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Methodenartikel

Chemischen Amputation und Regeneration des Rachens in die Planarian Schmidtea mediterranea

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DOI:

10.3791/57168

⸱

26. März 2018

 ,  , 
1Department of Molecular Medicine, College of Veterinary Medicine, Cornell University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Planarian Schmidtea Mediterranea ist ein hervorragendes Modell für das Studium Stammzellen und Regeneration des Gewebes. Diese Publikation beschreibt eine Methode, um ein Organ, des Rachens, selektiv zu entfernen, indem man Tiere, die chemische Natriumazid. Dieses Protokoll beschreibt auch Methoden für die Überwachung des Rachens Regeneration.

Zusammenfassung

Planarien sind Plattwürmer, die äußerst effizient auf Regeneration. Sie verdanken diese Fähigkeit, eine große Anzahl von Stammzellen, die auf jeder Art von Verletzungen schnell reagieren können. Häufige Verletzungen Modelle in diesen Tieren entfernen Sie große Mengen von Gewebe, die mehrere Organe schädigt. Um dieses breite Gewebeschäden zu überwinden, beschreiben wir hier eine Methode, um gezielt ein einzelnes Organ, des Rachens in die Planarian Schmidtea Mediterraneaentfernen. Dies erreichen wir durch Einweichen Tiere in eine Lösung mit der Cytochrom-Oxidase-Hemmer Natriumazid. Kurze Exposition gegenüber Natriumazid verursacht Extrusion des Rachens vom Tier, nennen wir "chemische Amputation." Chemischen Amputation entfernt den gesamten Rachenraum und erzeugt eine kleine Wunde, wo der Pharynx in den Darm legt. Nach umfangreichen spülen, regeneriert alle Amputierte Tieren eine voll funktionsfähige Rachen in etwa einer Woche. Stammzellen in den Rest des Körpers fahren Regeneration des neuen Rachens. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zum chemischen Amputation und histologische und Verhaltensstörungen Methoden zur Beurteilung der erfolgreichen Amputation und Regeneration zu beschreiben.

Einleitung

Regeneration ist ein Phänomen, das im gesamten Tierreich, mit regenerativen Kapazitäten von Ganzkörper-Regeneration in bestimmten Wirbellosen bis hin zu mehr eingeschränkten Fähigkeiten in Wirbeltieren1auftritt. Ersatz von funktionellen Geweben ist ein komplexer Prozess und oft bringt die gleichzeitige Wiederherstellung mehrere Zelltypen. Zum Beispiel Salamander Gliedmaßen, Osteoblasten, Chondrozyten, Nervenzellen, Muskeln und Epithelzellen müssen sich regenerieren2ersetzt. Außerdem müssen diese neu erzeugten Zelltypen richtig organisiert werden, um die neue Funktion der Gliedmaße zu erleichtern. Das Verständnis dieser komplexen Prozesse erfordert Techniken, die auf Regeneration von bestimmten Zelltypen und ihre Integration in die Organe zu konzentrieren.

Die Strategien, die Studie der regenerativen Antworten zu vereinfachen gehört die gezielte Ablation von bestimmten Zelltypen oder größere Sammlungen von Geweben. Beispielsweise führt die Expression des Nitroreductase in bestimmten Zelltypen im Zebrafisch, zu deren Vernichtung nach Anwendung von Metronidazol3,4. In Drosophila -Larven Abtragen mit dem Ausdruck Pro-apoptotische Gene unter gewebespezifische Promotoren gezielt bestimmte Regionen des imaginalen Scheibe5,6. Beide dieser Strategien rasch, aber kontrollierten Schaden anrichten, und wurden verwendet, um die molekularen und zellulären Mechanismen für die Regeneration verantwortlich zu sezieren.

In diesem Manuskript beschreiben wir eine Methode, um eine ganze Organ namens des Rachens in die Planarian Schmidtea Mediterraneaselektiv abtragen. Planarien sind ein klassisches Modell der Regeneration, bekannt für ihre fruchtbaren Regenerationsfähigkeit, wo selbst kleinste Fragmente ganze Tiere 7,8wieder nachwachsen. Sie haben eine große, heterogene Bevölkerung von Stammzellen, die aus pluripotenten Zellen und Linie beschränkt Stammväter9,10,11. Diese Zellen vermehren sich und differenzieren, um alle fehlenden Gewebe, einschließlich des Rachens, Nerven-, Verdauungs- und Ausscheidungsorgane Systeme und Muskel und Epithelzellen9,10,12zu ersetzen. Wir wissen, dass diese Stammzellen Regeneration einzuleiten, tun wir nicht vollständig verstehen Sie, die molekularen Mechanismen, die sie zu diesen verschiedenen Zelltypen ersetzen fahren. Definierte verletzte Methoden, die präzise Stammzellen Reaktionen auslösen können helfen, diesen komplexen Prozess abzugrenzen.

Der Pharynx ist eine große, zylindrische Röhre benötigt für die Fütterung und enthält Neuronen, Muskel, epithelialen und sekretorischen Zellen13,29. Normalerweise versteckt in einer Tasche an der Bauchseite des Tieres, es erstreckt sich über einzelne Körper des Tieres auf das Vorhandensein von Nahrung sensing öffnen. Um selektiv den Pharynx amputieren, genießen wir Planarien in einer chemischen genannt Natriumazid, eine häufig verwendete Anästhetikum in C. Elegans14,15,16. Seine Verwendung in Planarien wurde erstmals berichtet, von Adler Et Al., 2014-12. Innerhalb von Minuten der Exposition gegenüber Natriumazid Planarien extrudieren Sie ihre Pharynges und mit sanften Agitation des Rachens trennt das Tier. Dieser vollständige und selektiven Verlust des Rachens bezeichnen wir als "chemische Amputation". Eine Woche nach der Amputation, ist eine voll funktionsfähige Rachen restaurierten12. Da Rachens für Fütterung erforderlich ist, kann funktionelle Regeneration gemessen werden, durch die Überwachung Fressverhalten. Im folgenden beschreiben wir das Protokoll für chemische Amputation und für die Beurteilung der Regeneration des Rachens und Wiederherstellung der Fressverhalten.

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Protokoll

1. Vorbereitung

  1. Aufbereitung des Wassers planaria 17
    1. Planarien in einem 1 X Montjuïc-Salz-Lösung zu erhalten. Um Planarian Wasser vorzubereiten, stellen Sie einzelne Stammlösungen 1 M CaCl2, 1 M MgSO4, 1 M MgCl2, 1 M KCl und 5 M NaCl Reinstwasser. Sterilisieren Sie Filter-mit 0,2 µm Flasche-Top Filterfor anhaltender Lagerung.
      Hinweis: Verwenden Sie nur hochreines entionisiertem Wasser (mit einem Widerstand von 18,2 MΩ bei 25 ° C), Montjuïc Salze vorzubereiten.
    2. Kombinieren Sie, um eine 1 L Brühe von 5 X Salzlösung vorzubereiten, 5 mL 1 M CaCl2, 5 mL 1 M MgSO4, 0,5 mL MgCl2, 0,5 mL KCl und 1,6 mL 5 M NaCl-Lösungen in 900 mL Reinstwasser. Fügen Sie zu dieser Lösung 0,504 g Nahco33 hinzu und unter Rühren Sie mischen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit Salzsäure.
    3. Diese 5 X Stammlösung 1 X arbeiten Konzentration in Reinstwasser in einen sterilen Behälter wie z. B. eine große Kapazität Korbflasche verdünnen (siehe die Tabelle der Materialien). Verwenden Sie diese 1 X Lösung für die Aufrechterhaltung der asexuellen Planarien.
      Hinweis: Als Alternative zum Montjuïc-Salz-Lösung zu verwenden, vor Ort gekauft Quellwasser oder Reinstwasser mit einem handelsüblichen Aquarium Salz mischen (siehe Tabelle der Materialien), um eine Konzentration of0.5 g/L18.
    4. Zur Vermeidung von bakteriellen Infektionen in statischer Kultur19pflegen Sie Planarien in Wasser mit einem Antibiotikum. Bereiten Sie eine 50 mg/mL Stammlösung von Gentamicin Sulfat Reinstwasser und sterilisieren Sie Filter zu. Fügen Sie Gentamicin Sulfat Behälter wo Tiere gepflegt werden hinzu, um eine Endkonzentration von 50 µg/mL (Verdünnung 1: 1000).
  2. Vorbereitung der Leberpastete
    1. Wie Planarien auf eine Diät von Bio gedeihen, Grünfutterbasis Leber, kaufen Sie frische Leber und Vorgang innerhalb von 24 Std. entfernt die häutigen Kapsel Kapseln der Leberzellkrebs durch vorsichtig abziehen. Schneiden Sie die Leber in ~ 1 cm Würfel, und verwenden Sie ein Messer abkratzen und verwerfen alle hepatischen Venen und Arterien.
    2. Mazerat Leber Stücke mit einer Passiermühle oder einer Küchenmaschine und dann durch ein Sieb Essen Draht passieren. Kombinieren Sie in Spritzbeutel und in Spritzen oder 35-mm-Petrischalen zu verzichten. Zentrifugieren Sie vor der Fütterung sanft um Luftblasen zu entfernen.
    3. Aliquote der Leber bei-80 ° C bis zu einem Jahr und Tauwetter vor der Verwendung zu speichern. Nach dem Auftauen wieder frieren Sie alle übrig gebliebenen Leber einmal ein oder bei 4 ° C bis zu 24 Stunden speichern.
  3. Pflege der Tiere
    1. Planarien wachsen und schrumpfen zu verschiedenen Größen abhängig von der Häufigkeit der Fütterung. Füttern Sie Planarien jede zweite Woche (einmal alle 14 Tage). Verwenden Sie für langfristige Bulk Kulturen Kunststoff-Behälter in verschiedenen Größen (siehe Tabelle der Materialien).
    2. Um die Tiere zu füttern, verwenden Sie einen Spachtel aus Metall oder Kunststoff Transferpipette einen erbsengroßer Tropfen der Leber in eine Box Platz. Ermöglichen Sie Tiere, für 1-2 h entfernen übrig gebliebene Essen zu essen, vor dem Reinigen der Box.
    3. Würmer, zweimal in der Woche (einmal direkt nach der Fütterung und einmal zwei Tage später) gefüttert oder einmal pro Woche zu reinigen, wenn Sie nicht gefüttert. Zur Reinigung lassen Sie Wasser in einen Kunststoffbecher sorgfältig gießt das Wasser unter Beibehaltung Planarien im Feld. Wischen Sie Box-Oberfläche mit einem Papiertuch ab, dann auf allen Seiten wiederholen Sie, bis die Box sauber ist.
    4. Wasser (ca. ¾ der das Gehäusevolumen) zu ersetzen und eine Endkonzentration von 50 µg/mL Gentamicin hinzufügen. Lagern Sie Tiere in einem dunklen Schrank oder in einem Inkubator 20 ° C.
  4. Auswahl von worms
    1. Wählen Sie die Würmer, die 5-7 Tage zuvor gefüttert wurden.
      Hinweis: Es ist wesentlich schwieriger zu Pharynges von Würmern zu amputieren, die vor kurzem (1-2 Tage vor der Amputation) gefüttert wurden. Gefütterten Tiere sind auch empfindlicher auf Natriumazid.
    2. Wählen Sie die Würmer, die etwa 6 mm in der Länge sind. Um die Größe des Wurms zu schätzen, auf einer Petrischale mit einer Pipette aus Kunststoff Übertragung übertragen. Legen Sie eine flache 6 - In-Lineal oder Zeichenpapier mit Maßeinteilung 5 x 5 mm unterhalb der Petrischale und Messen Sie die Länge der Wurm, während es kriecht.
      Hinweis: Würmer, die kleiner als 6 mm in der Länge sind schwieriger zu amputieren.
  5. Vorbereitung von Natriumazid
    1. Bereiten Sie eine 100 mM-Lösung von Natrium-Azid Pulver in Planaria Wasser auflösen.
      Vorsicht: Natriumazid ist giftig und sollte vorsichtig behandelt werden. Verwerfen Sie Natriumazid den Abfluss nicht. Nach der Verwendung es separat zur Entsorgung als Sondermüll zu sammeln.

(2) Pharynx Amputation

  1. Ort Würmer in einem 35-mm-Durchmesser Petrischale. Entfernen Sie vorsichtig alle Planarian Wasser aus der Schüssel mit einem Kunststoff Transferpipette.
    Hinweis: Maximal 20 6-mm-Würmer kann bequem in eine Schüssel mit dieser Größe untergebracht werden.
  2. Die Schale unter dem Mikroskop und Vergrößerung so einstellen, dass mehrere Würmer gleichzeitig angezeigt werden können (z.B. 10 X Vergrößerung). Ersetzen Sie Planarian Wasser mit 100 mM Natrium-Azid Lösung.
    Hinweis: Für eine 35-mm-Petrischale reicht etwa 5 mL von Natriumazid. Die Lösung sollte vollständig Planarien Tauchen. Lautstärke Lösung für größere Gerichte wie nötig.
  3. Beobachten Sie die Tiere unter dem Mikroskop und Refrain vom Gericht für die ersten 3-4 min bewegen.
  4. Die Extrusion des Rachens durch das Mikroskop zu beobachten; des Rachens wird ragen aus dem Rachenraum Beutel und vollständig zu verlängern (ca. 1 mm in der Länge) wie in Abbildung 1 bgezeigt.
    Hinweis: Es ist wichtig zu warten, bis der Pharynx Verlängerung komplett abgeschlossen hat, bevor Sie fortfahren. Sobald der Rachen des Tieres entsteht, dauert Vollauszug etwa 1 min.
  5. Verwenden Sie ein Kunststoff Transferpipette Tiere rund um die Schale zu spritzen. Saugen Sie die Tiere in das pipettieren und lassen Sie sie gewaltsam in die Schüssel ein paar Mal. Wenn der Rachen voll ausgefahren ist, verursacht diese kräftig Pipettieren lösen.
  6. Alternativ erfassen des Rachens entweder vertikal entlang seiner Länge, oder horizontal entlang seines Umfangs mit einer feinen Pinzette (siehe Tabelle der Materialien), wie in Abbildung 1dargestellt. Heben Sie mit den Pharynx in der Zange gequetscht das Tier nach oben in Richtung der Meniskus. Da das Tier ausgelöst wird, wird Oberflächenspannung des Rachens, trennen Sie das Tier verursachen.
    Hinweis: Diese Methode kann verwendet werden, entfernen die Pharynges von kleineren Tieren (1-3 mm in der Länge) wo ist kraftvoll wirbeln nicht ausreichend. Vermeiden Sie stossen oder anderweitig verletzt den Körper des Tieres.
  7. Bewegen Sie mit eine Transferpipette Amputierte Tieren auf ein neues Gericht mit frischen Planaria Wasser.
  8. Einmal übertragen, spülen Sie amputierten Tiere gründlich mit Planaria Wasser, komplett tauschen das Wasser dreimal. Übertragen Sie auf eine neue Schale mit Planaria Wasser mit 50µg/mL von Gentamicin.
    Hinweis: Komplette Buffer Tausch während dieser drei Wäschen ist unerlässlich, Entfernung von Natriumazid gewährleistet.
  9. Ersetzen Sie am nächsten Tag Wasser in der Schale mit frischen Planaria wasserhaltige 50 µg/mL von Gentamicin. Wiederholen Sie jeden zweiten Tag danach.

3. Bewertung der Pharynx Entfernung nach Amputation

  1. Tiere unter dem Mikroskop (mit 10-20 X Vergrößerung) zu untersuchen, um festzustellen, ob ein dunkler Fleck nach Abwahl des Rachens, erschienen ist, wie in Abbildung 2Agezeigt.
  2. Alternativ zu beheben Sie und Bleichen Sie Tiere nach dem Protokoll von Pearson Et Al. beschrieben 20. Einweichen Tiere über Nacht in 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) oder Gewebekulturen konjugiert Streptavidin (1 mg/mL verdünnt 1: 500, 1 X Phosphat Buffered Saline mit 0,3 % Triton-X). Tiere auf Folien in 80 % glycerol/20% 1 X Phosphat Buffered Saline und Bild unter einem fluoreszierenden Stereomikroskop (Abb. 2 b) montieren.
    Hinweis: Alle Bilder in dieser Handschrift wurden auf eine fluoreszierende Stereomikroskop mit einem 1,0 X Ziel erfasst.

4. Bewertung der Pharynx Regeneration durch Messung Fressverhalten

  1. Vorbereitung der Leber
    1. Übertragen Sie benötigte Menge an Leberpastete in einem Microcentrifuge oder konische Rohr. Kurz drehen Sie, um Luftblasen zu entfernen. Schätzen Sie das Volumen der Leber, und dann fügen Sie Planaria Wasser zu 1/5 seines Volumens und 2 % des Gesamtvolumens in rote Lebensmittelfarbe hinzu. Z. B. 1000 µL Leber fügen Sie ein, fügen Sie 200 µL Planaria Wasser und 24 µL Lebensmittelfarbe.
    2. Mit Kunststoff Stößel, Pipettenspitze oder Metallspatel, gründlich mischen Sie, bis Lebensmittelfarbe in der Leber-Paste gleichmäßig verteilt wird. Noch einmal kurz drehen. Leberpastete kann bei 4 ° C für 24 h gespeichert oder in Aliquote bei-80 ° C für die langfristige Lagerung eingefroren.
    3. Wenn bis zu 25 Tieren testen, bereiten Sie 25 µL Leberpastete pro Schale (ca. 1 µL Leberpastete pro Tier).
  2. Fütterung der Tiere
    1. Übertragen Sie sieben Tage nach chemischen Amputation, Tiere auf eine neue Petrischale. Wenn 10-15 Tiere zu testen, verwenden Sie eine 35 mm-Gericht; mehr als 15 Tiere sollten in einer 60 mm Petrischale getestet werden. Halten Sie Tiere in der Dunkelheit, ungestört, ca. 1 h vor der Fütterung.
    2. Mit Schere, verbreitern Sie die Pipettenspitze ein P200 durch Trimmen etwa ½ cm weg von dem schmalen Ende. Pipettieren 25 µL der roten Leberpastete in die Schüssel.
      Hinweis: Ende trimmen macht Pipettieren der viskosen Leberpastete einfacher. Damit die Leber nicht schwimmt auf der Oberfläche, berühren Sie die Spitze an der Unterseite der Schale unter Verzicht auf.
    3. Können Sie Tiere, 30 min. lang zu ernähren.
    4. Ergebnis der Anzahl von Tieren, die gegessen haben, indem die Tiere auf einem weißen Hintergrund oder Untersuchung unter dem Mikroskop mit 10-20 X Vergrößerung.
    5. Nach der Fütterung, Leber aus der Schale entfernen und reinigen.

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Ergebnisse

Exposition gegenüber Natriumazid stört die normale Beweglichkeit der Planarien, Tiere zu dehnen und Winden verursacht. Diese Bewegungen zwingen den Rachen von der ventralen Seite des Tieres entstehen, und nach ca. 6 min. in Natrium-Azid-Lösung, die weiße Spitze des Rachens zu sehen (Abbildung 1 b-linken). Ein paar Minuten später, Tiere aktiv zusammenziehen und des Rachens durch Drücken Sie ihn gewaltsam aus dem Körper vollständig zu erweitern...

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Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur selektiven Abtragen des Rachens mit Natriumazid. Weitere gezielte Ablation Studien in Planarien haben geänderte Chirurgie verwendet, um Photorezeptoren21 oder pharmakologische Behandlung zu dopaminergen Neuronen22abtragen zu entfernen. Ein großer Vorteil der chemischen Amputation über bestehende Methoden ist, dass es keine Operation erfordert. Die starre Struktur des Rachens verglichen mit dem Rest des Körpers Planarian erleichte...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir möchten Alejandro Sánchez Alvarado, danken, die die anfänglichen Optimierung und Entwicklung dieser Technik unterstützt. Im Carolyn Adler Labor ist von Cornell University Startkapital unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2)Fisher ChemicalC79-3Montjuï c Salzlösung
Magnesiumsulfat wasserfrei (MgSO4)Fisher ChemicalM65-3Montjuï c Salzlösung
Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl2)Acros/VWR41341-5000Montjuï c Salzlösung
Kaliumchlorid (KCl)Acros Organics/VWR196770010Montjuï c Salzlösung
Natriumchlorid (NaCl)Acros Organics/VWR207790050Montjuï c Salzlösung
Natriumbicarbonat (NaHCO3)Acros Organics/VWR123360010Montjuï c Salzlösung
Nalgene autoklavierbares Polypropylen-Copolymer Lowboy mit ZapfenThermoFisher Scientific/VWR2324-0015Lagerung von Planarienwasser
Instant Ocean MeersalzSpektrum MarkenAmazonPlanaria Wasser
Gentamicin SulfatGemini Bio-Produkte400-100PPlanaria Wasser
RasierklingenElektronenmikroskopie Wissenschaften71970Zerkleinerung der Leber
Einweg-Spritzbeutel-16", 12er PackWiltonAmazonLeber Aliquots
5 mL SpritzenBD/VWR309647Leber Aliquots
Petrischalen - 35mm/60mmGreiner Bio-One/VWR82050-536/82050-544
Kunststoffbehälter (verschiedene Größen)ZiplocAmazonUnterbringung von Planarien in statischer Kultur
NatriumazidSigmaS2002
TransferpipetteGlobe Scientific138030
Pinzette - Dumont Pinzette, Typ 5Elektronenmikroskopie 72700-D (0203-5-PO)
Triton X-100SigmaT8787
DAPI ThermoFisher62247
Streptavidin, Alexa Fluor 488 KonjugatThermoFisherS11223
GlycerinFisher BioReagenzienBP229-1

Referenzen

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