Bildung von kovalenten DNA Addukte durch enzymatisch aktivierten Karzinogene und Drogen In Vitro und ihre Entschlossenheit von 32P-postlabeling

Zusammenfassung

Bewertung der Wirksamkeit des Umweltchemikalien und Drogen, enzymatisch, zu sein Bioactivated, Zwischenprodukte, die Generierung von kovalenten DNA Addukte, ist ein wichtiger Bereich bei der Entwicklung von Krebs und seine Behandlung. Für zusammengesetzte Aktivierung zu bilden werden Methoden beschrieben, die DNA-, die sowie Techniken für die Erkennung und Quantifizierung Addukten.

Zusammenfassung

Kovalenten DNA Addukte gebildet durch Chemikalien oder Drogen mit krebserzeugenden Potenz sind als einer der wichtigsten Faktoren in der Initiierungsphase krebserzeugende Prozesse beurteilt. Diese kovalente Bindung, die die Ursache der Tumorgenese angesehen wird, wird nun als ein zentrales Dogma der chemischen Karzinogenese ausgewertet. Hier werden Methoden beschrieben, mit den Reaktionen, die durch Cytochrom P450 katalysiert und zusätzliche Biotransformation Enzyme zu untersuchen, die Potenz von Chemikalien oder Medikamente für ihre Aktivierung Metaboliten bilden diese DNA Addukte. Verfahren werden vorgestellt, beschreibt die Isolation der zellulären Fraktionen besitzen Biotransformation Enzyme (mikrosomale und cytosolischen Proben mit Zellfarbstoffe P450 oder anderen Biotransformation Enzymen, d. h., Peroxidasen, NADPH: Cytochrom P450 Oxidoreductase, NAD (P) H:quinone Oxidoreductase oder Xanthin-Oxidase). Darüber hinaus werden Methoden beschrieben, kann für die Stoffwechselaktivierung analysierten Chemikalien durch diese Enzyme sowie zur Isolierung von DNA verwendet werden. Darüber hinaus die entsprechenden Methoden zur Erkennung und Quantifizierung von Chemie-/Drogen-abgeleitete DNA Addukte d.h.verschiedene Modifikationen der ³²P-postlabeling-Technik und Einsatz von radioaktiv-markierten analysiert, Chemikalien, sind detailliert dargestellt.

Einleitung

Der Stoffwechsel von Xenobiotika (Umweltchemikalien oder Drogen) erfolgt in zwei Phasen¹. Phasen I und II sollen die ursprünglich hydrophoben (nicht wasserlöslichen) Verbindungen mehr hydrophile Rendern (wasserlöslich), wodurch sie leicht excretable über Urin, Kot oder Schweiß. Phase-I-Reaktionen (Funktionalisierung) gehören Oxidation, Reduktion, und Hydroxylierung katalysiert durch Enzyme wie Cytochrom P450s (P450s, CYPs), Peroxidasen (i.e., Cyclooxygenase COX), Aldo-Keto Reduktasen (AKRs) und mikrosomale Flavin-haltigen Monooxygenases (RGV). Phase I beinhaltet auch Reduktionsreaktionen, vermittelt durch eine Vielzahl von Reduktasen <....

Protokoll

Alle Tierversuche wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den Vorschriften für die Pflege und Verwendung von Labortieren (311/1997, Ministerium für Landwirtschaft, Tschechien), die in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki ist.

1. Isolierung der hepatischen mikrosomale und cytosolischen Brüche

1. Bereiten Sie Leber subzellularen Brüchen (Microsomen reich an P450 Enzyme oder Cytosols reich an Reduktasen oder lösliche Peroxidasen) von Ratten durch einfache differentielle Zentrifugation (105.000 X g).
   Hinweis: Das Pellet und überstand sind Microsomen sowie Cytosols, bzw. übernommen.
   1. Waschen Sie die Leber....

Ergebnisse

Verwenden die Protokolle für den Einsatz von Enzym-katalysierten Aktivierung (d. h. P450, Peroxidase und Reduktase) beschriebenen um zu Potenz von Chemikalien (Karzinogene/Drogen) zu untersuchen, um zu Zwischenprodukten, die wiederum ihre kovalente verstoffwechselt werden Bindung an DNA (Erzeugung von DNA-Addukten), konnten wir zu beheben (i) einen neuartigen Wirkmechanismus die pharmakologische Wirkung des Anti-Krebs-Agent-Ellipticine (für einen Beitrag sehen,^2.......

Diskussion

In diesem Papier wird demonstriert, dass eine allgemein zugängliche Methodik die Potenz von Chemikalien, Bioactivated, metabolische Zwischenprodukte, was Generation von kovalenten DNA sein Studium Addukte. Dies ist eine entscheidende Frage, denn Bewertung der Potenz von Umweltchemikalien oder Drogen deren enzymatische Aktivierung Metaboliten, die Generierung von kovalenten DNA Addukte ist ein wichtiger Bereich bei der Entwicklung von Krebs und seine Behandlung. Die Veränderung der DNA durch Karzinogene, die als der Ursac.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Tris	Sigma-Aldrich	252859
Kaliumchlorid	Sigma-Aldrich	P9541
Natriumacetat	Sigma-Aldrich	S2889
Phenol	Roth	0032.8
Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol	Roth	A156.1
Ethanol	Penta	70390-11000
Thymus-DNA für Kälber	Sigma-Aldrich	D4522
NADH	Sigma-Aldrich	N7004
NADP+	Sigma-Aldrich	N5755
NADPH	Sigma-Aldrich	N7505
D-Glucose-6-phosphat	Sigma-Aldrich	7647001
D-Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase	Sigma-Aldrich	G6378
Supersomen	Corning Gentest	456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Menschliche Lebermikrosomen	Corning Gentest	452172
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Hypoxanthin	Sigma-Aldrich	77662
2-Hydroxypyrimidin	Sigma-Aldrich	H56800
Ethylacetat	Sigma-Aldrich	437549
Diethylether	Sigma-Aldrich	179272
Mikrokokkennuklease aus Staphylococcus aureus	Sigma-Aldrich	N3755
Milzphosphodiesterase aus Kalbsmilz, Typ II	Calbiochem	524711
Nuklease P1 aus Penicillium citrinum	Sigma-Aldrich	N8630
Bicine	Sigma-Aldrich	163791
DL-Dithiotreitol	Sigma-Aldrich	D0632
Spermidin	Sigma-Aldrich	S2626
Tetrabutylammoniumchlorid	Sigma-Aldrich	86870
n-Butanol	Sigma-Aldrich	437603
T4-Polynukleotidkinase	USB Corp	70031Y
[γ-32P]ATP	Hartman Analytic GmbH	FP-201
PEI-imprägnierte Zellulose-DC-Platten	Macherey-Nagel	801053
Packard Instant Imager A202400	Packard	G120337
Ellipticin	Sigma-Aldrich	285730
3-Nitrobenzanthron,	hergestellt (synthetisiert), wie in Ref. 40

gezeigt