Method Article

Size Matters: Messung des Durchmessers der Kapsel in Cryptococcus neoformans

DOI:

10.3791/57171

⸱

February 27th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Middle Tennessee State University, 2DRVision Technologies

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Polysaccharid-Kapsel ist die primäre Virulenzfaktor in Cryptococcus Neoformans, und seine Größe korreliert mit Stamm Virulenz. Kapseldurchmesser Messungen dienen phänotypische Tests und therapeutische Wirksamkeit abzuschätzen. Hier ist eine Standardmethode zur Kapsel Induktion vorgestellt, und zwei Methoden der Färbung und Messung Durchmesser verglichen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Polysaccharid-Kapsel von Cryptococcus Neoformans ist die primäre Virulenzfaktor und eines der wichtigsten Aspekte dieser Pathogene Hefe allgemein untersucht. Kapsel Größe kann sehr unterschiedlich zwischen den Stämmen, hat die Fähigkeit, schnell zu wachsen, wenn Stress oder niedrigen Nährstoffverhältnisse eingeführt und wurde positiv korreliert mit Stamm Virulenz. Aus diesen Gründen ist die Größe der Kapsel von großem Interesse für C. Neoformans Forscher. Das Wachstum der C. Neoformans Kapsel induziert wird während der phänotypischen Tests, um die Auswirkungen der verschiedenen Behandlungen auf der Hefe oder Größe Unterschiede zwischen Stämmen zu verstehen. Hier beschreiben wir eine der Standardmethoden der Kapsel Induktion und vergleichen zwei anerkannten Methoden der Färbung und Messung Kapseldurchmesser: (i) Tusche, einen negativen Fleck, verwendet in Verbindung mit konventionellen Lichtmikroskopie und Färbung (Ii) zusammen mit fluoreszierende Farbstoffe der Zellwand und Kapsel gefolgt von konfokalen Mikroskopie. Endlich, wir zeigen, wie Messung der Kapseldurchmesser aus Indien blau gefärbten Proben mittels computergestützten Bildanalyse automatisiert.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jedes Jahr eine Viertel Million Menschen betroffen, und was mehr als 180.000 Todesfälle jährlich, ist Cryptococcus Neoformans , Pathogene, intrazelluläre Hefe und dem Erreger der Kryptokokkose1,2, 3. am stärksten betroffen sind HIV-infizierte Patienten in armen Ländern, die nicht Zugang zu antiretroviralen Therapie, so dass sie sehr anfällig für die Krankheit4,5,6. Daten aus der CDC zeigen, dass in Subsahara-Afrika, C. Neoformans mehr Menschen als durch Tuberkulose jährlich und mehr pro Monat als jede Ebola-Ausbruch auf Rekord1tötet. Der häufigste Weg der Exposition erfolgt durch das Einatmen von ausgetrockneten Sporen, die in der Umwelt7Gang und gäbe sind. Beim Betreten der Lunge, gibt es mehrere Virulenzfaktoren, die zum Erfolg von C. Neoformans innerhalb von infizierten Personen beitragen. Die Polysaccharid-Kapsel ist die Mikrobe primäre Virulenzfaktor, als Acapsular Stämme nicht virulente8sind.

Die Cryptococcus Kapsel besteht der drei Hauptkomponenten: Glucuronoxylomannan (GXM), Galactoxylomannan (GalXM) und Mannoproteins (MPs)9. Während MPs eine relativ geringe Zellwand-assoziierte Komponente der Kapsel sind, sie sind immunogen und vor allem Pro-inflammatorische Reaktion9,10fördern können. Im Gegensatz dazu GXM und GalXM machen den größten Teil der Kapsel (> 90 % nach Gewicht) und immunsuppressive Effekte11haben. Neben seiner immunmodulatorische Effekte schafft die rasche Erweiterung der Kapsel in Vivo eine mechanische Barriere zur Einnahme von Host phagocytic Zellen (d.h., neutrophilen Granulozyten und Makrophagen)12. C. Neoformans Kapsel und seine Synthese sind komplex, aber insgesamt, erhöhte Kapseldurchmesser korreliert mit erhöhter Virulenz6,13,14. Angesichts dieser Tatsache ist es wichtig für C. Neoformans Forscher in der Lage sein, schnell und präzise Kapsel Messungen zu quantifizieren.

C. Neoformans Zelle und seine Polysaccharid-Kapsel sind dynamische Strukturen und Veränderungen über Zeit15zeigen. Die Kapsel kann in Dichte, Größe und Montage als Reaktion auf Änderungen in der Host-Umgebung16,17,18ändern. Eisenarme oder Nährstoffgehalt, Exposition gegenüber Serum, die menschlichen physiologischen pH-Wert und erhöhte CO2 sind bekannt, Kapsel Wachstum16,18,19,20zu initiieren. Darüber hinaus haben Forscher gezeigt, strukturelle Veränderungen zu erheblichen Unterschieden bei der Immunoreactivity während einer Infektion, Kreditvergabe einen Vorteil zu C. Neoformans gegenüber seinen Wirt21,22. Dies ist bekannt, weil die Architektur der C. Neoformans Kapsel in eine Vielzahl von Möglichkeiten analysiert wurde. Elektronenmikroskopie, hat beispielsweise ergeben, dass die Kapsel eine heterogene Matrix mit einer inneren Elektron-dichte Schicht unter einer äußeren, durchlässiger Schicht23 hat. Lichtstreuung und die Verwendung von optischen Pinzette konnten Forscher der makromolekularen Eigenschaften24weiter aufzuklären. Analyse der Ergebnisse aus beiden Messungen statische und dynamische Lichtstreuung, wissen wir, dass die Polysaccharid-Kapsel einen komplexen verzweigten Struktur23 hat. Optische Pinzette wurden zur Testen der Steifigkeit der Struktur sowie die Bewertung ihrer Antikörper Reaktivität24. Allerdings ist bei weitem die am häufigsten eingesetzten Analyse der C. Neoformans Kapsel die Messung seiner Größe.

Quantifizierung der Kapsel Größe Forscher nutzen, was eine einfache Messung sein sollte: die lineare Durchmesser der Kapsel. Digitale Mikroskope werden verwendet, um Bilder von mehreren Zellen in C. Neoformans (in der Regel Hunderte) mit Tusche oder Fluoreszenz-Farbstoffen gefärbt zu erfassen. Die Größe der einzelnen Zelle Körper und umgebenden Kapsel wird gemessen. Die Daten werden zusammengestellt, und der mittlere Durchmesser der Kapsel wird durch Subtrahieren des Zellkörper Durchmesser aus der ganzen Zelle Durchmesser (Zellkörper + Kapsel) berechnet. Bis zu diesem Zeitpunkt wurden diese Messungen manuell durchgeführt. Obwohl in der Regel genau, hat diese Methode Nachteile für Forscher. Großer Datenmengen können Tage oder sogar Wochen, von hand zu analysieren. Und da diese Messungen manuell erfolgen, Subjektivität und menschliches Versagen das Ergebnis beeinflussen können.

Automatisierte, computergestützte Bildanalyse ist ein unverzichtbares Werkzeug für Wissenschaftler in vielen Bereichen der molekularen Zellbiologie, ermöglicht schnellere und zuverlässigere Analyse von biologischen Bilder 25,26,27geworden. Genaues Bild-Analyse-Techniken sind notwendig, um quantitative Informationen aus was oft komplex und immense Datenmengen sind von mir. Allerdings wurden einige Messungen, insbesondere die Messung der C. Neoformans Kapsel, schwer zu automatisieren. Genaue Identifizierung der Schnittstelle zwischen der Zellwand und der Kapsel, die in der Regel als einen dunklen Ring, wenn Phasenkontrast-Mikroskopie abgebildet angezeigt wird, kann zur Lösung mit einem einfachen Schwellenwert lästig sein. Weitere, C. Neoformans Zellen in Kultur tendenziell verklumpen und genaue Segmentierung der Zellen ist notwendig für genaue Messungen.

Das Ziel dieses Projektes war es, (i) eines der Standardprotokolle für Kapsel Induktion in C. Neoformans (Ii) vergleichen und Tusche zu veranschaulichen und Fluoreszenz Färbung wie sie betreffen um Durchmesser Messungen, Kapsel (Iii) entwickeln einfache, Berechnungsmethoden Kapseldurchmesser mit Bildern von Tusche gefärbten Zellen mit einer Bildanalyse-Software und (iv) messen bewerten die vor- und Nachteile Kapseldurchmesser manuell messen und mithilfe der Automatisierung von Software. Wir finden, dass die beiden Färbung Methoden, fluoreszierende Kennzeichnung der Zellwand und Kapsel, während mehr Zeit in Anspruch, die konstantesten Ergebnisse zwischen Experimente. Aber beide Methoden konnten wir erfolgreich zu unterscheiden zwischen Labor und klinische C. Neoformans Kapsel Stämme mit verschiedenen Größen. Darüber hinaus konnten wir die Messung der Kapseldurchmesser von Tusche gefärbten Bilder zu automatisieren und fand, dass dies eine echte Alternative zur manuellen Messung der Kapsel.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hinweis: C. Neoformans ist ein Biosafety Level 2 (BSL-2) Erreger und Forscher arbeiten müssen angemessene Vorsichtsmaßnahmen ergreifen. Verfahren detailliert auf wie zu sicher Arbeit mit BSL-2 Krankheitserreger auf das Center for Disease Control (CDC) gefunden werden kann Website, aber es ist wichtig zu beachten, dass alle Personen, die Kontakt mit C. Neoformans im Umgang geschult werden sollte Krankheitserreger und sollte immer tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA), in der Regel Latex oder Nitril-Handschuhe. Darüber hinaus sollten Rotoren auf Zentrifugen versiegelt sein, um Aerosolization von Proben und Leckagen sofort mit einem 10 % Bleichmittel-Lösung-28aufgeräumt zu verhindern.

(1) Kapsel Induktion

Hinweis: Alle Schritte sollte bei Raumtemperatur durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben.

  1. C. Neoformans in Hefe Pepton Traubenzucker (YPD) Brühe (pH 6,5 +/-0,2) Kultur und Inkubation bei 37 ° C mit schütteln, bis sie im Log-Phase (ca. 18-36 h) sind.
  2. Zentrifugieren Sie Zellen bei 870 X g für 5 min bei 21 ° C und waschen Sie dreimal mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
  3. Verwenden Sie ein Hemocytometer (oder eine automatisierte Zelle-Zähler), um die Zellen zu zählen und bei 2 x 105 Zellen/2 mL in Dulbeccos minimalen wesentlichen Medien (DMEM) Aufschwemmen.
  4. Um die Kapsel zu induzieren, Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2 für 18 h.
    Hinweis: Die Kombination aus fehlender Nährstoffe in den Medien und die Anwesenheit von CO2 stimuliert C. Neoformans Kapsel Wachstum.
  5. Nach Inkubation der Zellen durch Zentrifugieren (wie oben) und entfernen alle, aber 5-10 µL überstand zu ernten. Zum gleichen Zeitpunkt ernten Sie einen entsprechenden UN-induzierte Zellprobe für jede Belastung gemessen werden. Verwenden Sie diese als Negativkontrollen.
    Hinweis: Die Zelle-Pellets werden sehr klein sein und möglicherweise schwer zu erkennen. Seien Sie vorsichtig beim Absaugen von überstand.
  6. Färben Sie mit Tusche (Abschnitt 2.1) oder fluoreszierende Farbstoffe (Abschnitt 2.2).

2. Färbung

  1. Färbung mit nur Tusche
    1. Um die Hefe mit Tusche Flecken, Aufschwemmen der Pellets im restlichen überstand und fügen 4μL (etwa die Hälfte) der Zellsuspension und 4μL der Tusche auf einen Glas-Objektträger. Vorsichtig mischen und Schaumbildung zu vermeiden.
    2. Wenden Sie ein 13-mm-Glas-Deckglas (#1.5 Dicke) und versiegeln Sie der Kanten mit einem ungiftigen Dichtstoff (klarer Nagellack) die Probe vor dem Austrocknen zu verhindern.
  2. Färbung mit Fluoreszenz-Farbstoffen
    1. Um die Hefe mit einem fluoreszierenden Farbstoff Fleck, Aufschwemmen der Zelle Pellet in 50 µL PBS mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA).
    2. Die Kultur mit ein gleiches Volumen von Calcofluor White (CFW) inkubieren (1 µg/mL) und Kapsel mAb 18B7 (siehe Tabelle der Materialien) konjugiert, AlexaFluor488 (AF488) (10 µg/mL) für 30 min bei 37 ° C.
    3. Zentrifugieren Sie Zellen bei 870 X g für 5 min bei 21 ° C nach Inkubation und aspirieren Sie überstand.
    4. Aufschwemmen Sie Zelle Pellet in 10 µL PBS mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA).
    5. Pipette 8 µL Zellsuspension auf einen Glas-Objektträger.
    6. Wenden Sie ein 13-mm-Glas-Deckglas (#1.5 Dicke) und versiegeln Sie der Kanten mit einem ungiftigen Dichtstoff (klarer Nagellack) die Probe vor dem Austrocknen zu verhindern.
  3. Färbung mit Tusche und fluoreszierende Farbstoffe
    1. Um die Wirksamkeit der Tusche Färbung mit der Fluoreszenz-Farbstoffen mehr direkt zu vergleichen, Co Flecken der gleichen Zellpopulation mit beiden Arten von Flecken. Dazu zuerst inkubieren Sie Zellen mit einem fluoreszierenden Kapsel und die Zellwand Fleck nach Schritte 2.2.1 - 2.2.3.
    2. Als nächstes pipette gleiche Volumina (4 µL) der Fluoreszent gefärbt Zellsuspension und Tusche auf einen Objektträger. Mischen Sie vorsichtig.
    3. Wenden Sie ein 13-mm-Glas-Deckglas (#1.5 Dicke) und seal die Ränder mit einem ungiftigen Dichtstoff (klarer Nagellack) die Probe vor dem Austrocknen zu verhindern.

3. Image Acquisition/Mikroskopie

  1. Imaging-Zellen befleckt mit Tusche.
    1. Bilder mit einem standard Lichtmikroskop (100 X Vergrößerung) zu erwerben.
    2. Bild ein Minimum von 50 Zellen pro Zustand.
      Hinweis: Die Anzahl der Zellen pro Feld variiert, und dies ist akzeptabel. Wichtig ist jedoch, dass überlappende Zellen auf ein Minimum gehalten werden, da diese schwer zu messen (sowohl manuell als auch mit automatisierten Software) sind. Für diese Experimente wurden Bilder in einer Tiefe von 16 Bits mit Belichtungszeiten um Bildkontrast zu maximieren bei gleichzeitiger Minimierung der Bewegungsunschärfe durch kleine Bewegungen der Zellen optimiert erworben.
  2. Imaging-Zellen mit Fluoreszenz-Farbstoffen gefärbt
    1. Um die Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie Bild, öffnen Sie das Mikroskop imaging-Software und wählen Sie die entsprechende Anregung und Emission Wellenlängen für die Fluorophore verwendet (CFW und AF488 sind begeistert mit dem 405nm und 488 nm Lichter bzw.). Abrufen von Bildern mit einem Fluoreszenzmikroskop.
    2. Bild ein Minimum von 50 Zellen pro Zustand.
      Hinweis: Die Anzahl der Zellen pro Feld variiert, und dies ist akzeptabel. Wichtig ist jedoch, dass überlappende Zellen auf einem Minimum gehalten werden, da diese schwer zu messen (sowohl manuell als auch mit automatisierten Software) sind.
    3. Erwerben Sie ein Z-Stapel-Bildserien der Zellen, um sicherzustellen, dass die maximale Kapseldurchmesser für jede Zelle in einem bestimmten Bereich erreicht wird.
      1. Klicken Sie in der Mikroskop-Steuerungssoftware auf die "Z-Stack", öffnen Sie das Bedienfeld "Z-Stack", dann wählen die Option "Erste/letzte" in der oberen linken Ecke des Fensters.
      2. Verwenden Sie die Geldbuße Fokuskontrolle am Mikroskop zu konzentrieren, auf einem Niveau, das unter dem breitesten Punkt einer einzigen Hefezelle und die Kapseln für alle in der aktuellen Blickfeld und klicken Sie auf "First Set".
      3. Die Geldbuße Fokuskontrolle sich oberhalb der breitesten Stelle der Zellkörper der gleichen Zelle und der Kapsel für alle Zellen in der aktuellen Blickfeld und klicken Sie auf "Letzte gesetzt".
      4. Klicken Sie "Start-Experiment" im Register "Übernahme" den Z-Stack für die aktuelle Position zu erwerben. Wiederholen Sie den Vorgang an mehreren Positionen bis Z-Stapel Bilder von mindestens 50 Zellen erworben wurden.
        Hinweis: Für diese Experimente die konfokale Lochblende wurde gegründet um 1.0 AU und eine überlappende Z-Serie von 10-20 Scheiben für 0,7 µM wurden an ausgewählten Positionen übernommen. AU = luftig-Einheit.
    4. Als nächstes wandeln Sie jede Z-Stapel-Serie in höchster Intensität Projektionen (MIP) mit entsprechenden Bildanalyse-Software.
      Hinweis: MIPs Projekt die größte Intensität auf jeder Ebene der gestapelten Bild29. Erstellen von MIPs ermöglicht eine 2-D-Darstellung der Bilder zu produzieren, die die maximale Zell- und Kapseldurchmesser innerhalb des aufgenommene 3-d-Stapels entsprechen.
  3. Imaging-Zellen mit Tusche und Fluoreszenz-Farbstoffen gefärbt
    1. Abrufen von Bildern mit einer Weitfeld (40 X Vergrößerung) oder confocal Mikroskop (63 X oder 100 X Vergrößerung). Für Zellen mit Tusche und Fluoreszenz-Farbstoffen gefärbt die Aufnahmen Sie mit einem Weitfeld-Mikroskop mit computergesteuerten Bühne und Öl eintauchen Ziel ausgestattet.
      Hinweis: Das Mikroskop im Einsatz sollte über eine imaging-Software CFW gesteuert werden. Fluoreszenz, die freut sich über einen 340-380 nm Anregung Filter und emittiert Licht sollten durch einen 435 485 nm Barriere Filter von 400 nm dichroitischen Spiegel reflektiert erkannt werden. AF488 Fluoreszenz kann durch einen 465-495 nm Anregung Filter begeistert sein, und durch einen 515-555 nm Barriere Filter von 505 nm dichroitischen Spiegel reflektiert abgestrahlten Lichts detektiert werden.
    2. Bild ein Minimum von 50 Zellen pro Bedingung für jede Färbung Methode.

4. manuelle Messung der Kapsel

  1. Für Zellen befleckt mit Tusche oder fluoreszierende Flecken, verwenden Sie eine Zelle Messsoftware, manuell Kapsel und Zelle Durchmesser messen (siehe Tabelle der Materialien). Um dies zu tun, gehen Sie auf "Datei" > "Bild öffnen" > "Messen" und Verwendung der Cursor zum Zeichnen einer geraden Linie durch den breitesten Punkt der ganzen Zelle (Durchmesser).
  2. Als nächstes klicken Sie erneut auf "Messen" und zeichnen Sie eine gerade Linie durch die Zellkörper (Zellkörper Durchmesser).
    Hinweis: Messungen sind auf die Zellen automatisch gespeichert.
  3. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Zellen (mindestens 50/Gruppe).
  4. Um Bilder zu speichern wenn sie gemessen werden, klicken Sie auf "Datei" > "Speichern unter" und benennen Sie die Bilder entsprechend.
  5. Wählen Sie die neu gemessenen Dateien und exportieren Sie Daten in eine Tabellenkalkulation.
  6. Die durchschnittliche Kapseldurchmesser mithilfe der Gleichung zu berechnen: ([Durchmesser] - [Zellkörper Durchmesser]).

5. automatische Messung der Kapsel

Hinweis: Verwenden Sie für erfolgreiche automatisierte Messung, 16-Bit-Bilder mit hohem Kontrast und die sind richtig scharf zusammen mit einer entsprechenden Bildanalyse-Software (siehe Tabelle der Materialien). Beim C. Neoformans für Kapsel Messung abbilden, ist es wichtig, im Mittelpunkt der dunkle Ring an der Grenze zwischen der Zellwand und der Kapsel. Dies ermöglicht die Software, die Zelle und die Kapsel richtig abzugrenzen.

  1. Umkehren und erstellen Sie eine Kopie aller Tusche gefärbten Zelle Bilder mit einem geeigneten Bildbearbeitungs-Software (siehe Tabelle der Materialien). Um dies zu tun, klicken Sie auf "Datei" > "Öffnen" Tusche gefärbten Bilder öffnen und dann "Control" + "I", um das Bild invertieren. Klicken Sie auf "Datei" > "Speichern unter" um das umgekehrte Bild zu speichern.
  2. Importieren Sie die ursprüngliche und invertierte Bilder in die Software klicken Sie auf "Datei" > "Sequenz importieren" > "Load Image" > "Definieren Sequence (manuell)" > "Dimensionen (Kanal)" > "Importieren" > "Übernehmen".
    Hinweis: Die C. Neoformans Zellkörpern und Kapseln identifiziert werden können und maskiert, mit speziellen Algorithmen - bezeichnet als "Rezepte" - in der Software enthalten.
  3. Verwenden Sie das Rezept "Kolonie Analyzer (Fluoreszenz)" auf das umgekehrte Bild zu erkennen und zu maskieren Zellkörper, dann klicken Sie auf "anwenden". Der dunkle Ring definieren die Grenze der C. Neoformans Zelle wird in das umgekehrte Bild heller als die umgebende Kapsel.
  4. Verwenden Sie das 'Kolonie Analyzer (Fluoreszenz)' Rezept auf das umgekehrte Bild segmentieren die C. Neoformans Zellkörpern aus ihren Kapseln, dann klicken Sie auf "anwenden". Dadurch entsteht eine Graf-Maske. Benennen Sie diese Anzahl Maske "Zellkörper" durch Rechtsklick auf die Karteikarte "Graf Maske".
    Hinweis: Das Rezept besteht aus mehreren Verarbeitungsschritten Bild: Hintergrund entfernen, Objekterkennung, Objekt-Trennung und Teilmenge zu filtern.
  5. Als Nächstes verwenden Sie das Rezept "Zellproliferation" auf das ursprüngliche Bild zu erkennen und die Kapsel zu maskieren, und klicken Sie auf "anwenden". Dadurch entsteht eine Graf-Maske. Benennen Sie diese Anzahl Maske "Kapsel" durch Rechtsklick auf die Karteikarte "Graf Maske".
  6. Mit dem Rezept "Kapsel Partition", erstellen Sie eine neue Maske auf das Originalbild, angrenzende Kapseln voneinander zu partitionieren. Um dies zu tun, klicken Sie auf "Kapsel Partition" aus dem Dropdown-Menü Rezept. Wählen Sie im Feld Kapsel Partition die nun umbenannte Graf Maske "Kapsel" (5,5) für Kapsel Region. Wählen Sie die nun umbenannte Graf Maske "Zellkörper" Crypto-Zellen (5.4). Wählen Sie "Original" für den Eingangskanal und "Create Mask für Partitioned Kapsel. Klicken Sie auf "anwenden
    Hinweis: Das Rezept erzeugt Zelle und Kapseldurchmesser, definiert als der Mittelwert über die längste und kürzesten Achsen über der Mitte der Zelle und Kapsel und Flächenmaße vom Erkennung Masken. Finden Sie die Ausgabe, die unter der Registerkarte "Tabelle" in dieser Software befindet. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Bilder (mindestens 50 Zellen/Gruppe). Das Rezept Parameter konnte optimiert, um die Erkennung einzelner Bilder zu optimieren oder für Batch-Erkennung von mehreren Bildern optimiert. Weitere Messungen können durch das Rezept für umfassende Charakterisierung der Zelle und die Kapsel Morphologie berechnet werden.
  7. Exportieren Sie Daten in einem Tabellenkalkulations-Software der Wahl für die weitere Analyse.

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Results

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Zur Veranschaulichung der Kapsel Induktion, Zelle Färbung, Bildverarbeitung und Messtechnik verwendet wir drei Stämme von C. Neoformans: das gemeinsame, gut charakterisierte Labor Stamm, H99S30und zwei klinisch isolierten Stämme der zuvor unbekannte Kapseldurchmesser, B18 und B5231.

Abbildung 1Azeigt der Workflow der Kapsel Induktion, Färbung ...

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Discussion

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Die Kapsel ist seit Jahrzehnten ein wichtiger Schwerpunkt der Forschung für Mykologen und Kliniker C. Neoformans und Kryptokokkose wegen seiner Rolle als Virulenzfaktor der großen der Erreger interessiert. Mit Mikroskopie zu können messen Kapsel Größenunterschiede zwischen den Stämmen und unter verschiedenen Wachstum Bedingungen wichtigen Informationen über den Erreger und seine Reaktionen auf verschiedene Reize (z.B. unterschiedliche Umweltbedingungen mögliche medikamentöse Behandlungen, etc.)...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Autor, Hoyin Lai, ist der Produktmanager bei DRVision, die die automatisierte Bildanalyse-Software Aivia veröffentlicht.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken der molekularen Biowissenschaften (MOBI) Doktorat und die Biologie-Abteilung am Middle Tennessee State University (MTSU) für die Bereitstellung der Mittel für diese Studie. Das Projekt wurde auch teilweise durch eine spezielle Projekte Stipendium, D.E.N. die MTSU Foundation finanziert.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Capsule Induction
C. neoformans cellsDer klinische Laborstamm H99S war ein freundliches Geschenk von Dr. John Perfect (Duke University).  Die klinischen Stämme B18 und B52 waren freundliche Geschenke von Dr. Greg Bisson (University of Pennsylvania).
Hefe-Pepton-Dextrose-Bouillon (YPD)Fisher ScientificDF0428-17-5
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)Dies wird im Labor unter Verwendung eines Standardrezepts (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)
DMEM/hoher Glukosegehalt mit L-Glutamin, ohne NatriumpyruvatGE Life SciencesSH30022.01
6-Well-PlattenFalconCL5335-5EA
Schüttel-InkubatorThermo ScientificMaxQ6000
CO2-InkubatorFisher ScientificIsotemp
ZentrifugeThermo ScientificLegend XTR
Staining
MicrocentrifugeThermo ScientificLegend Micro 21R
TuscheFisher Scientific14-910-56
Calcofluor weißerSigma-Aldrich18909-100ML-F
18B7 Maus-Anti-GXM-Antikörper, konjugiert mit Alexafluor 488Ein freundliches Geschenk von Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) 
PBS mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA)PBS ist die gleiche Rezeptur, die oben (Zeile 4) aufgeführt ist, mit 1 % BSA hinzugefügt und mit Filter sterilisiert.
RinderserumalbuminSigma-AldrichA9418
Superfrost ObjektträgerFisher Scientific12-550-143
GlasdeckgläserCorning2855-18#1,5 Dicke
Klarer Nagellack oder anderes ungiftiges Dichtungsmittel
Bildaufnahme 
ImmersionsölCargille 16484
Lichtmikroskop mit ImmersionsölobjektivZeissZeiss Axio A1 mit Plan - NEOFLUAR 100x Ölimmersion NA 1.30 Objektiv
Lichtmikroskop KameraZeissZeiss Axiocam ErCD Kamera
Konfokales Mikroskop mit ÖlimmersionsobjektivZeissLSM 700 Laserscanning konfokal, ausgestattet mit einem Plan-Apochromat 63X NA 1.4 Ölimmersion DIC M27 Objektiv.& nbsp;
Konfokalmikroskop-SoftwareZen 2009
Konfokale MikroskopkameraNikonNikon Ti-Eclipse mit Intensilight Epifluoreszenzbeleuchtung (Nikon), CoolSNAP MYO Mikroskopkamera (Photometrie), Plan Apo 60x NA 1,40 Ölimmersionsobjektiv (Nikon) und 1,5-fach Vergrößerungswechsler.
Weitfeld-BildgebungssoftwareNikon Elements (Nikon)
Capsule Measurement
BildbearbeitungssoftwarePhotoshop (Adobe)
Mikroskop-Software für manuelle MessungenAxiovision (Carl Zeiss)
Bildanalyse-Software für die automatisierte MessungAivia (DRVision Technologien)
TabellenkalkulationssoftwareExcel (Microsoft)

References

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