Method Article

Eine optogenetische Methode zu kontrollieren und analysieren gen Expressionsmuster in Zell-Zell-Interaktionen

DOI:

10.3791/57149

⸱

March 22nd, 2018

 , 
1Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto University, 2Japan Science and Technology Agency, PRESTO, 3Institute for Integrated Cell-Material Sciences, Kyoto University, 4Graduate School of Medicine, Kyoto University, 5Graduate School of Biostudies, Kyoto University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu analysieren von Zelle zu Zelle Übertragung der oszillierenden Informationen durch optogenetische Kontrolle und Überwachung der Genexpression zu leben. Dieser Ansatz bietet eine einzigartige Plattform, um eine funktionale Bedeutung der dynamischen Ausdruck Genprogramme in mehrzelligen Systeme zu testen.

Abstract

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Zellen sollten richtig reagieren, sich zeitlich ändernden Umgebungen, die durch verschiedene Faktoren aus den umliegenden Zellen beeinflusst werden. Der Notch-Signalweg ist eine solche wesentliche molekularen Maschinerie für Zell-Zell-Kommunikation, die Schlüsselrollen in der normalen Entwicklung der Embryonen spielt. Dieser Weg beinhaltet eine Zelle zu Zelle Informationsübertragung oszillierende mit ultradian Rhythmen, aber trotz der Fortschritts in den Techniken der Molekularbiologie, es ist schon eine Herausforderung, die Auswirkungen der vielzelligen Interaktionen auf oszillierende gen aufzuklären Dynamik. Hier präsentieren wir eine Protokoll, die optogenetische Steuerung und live-Überwachung des Gens Expressionsmuster präzise zeitliche ermöglicht. Diese Methode zeigte erfolgreich, dass intrazellulären und interzellulären regelmäßige Eingänge der Notch signaling innere Schwingungen durch Frequenz-tuning und Phasenverschiebung bei einzelligen Auflösung mitzureißen. Dieser Ansatz gilt für die Analyse der dynamischen Eigenschaften von verschiedene Signalwege, bietet eine einzigartige Plattform, um eine funktionale Bedeutung der dynamischen Ausdruck Genprogramme in mehrzelligen Systeme zu testen.

Introduction

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Zell-Zell-Kommunikation spielen wichtige Rollen im embryonalen Musterung in Entwicklungsprozessen. In den vertebrate Embryos sind die Metamere Strukturen, so genannte Somiten entlang der anterior-posterioren Körperachse mit präzise zeitliche Genauigkeit unter der Kontrolle einer Zeitmessung Uhr, genannt die Segmentierung Uhr1gebildet. Während dieses Prozesses eine Gruppe von presomitic Mesoderm (PSM) Zellen sind in regelmäßigen Abständen umgewandelt in Somiten in einer synchronen Weise. Dieser Prozess beinhaltet das synchronisierte oszillierende Genexpression und PSM-Zellen, die in Phase schwingen bilden die gleichen Somiten. Die oszillierende Genexpression beträgt etwa 2 bis 3 h bei Mäusen und ca. 30 min im Zebrafisch. Wenn dissoziiert, PSM Zellen verlieren die Synchronität2,3, aber wenn sie neu aggregiert werden, können sie selbst zu organisieren und die Bevölkerung Synchronität4, darauf hindeutet, dass Zell-Zell-Kupplung einen Schlüssel für die synchronisierte zu erholen Schwingungen.

Umfangreiche Anstrengungen ergab, dass Signalmoleküle in den Delta-Notch-Signalweg auf die synchronisierten Schwingungen der Segmentierung Uhrengene eng verbunden sind. Pharmakologische Inhibitoren oder genetische Mutationen der Notch signaling Synchronisierung die Bevölkerung der Oszillatoren. Im Zebrafisch anzeigen Mutanten von Notch signaling Komponenten wie DeltaC, DeltaD und Notch1a, asynchrone Schwingungen5,6. Küken oder Maus-Embryonen ist nicht nur Notch-Liganden Delta-like1 (Dll1), sondern auch die Kerbe Modulator Lunatic Fringe (Lfng) erforderlich für synchronisierte Schwingungen7,8,9. Jedoch wurde es schwierig, die Funktionsfähigkeit von solchen Molekülen zur dynamischen Informationsübertragung von Zelle zu Zelle zu testen, weil zeitliche Auflösungen von konventionellen Störung gen Verordnung Dynamik nicht ausreichend zu untersuchen, wurden die Prozesse der Zeitrahmen von 2 – 3 h (ultradian Rhythmen).

Wir haben vor kurzem eine integrierte Methode zur Steuerung und Überwachung gen Expressionsmuster in Säugerzellen10entwickelt. Diese Technologie ermöglicht die Induktion der gen-Expression-Impulse durch regelmäßige Beleuchtung auf ultradian Zeitskalen. Dieses Protokoll stellt die Methoden zum lichtempfindliche Zelllinien zu etablieren und dynamische Antworten der Reporter Zellen durch live-Cell-Lumineszenz Überwachung in den Kontexten von Zelle zu Zelle Kommunikation zu beobachten. Diese Methode ist anwendbar auf die Analyse von viele andere Signalwege.

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Protocol

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1. Erzeugung von stabilen Zelllinien vom Tol2 System

  1. Transfizieren Sie Plasmid-Vektoren (Abbildung 1A) Tol2-basierte optogenetische Module zusammen mit dem Expressionsvektor Transposase (Tol2) (pCAGGS-mT2TP) in C2C12 Zellen. Bei allen Schritten, Zellkulturen mit DMEM Medium ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und Penicillin-Streptomycin bei 37 ° C (Tabelle 1), in Anwesenheit von 5 % CO2, sonst gekennzeichnet.
    1. Zählen Sie trypsiniert Zellen mit einer Zelle-Zähler und Platte 5 x 104 C2C12 Zellen pro Bohrloch in einer 12-Well-Platte einen Tag vor Transfektion.
    2. Co transfizieren Sie 0,375 μg Tol2 basierende optogenetische Vektoren (pAI177 oder pAI218), 0,125 µg eines Medikaments Auswahl Vektors (pAI170) und 0,5 μg pCAGGS mT2TP Vektors mittels Lipofektion Reagenz.
    3. Trypsinize transfected Zellen und Platte sie in 100 mm Kultur Gerichte einen Tag nach Transfektion.
    4. Exchange-Nährmedium für transfizierte Zellen Kulturmedium mit 100 mg/mL Hygromycin ergänzt.
    5. Zellkulturen für 3 Tage, UN-transfizierte Zellen zu beseitigen. Beachten Sie, dass die mittlere Änderung nicht notwendig ist.
  2. Trypsinize transfected Zellen und reinigen einer Bevölkerung der Zellen, die mit dem Ausdruck fluoreszierende Proteine zur Auswahl. Stellen Sie für Empfänger Zellen tragen pAI177 die Sortierschleuse grün-PE Kanal für die Reinigung der mCherry-positiven Zellpopulation. Stellen Sie für lichtempfindliche Absender Zellen tragen pAI218 die Sortierschleuse APC Kanal für die Reinigung der iRFP713-positiven Zellpopulation.
  3. (optional) Stellen Sie eine klonale Zellpopulation durch Standardmethoden, wie begrenzt die Verdünnung oder einzellige Sortierung nach FACS.

2. Bewertung der Lichtempfindlichkeit von veränderter Zellen auf Bevölkerungsebene

Hinweis: Dieser Teil beschreibt ein Protokoll zur dynamischen Induktion Dll1 Liganden Proteine auf blaues Licht Beleuchtung durch biochemische Tests wie qPCR und Western blotting zu überprüfen.

  1. Zwei Arten von Inkubatoren mit oder ohne Lichtquellen für eine lichtinduzierte Bedingung oder einem dunklen Zustand bzw. einrichten. Set-up Lichtintensität von einer blau-LED Trans-Illuminator, wie in Abbildung 1 b, dargestellt mit einem Belichtungsmesser. Programm-Timings und Dauer der Beleuchtung durch das Laden ein Kontrollskript zu einem Einplatinen-Micro-Controller, der programmierbare Zeitpläne für Beleuchtung (Abbildung 1) ermöglicht.
  2. Graf trypsiniert Zellen mit einer Zelle-Zähler und Platte 1,0 x 105 Absender lichtempfindliche Zellen mit pAI218 und pAI170 auf 35-mm-Durchmesser Kunststoff Kultur Gerichte (mehr als 12 Gerichte für Lichtbedingungen und 1 Teller für dunklen Zustand) und die Gerichte in getrennte Inkubatoren für hell/dunkel-Bedingungen. Nach dem Einrichten der Gerichte, halten Sie Türen der Inkubatoren bis sammeln Zelle Lysates geschlossen.
  3. Eineinhalb Tage nach Beschichtung, beginnen Beleuchtung (Zellen werden voraussichtlich mehr als 80 % konfluierende). Setzen Sie nicht Zellen zum Leuchten, um unerwünschte Foto-Stimulation zu vermeiden.
    Hinweis: Termine für die Beleuchtung hängt vom Zweck der Experimente. Beachten Sie, dass eine nachhaltige Beleuchtung Zustand (zB. 1 min Dauer und 10 min Abständen mit 40 µmol/m2/s Licht-Intensität) ist ausreichend für eine einfache Überprüfung des Foto-Induktion und die starke Beleuchtung schädlich für die Zellen ist. Somit gewährleisten Sie, dass harmlose Parameter für Beleuchtung ausgewählt werden.
  4. Bereiten Sie ca. 2 Tage nach der Beschichtung, Zelle lysate mit 30-Minuten-Takt. Verschieben Sie Probeschalen aus Inkubatoren, Eis- und bereiten Sie Zelle Lysates zur weiteren Analyse.

3. dynamische Sender-Empfänger-Assay auf Bevölkerungsebene: Echtzeit-Überwachung von zellulären Reaktionen auf optische Stimulation von PMT

  1. Trypsinize und zählen die Anzahl der Absender und der Empfänger-Zellen mit Standardmethoden. Bereiten Sie eine 1-mL Gesamtvolumen des Mischens Aussetzung von 2,5 x 104 Empfänger und 1,25 x 105 Absender Zellen (Verhältnis 1:5).
    Hinweis: 2:1, 1:1 oder 1:2-Sender-Empfänger-Verhältnis arbeiten auch mit einer Anzahl von insgesamt Zellen von 1,5 x 105. 10
  2. Platte mit Kulturmedium mit 1 mM Luciferin Zellen in jede Vertiefung des schwarzen 24-Well Platten gemischt.
  3. Analysieren Sie die Zellen auf Platte Reader für Luciferase Assay, und bestätigen Sie, dass die Ausgangssignale nicht zu hoch für die Recording-System sind.
    Hinweis: Wenn Ausgangssignale höher als 1 x 106 Photon zählt/s sind, können sie gesättigt. In diesem Fall reduzieren Sie die Konzentration von Luciferin auf optimale Werte, so dass Ausgangssignale niedriger als 1 x 106 Photon zählt/s sind.
  4. Legen Sie die Platte auf das Aufnahmesystem, und starten Sie eine Aufnahme-Programm (Abbildung 1). Z. B. Starten Sie Beleuchtung um 18 Uhr nach der Einstellung der Aufnahme.
    Hinweis: Zeitliche Filterung, wie detrending Signale mit beweglichen Mittelung und Savitzky-Golay Filter, eignen sich zur Visualisierung von Wellenformen und peak-Erkennungen.

4. dynamische Sender-Empfänger-Assay auf der Single-Cell-Ebene: Echtzeit-Bildgebung des Single-Zell-Reaktionen unter der Kontrolle der optogenetische Störung

  1. Platte 0,5 x 105 Receiver und 2,5 x 105 Absender Zellen auf 27-mm-Durchmesser-Glassockel 35 mm Durchmesser Gerichte. Stellen Sie sicher, dass Mischungsverhältnisse und einer Anzahl von insgesamt Zellen (eine Zelle Dichte) richtig eingestellt.
  2. Einen Tag nach der Beschichtung, Austausch von Medium mit 2 mL des Aufzeichnungsmediums (Phenol-rot frei DMEM Mittel ergänzt mit 5 % FBS, Penicillin-Streptomycin und 1 mM Luciferin), und legen Sie die Glasboden Schüssel am Mikroskop. Bei Bedarf Waschen Sie Schmutz von abgestorbenen Zellen mit PBS (-).
    Hinweis: Es empfiehlt sich, diesen Schritt in einem dunklen Zustand zu tun.
  3. Richten Sie einem inversen Mikroskop mit einer Klimakammer bei 37 ° C und 5 % CO2ausgestattet.
  4. Einrichten einer gekühlten CCD-Kamera. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur des CCD-Sensors auf den Zielwert (in der Regel-90 ° C) abgekühlt ist.
  5. Stellen Sie Parameter für "Multi-Dimensional Timelapse" Fenster in automatische Datenerfassungs-Software zum Erfassen von Bildern mit 5 min-Takt und mehr als 288 mal (mehr als eine Nacht Aufnahme).
    1. "Multi-Dimensional Timelapse" Fenster zu öffnen, wählen Sie eine Lumineszenz-Kanal und einen langsamen 50 kHz Auslesen-Modus aus dem Pulldown-Menü und 4 x 4 binning mit 4 min. Belichtung. Sicherstellen Sie, dass der Auslesen Modus in den langsamen 50 kHz-Modus, die entscheidend zur Verringerung der Auslesen Geräusche festgelegt ist um schwach emittierende Biolumineszenz Licht zu erkennen ist.
    2. "Multi-Dimensional Timelapse" Fenster zu öffnen, wählen Sie Fluoreszenz-Kanäle und ein Schnelldurchlauf 1 MHz Auslesen aus dem Pulldown-Menü und 2 x 2 binning mit 400 ms Exposition. Stellen sicher, dass der Auslesen-Modus Modus schnell 1 MHz ist, reduzieren Sie den Zeitaufwand für die Fluoreszenz-Bildgebung.
    3. Starten Sie Zeitraffer-Aufnahme "Acquire" Schaltfläche.
  6. Extrahieren Sie einzellige Spuren der Lumineszenz Kanäle von Zeitraffer-Filme von Bildanalyse-Software wie folgt. Stellen Sie zunächst Lumineszenz und Fluoreszenz Stapel Bilder durch die Bilddaten, Bildanalyse-Software importieren. Entfernen Sie für Lumineszenz Bilder hot Pixel, abgeleitet von der kosmischen Strahlung durch den Vergleich der Intensitäten von Pixeln in zeitlich benachbarte Bilder ersetzen die Pixelwerte der zeitlichen Durchschnitt der vorherigen und nächsten Frames (als "SpikeNoise Filter" implementiert), wenden Sie diese bearbeiteten Bilder auf eine räumlich glättenden Filter an, und subtrahieren Sie Hintergrund Pixelwerte Out-field Aussicht von jedem Frame. Bestimmen Sie anschließend eine "Region of Interest" (ROI) für jede Zelle auf einem fluoreszierenden Bild zu jedem Zeitpunkt den ROI auf leuchtende Bilder anwenden, und die leuchtende Intensität jedes ROI zu messen.

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Results

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Wir haben die LightOn System11,12, wodurch Foto-induzierte Genexpression in Säugerzellen, zur Erforschung der genetischen Oszillatoren mit 2 - 3 h Periodizität angepasst. Dieses System besteht aus zwei Teilen: die Foto-induzierbaren transcriptional Aktivator hGAVPO und eine UAS-Promotor-Kassette zu Laufwerk Transkription von willkürlichen Gene von Interesse. Um die pulsatile Kinetik der Foto-induzierte Genexpression zu beschleunig...

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Discussion

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Wir haben eine Methode zur Steuerung von gen Ausdruck Dynamik mit einer Periodizität von 2 bis 3 h gezeigt. Diese Zeitskala ist viel kürzer als die in anderen konventionellen Systemen, einschließlich der Tet-System und das Originalsystem LightOn. Wichtige Parameter, die ultradian Zeitskalen zu erreichen sind Halbwertszeiten von Foto-induzierte molekulare Produkte, mRNAs und Proteinen. Zelltypen und Arten können diese kinetische Parameter abhängen. Für die Optimierung der Kinetics, ist Hes1 3' UTR Sequenzen durch andere z...

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde von JST, PRESTO (A.I.), Core Research für evolutionäre Wissenschaft und Technik (JPMJCR12W2 (r.k.)), Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung an innovativen Bereichen (Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT), Japan unterstützt. 26119708 (A.I.) und 16 H 06480 (r.k.)), wissenschaftliche Forschung (A) (Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) 24240049 (r.k.)) und Nachwuchswissenschaftler (A) (JSPS 15 H 05326 (A.I.)), und eine Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung an innovativen Bereichen "Fluoreszenz Live Bildgebung"des MEXT, Japan, und Plattform für dynamische Ansätze zu Living System von MEXT, Japan.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
FACSBecton, Dickinson und CompanyFACSAriaII SORP
KameraAndoriKon M-934
MikroskopOlympusIX-81 ZDC
PMT GerätChuritsu eletric corp.CL24B-LIC/B
Blaue LED-BeleuchtungOptoCodeLEDB-SBOXH
DMEMNacalai08459-35
Penicillin-StreptomycinNacalai26253-84
Fötales RinderserumSigma172012
KRYSTAL24 (schwarze 24-Well-Platte)Hi-Tech303012
D-Luciferin Kalium SalzNacalai20028-24
BelichtungsmesserLI-COR BiosciencesLI-250A
Anti-HA-Peroxidase AntikörperRocheKlon 3F10
Anti-Aktin-Peroxidase AntikörperWakoKlon 2F3

References

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