasos 5.3.1 - 5.3.5.
- Resuspender el precipitado en 60 μL de buffer TE (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA (pH8.0)) y determinar la concentración de ADN usando un método basado en la fluorescencia cuantitativo. Tienda ADN a-20 ° C.
Nota: Es importante cuantificar el ADN utilizando tintes de enlace de ADN basado en la fluorescencia, o por otros medios más fiables que los métodos basados en el espectrómetro de UV.
6. preparación de las bibliotecas de DNA y secuencia de la generación siguiente
Nota: Una muestra de referencia número G1 copia para cada fuente biológica es necesaria para cada ejecución de la secuencia (es decir, WT, mutantes, transgénicos, células, etcetera). Comparar todas las muestras de fase S de la misma fuente biológica en la misma secuencia a la misma referencia de G1. Funcionamiento biológico al menos dos réplicas de cada muestra para asegurar la consistencia entre las muestras.
- Diluir 1 μg de ADN en un volumen final de 50 μl y transfiéralo a un tubo especializado de sonicación.
- Esquileo de ADN genómico de un objetivo de 250-300 bp en un ultrasonicador enfocada, según las especificaciones del fabricante y protocolo.
- Verificar la calidad y el tamaño de la DNA genomic esquilada usando una máquina de electroforesis automatizada, según las especificaciones del fabricante y protocolo. Asegurar que hay un gran pico de 250-300 bp para la DNA genomic esquilado.
- Preparar las bibliotecas de la secuencia usando un kit de preparación de biblioteca de DNA con oligos multiplex para secuenciación en plataforma Illumina, según protocolo del fabricante.
- Verificar la calidad de la preparación de la biblioteca utilizando electroforesis automatizada máquina, según protocolo del fabricante. Asegurar que hay un gran pico de ~ 400-450 bp, y hay picos mínimos de dímeros de primer (80-85 bp) y dímeros de adaptador (~ 120 bp).
- Cuantificar las bibliotecas usando un kit de cuantificación de biblioteca de ADN para secuenciación de ADN de próxima generación, según protocolo del fabricante.
- Diluir 15 μl de biblioteca a una concentración de 5 nM y se combinan multiplexado bibliotecas según sea necesario para lograr la deseada únicamente asignación Lee cuentas por muestra.
Nota: El número de la única asignación de lecturas por muestra determinará la resolución. Uso tan sólo 5 millones asignados Lee evaluar la sincronización de replicación para el genoma del pez cebra. Se recomienda comenzar con 10 millones de lecturas. - Realizar secuencia de la DNA de emparejado-final 100 bp todo el genoma de las muestras en una plataforma de secuenciación de última generación, según las instrucciones del fabricante.
7. Análisis de los datos de la secuencia
Nota: Las instrucciones de esta sección están diseñadas como una guía para el análisis. Utilizar métodos adicionales para la alineación de la secuencia, filtrado, procesamiento, etcetera. Esta sección del protocolo tratará con el método de análisis en este trabajo. Si se utilizan métodos adicionales, ajustar los parámetros y funciones para esos fines. Los siguientes comandos se ingresan en Ubutnu o Mac terminal, con los correspondientes paquetes instalados.
- Obtener las versiones más recientes del genoma del pez cebra (danRer10, a partir de cuando fue escrito este protocolo) del browser del genoma UCSC utilizando los siguientes comandos:
wget ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/danRer10/bigZips/danRer10.fa.gz-O danRer10.fa.gz- Descomprima el archivo fa.gz con el siguiente comando:
gunzip danRer10.fa.gz - Alinear datos de secuenciación genoma usando BWA-mem utilizando los siguientes comandos:
BWA mem -t 8 danRer10.fa read_1.fastq read_2.fastq > output.sam
- Descomprima el archivo fa.gz con el siguiente comando:
- Convertir archivo .sam en archivo de .bam mediante samtools con el siguiente comando:
samtools ve -bS input.sam > output.bam- Ordenar los archivos de secuencias alineadas con samtools con el siguiente comando:
samtools clasificar output.bam > output_sorted.bam - Índice del archivo de .bam con samtools con el siguiente comando:
samtools índice output.bam
- Ordenar los archivos de secuencias alineadas con samtools con el siguiente comando:
- Mark PCR duplica con Picard utilizando los siguientes comandos:
Java-Xmx2g-jar picard.jar MarkDuplicates \
Input=Input.BAM
OUTPUT=output.BAM
REMOVE_DUPLICATES = false
METRICS_FILE=output_metrics.txt - Generar archivos de texto (.txt) de lecturas para cada cromosoma usando el siguiente comando:
para i en {1.25}; hacer CHROM = "chr" $i; echo $CHROM; samtools ve input.bam $CHROM | Cut -f 2,4,5,7,8,9 > readsChr$ {i} .txt; hecho
Nota: Las columnas en el archivo .txt que son bandera, ubicación, mapQ, par chr, par localización y tamaño del fragmento, respectivamente. - Leer archivos .txt en Matlab (o cualquier otro software similar) utilizando la función textscan.
- Filtrar mapas baja calidad Lee estableciendo un umbral mapQ de 30.
- Quitar Lee con banderas para alineación no primaria, duplicados PCR o asignación de par a un cromosoma diferente.
- Filtrar cualquier Lee con su pareja más allá de un umbral de distancia de 2000 bp.
- Evaluar estadísticas de Lee resultante para determinar número de leerlas estadísticas, cobertura, insertar tamaño y calidad (figura 2).
- Determinar leer cobertura en 100 ventanas de bp fijada para cada muestra contando el número de lecturas en intervalos de 100 bp a lo largo de cada cromosoma.
- Calcular que la mediana Lee cuenta para todas las ventanas.
- Filtrar las regiones de alta cobertura mediante la eliminación de windows mayores que 5 desviaciones estándar de la mediana.
- Definir regiones para su análisis en las muestras de referencia de G1 por encontrar segmentos a lo largo de cada cromosoma con 200 lecturas con ventanas correderas.
- Determinar la profundidad de lectura en cada muestra de fase S contando el número de lecturas de fase S en las ventanas de lectura 200 cuenta definidos para la referencia de G1 que lo acompaña.
- Suavizar los datos en bruto utilizando la función csaps en el software, con un factor de interpolación (p) de 10-16.
- Normalizar datos alisados a puntaje z con media 0 y desviación estándar de 1.
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Representative Results
Usando datos de sincronización de replicación publicado, perfiles de sincronización de replicación representativos y las medidas de control de calidad disponen de15. Los primeros pasos del proceso implican alinear los datos de la secuencia el genoma, cálculo de longitud leer y estadísticas de cobertura del genoma y filtrado de baja calidad, desapareado, y Lee duplicado de PCR. Estadísticas de lectura de una muestra de la secuencia típica de pez cebra se muestran en la figura 2. Después de filtrar, leer cuentas son determinadas en ventanas de tamaño variable y los datos son suavizadas y normalizados. Perfiles de sincronización de replicación típico alisado/normalizado de un cromosoma de pez cebra representante para réplicas biológicas se muestran en la Figura 3A. Los perfiles para réplicas biológicas y experimentales deben ser visualmente muy similar (ver Figura 3A) y también Mostrar la alta correlación a lo largo de la longitud del cromosoma (figura 3B). También debe mostrar la alta correlación entre los valores de sincronización en todo el genoma (figura 3). Autocorrelación, un método para evaluar la continuidad de modelo, puede usarse para evaluar el grado de estructura del conjunto de datos (figura 3D). La autocorrelación para programas de sincronización maduro estructurado debe ser alta en las distancias cortas y disminuyen progresivamente a medida que aumenta la distancia. Las muestras que demuestran alta reproducibilidad entre biológicos y experimentales replica y una señal fuerte autocorrelación debe considerarse como muestras de alta calidad y puede combinarse para obtener una muestra mayor de cobertura.
Figura 1: clasificación de embriones de pez cebra para el análisis de tiempo de replicación. (A) cerrada población de todas las células clasificadas para el área de dispersión hacia adelante (FSC-A) por la zona de dispersión lateral (SSC-A). Los colores representan la densidad de contenedores en la trama de punto con alta-baja densidad representada por colores que van de rojo a verde a azul. (B) cerrada de población de las células FSC x SSC cerrada y ordenada SSC-A por área de yoduro de propidio (PI-A). (C) cerrada población de SSC x células PI cerrada y ordenada SSC-A por anchura de dispersión lateral (SSC-W). (D) histograma de todas las poblaciones cerradas mostrando un perfil estereotipado de ciclo celular. Puertas tipo de células en fase G1 y S aparecen por el gris sombreado en caja con líneas negras. (E) Backgated G1 y S poblaciones de fase muestran que la sincronización inicial capturado a la mayoría de las células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: secuencia de Lee las estadísticas de una muestra típica de pez cebra. Reap (A) mapeo de calidad de las estadísticas de valores mapQ. (B) histograma de la distribución de tamaños de inserción para todas las lecturas de secuenciación. (C) estadísticas de lectura total lecturas asignadas, lee que contienen bandera de baja calidad, lee con pares a un cromosoma diferente (par diff chr), lee con par más allá del umbral de distancia (distante par) y PCR duplicados. (D) cifras representativas del total asignan, no asignado y Lee, cobertura y leer la resolución para un funcionamiento de la secuencia típica de una muestra de pez cebra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: resultados de sincronización de replicación de pez cebra representante y las medidas de control de calidad. (A): replicación sincronización a lo largo de la longitud de un representante del cromosoma para dos réplicas biológicas de 28 embriones hpf (Siefert, 2017). (B) correlación entre los valores de sincronización de replicación en windows de 2 Mb a lo largo de la longitud de un cromosoma representativo para el biológico replica de 28 embriones hpf que se muestra en la Figura 3A. Genoma (C) correlación entre los valores de sincronización de replicación para biológicos (rep1 y rep2) y experimental (rep3) repeticiones de 28 embriones de hpf. El mapa de color representa el coeficiente de correlación de Pearson. Autocorrelación (D) para un programa estructurado de tiempo madura muestra alta autocorrelación en cerradas distancias que disminuye gradualmente a distancias cada vez más. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Pez cebra proporcionan un sistema de modelo nuevo y único en vivo para el estudio de sincronización de replicación de ADN. Cuando se realizan cruzamientos programados como detallado en este protocolo experimental, miles de embriones pueden ser colectados en un solo día para experimentos. Estos embriones se desarrollan sincrónicamente precisamente tiempo y claramente caracterizado etapas de desarrollo. Pez cebra puede ser fácil y precisa puesta en escena por morfología mediante un estereomicroscopio, como embriones de pez cebra desarrollan externamente y son ópticamente transparente. Este protocolo detalla el uso de embriones de pez cebra para el estudio de la sincronización de replicación a lo largo del desarrollo de vertebrados.
Áreas del protocolo que puede presentar problemas son garantizar el desarrollo sincrónico de embriones de pez cebra, pérdida de las células durante la preparación, FACS clasificación y preparación de la biblioteca. El momento del desarrollo del pez cebra es temperatura dependiente, por lo tanto, pez cebra de uso adaptado a los ciclos de luz/oscuridad y ubicado a 28,5 ° C para los experimentos. Para asegurar el desarrollo sincrónico, realizar apareamientos precisamente tiempo y recoger embriones muy pequeños-Windows (10 min o menos). Es fundamental para mantener los embriones a 28,5 ° C y asegurar pasan un tiempo mínimo a temperatura ambiente. El tiempo de desarrollo del pez cebra también es altamente dependiente de la densidad de embriones en un área determinada. Es fundamental no casa embriones con una densidad superior a 100 embriones por placa de 10 cm, o no se desarrollarán correctamente. El momento óptimo para eliminar embriones muertos y no fertilizados es cuando han progresado a la etapa de célula 4-16 y pueden ser fácilmente identificados como fertilizado (uso de "Etapas de embrionario desarrollo del pez cebra"17 como guía). Embriones muertos suelen aparecerán como bolas negras y sin fertilizar embriones aparecen como células 1. Trabajar tan rápido como sea posible para reducir el tiempo a temperatura ambiente.
Cuando dechorionating embriones, es importante para que todos los chorions se eliminan de los embriones. Mantener embriones en solución de pronasa hasta chorions la mayoría vienen. Deseche cualquier embriones restantes con chorions intactos o quitar sus chorions con el fórceps. Embriones de la pipeta con un movimiento lento y suave. No tomar con pipeta rápidamente sujetará las células a una tensión indebida y resultado en la pérdida de las células. También es importante no utilizar un P200 ya que esto puede causar mayor esfuerzo cortante que resulta en la rotura de las células. Por el contrario, una pipeta de transferencia plástica no tenga lo suficientemente un pequeño agujero o proporcionar suficiente tensión de esquileo para interrumpir el saco de yema de huevo y separar las células adecuadamente. Pipetas de alternativa podrían utilizarse siempre el agujero y corte sería equivalente a la P1000 óptima.
Cuando FACS clasificación 28 hpf, si una célula estereotipada ciclo de perfil no se obtiene, regular el voltaje en el láser de PI para que el pico de G1 se centra alrededor de 50K. Las ganancias de FSC y SSC deba ajustarse de tal manera que la población control y célula aparece similar a la figura 1. Si todavía hay dificultad, debe cambiarse el filtro ND, y los voltajes FSC y SSC ajustados para asegurar la mayoría de las células están dentro de la puerta. Debería ser obvio si hay manchas de PI, como habrá una gama que se aproxima a dobles para el PI-A. El histograma debe mostrar dos picos claros, un pico grande en 2N ADN de las células en G1 y un pico más pequeño en el doble la intensidad para el 4N ADN contenido de células G2/M. Si esto aún no se obtiene tampoco puede haber números bajos de las células intactas, problemas con la coloración de la PI o problemas con la fijación y el protocolo tendrá que optimizar en consecuencia.
Células de embriones tempranos (antes de 10 hpf) no darán perfiles de ciclo celular típico, como un alto porcentaje de estas células en fase S. Estas muestras pueden tratadas como muestras de la fase S y comparadas con una referencia G1 de 24 embriones de hpf. Embriones de 10 hpf y 24 hpf pueden dar perfiles de ciclo intermedio de la célula y puede ordenarse si se desea. La población de fase S también puede identificarse y ordenada mediante la incorporación de análogos de la timidina como EDU (5-Ethynyl-2'-desoxiuridina) o BrdU (bromodeoxiuridina) en pulsos breves antes de la fijación, sin embargo, esto no es necesario para la exacta determinación de sincronización de replicación.
Idealmente la preparación de la biblioteca se debe iniciar con 1 μg de ADN. Teóricamente ~ 300.000 células ordenadas produciría alrededor de 1 μg de DNA (estimación de ~3.3 pg/núcleo), sin embargo, siempre hay pérdida en el protocolo. 500.000 a 1 millón de células ordenadas deben dar más de 1 μg de ADN. Un embrión de hpf 24 típico tiene aproximadamente 18.000 células, 10-15% de los cuales será en fase S. Embriones en etapas más tempranas del desarrollo que tienen considerablemente menos células, pero tendrán un mayor porcentaje de células en fase S.
Realización exacta purificación y selección del tamaño utilizando granos magnéticos es fundamental para eliminar elementos no deseados de la preparación de la biblioteca. Siga las instrucciones del fabricante cuidadosamente y optimización adicional puede ser requerida. Una pequeña cantidad de dímeros PCR por lo general no es un problema importante, pero dímeros de adaptador se secuencia muy eficiente por lo que debe minimizarse. Esto puede lograrse ajustando el adaptador inicial proporción de DNA, y realizar selección de tamaño exacto durante la preparación de la biblioteca.
Solo extremo de la secuencia también puede ser apropiada para diferentes necesidades experimentales. Solo es más barato y proporciona la mayor parte de la información requerida ya que este enfoque se basa en el recuento de lecturas; emparejados-final proporciona una mayor capacidad para eliminar el PCR y ópticas duplicados y resolver áreas de secuencias repetitivas y otras variaciones estructurales (que son comunes en el genoma del pez cebra). La parte de análisis a continuación tratará sólo lee de la secuencia final emparejado. Lee la secuencia más corto también puede ser apropiado. Esto proporcionará un mayor número de lecturas a un costo menor, pero la Lee puede ser más difícil de asignar. La parte de análisis a continuación está optimizada para 100 lecturas de bp, y ajustes pueden ser necesarios si se utiliza una longitud leer más corta.
Este protocolo puede ser fácilmente adaptado para usos adicionales del modelo de pez cebra. Ya se ha utilizado para el análisis de los fibroblastos de la aleta de cola de pez cebra (células ZTF), una célula primaria cultura línea aislada de la aleta de cola de pez cebra adulto. Para estudiar los tipos de células aisladas de pez cebra, marcadores transgénicos pueden utilizarse para identificar y aislar a células individuales antes de la coloración y clasificación de contenido de ADN. Una estrategia posible sería utilizar una línea transgénica expresando un marcador fluorescente por un promotor específico de tejido, y a primera aislado células por FACS clasificación, posteriores a la fijación y la clasificación para el contenido de ADN. Además, puede permitir el uso de tintes de ADN permeables de la célula para el aislamiento simultáneo de tipos de células individuales así como las poblaciones de fase G1 y S. Estas adaptaciones en este protocolo también podrían permitir estudios de sincronización de replicación en otros modelos en vivo .
Una posibilidad interesante para el uso futuro de este protocolo es estudiar la función de sincronización de replicación en la enfermedad. Hay varios modelos de cáncer en el pez cebra, algunas espontánea y otras inducible, que se pueden utilizar para determinar cuando ocurren cambios en la sincronización de replicación durante la oncogénesis. Esto permitirá que la evaluación de la sincronización de replicación de papel juega en la progresión de la enfermedad y tumorigenesis. Además, el pez cebra son un excelente modelo para la detección de drogas y puede utilizarse para identificar fármacos que afectan la regulación del tiempo de replicación, que tienen el potencial para el uso en el tratamiento del cáncer.
El pez cebra es un prometedor nuevo modelo para el estudio de tiempo de replicación. Este protocolo muchos otros brindará la oportunidad de utilizar este modelo en el estudio de la función de sincronización de replicación en el desarrollo y la enfermedad. Este protocolo puede ser adaptado para su uso con otros sistemas de modelo de desarrollo en vivo , como Drosophila melanogaster y Xenopus laevisy mirada hacia adelante al futuro los resultados de estos y otros organismos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud a través de becas 5P20GM103636-02 (incluyendo soporte de base de citometría de flujo) y 1R01GM121703, así como los premios desde el centro de Oklahoma para la células madre adultas Investigación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 | EMD Millipore | MMX00701 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | protease solution |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D1408 | |
| Ethanol (EtOH) | KOPTEC | V1016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647-100G | |
| Propidium Iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| EDTA | Sigma | E9844 | |
| SDS | Santa Cruz | sc-24950 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:Chloroform | Sigma | P3803-100ML | |
| Sodium acetate | J.T.Baker | 3470 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| RNase A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| Quanit-iT | Invitrogen | Q33130 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification |
| Covaris AFA microTUBE | Covaris | 520045 | specialized tube for sonication |
| Covaris E220 Sonicator | Covaris | E220 | focused ultrasonicator |
| Agilent 4200 Tapestation | Agilent | G2991AA | automated electrophoresis machine |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | Reagents for automated electrophoresis machine |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | Cat#E7370L | DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1) | NEB | Cat#E7335S | multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2) | NEB | Cat#E7500S | additional multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Library Quant Kit for Illumina | NEB | E7630L | quantification kit for library preparation |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | magnetic beads |
| Illumina HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | next generation DNA sequencing platform |
| 40 µm Falcon Nylon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm | VWR | 89107-632 | |
| 6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100 | VWR | 89078-446 | |
| Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color | Denville Scientific | C2170 (1001002) | Dnase/Rnase free |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash Bottles | VWR | 16650-022 | Low-Density Polyethylene, Wide Mouth |
| Strainer | VWR | 470092-440 | 6.9 cm, fine mesh |
| Corssing tank | Aquaneering | ZHCT100 | individual breeding tank |
| iSpawn | Techniplast | N/A | large breeding tank |
| FACSAria II | BD biosciences | N/A | cell sorting machine |
| Wild M5a steromicroscope | Wild Heerbrugg | N/A | dissecting microscope |
| Qubit 3 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration |
| Matlab | Mathworks | version 2017a | |
| Matlab Statistics Toolbox | Mathworks | version 11.1 | |
| Matlab Curve Fitting Toolbox | Mathworks | version 3.5.5 |
References
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