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Zwei-Photon intravitalen Bildgebung der Leukozyten im Rahmen der Immunantwort in Lipopolysaccharid behandelt Maus Leber

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DOI:

10.3791/57191

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6. Februar 2018

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1Department of Anatomy, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 Plus Project for Medical Science, Yonsei University College of Medicine, 3Department of Surgery, Yonsei University College of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir haben eine neuartige chirurgische Protokoll für die zwei-Photonen-Bildgebung live Mäuse Leber mit minimaler Invasion. Mit dieser Technik haben wir die detaillierte Struktur der Leber während Lipopolysaccharid-induzierte Endotoxämie identifiziert. Wir erwarten, dass diese Methode verwendet werden, kann um die Wirksamkeit der verschiedenen Reagenzien Behandlung zur hepatischen Leukozyte Migration zu bestimmen.

Zusammenfassung

Sepsis ist eine schwere Infektion, die Organversagen und Gewebe verursachen kann Schaden. Obwohl die Mortalität und Morbidität Preise im Zusammenhang mit Sepsis sind extrem hoch, keine direkte Behandlung oder im Zusammenhang mit der Orgel Mechanismus wurde ausführlich in Echtzeit geprüft. Die Leber ist das zentrale Organ, das Gifte und Infektionen im menschlichen Körper steuert. Hier wollten wir intravitalen Bildgebung der Maus Leber nach Induktion der Endotoxämie durchführen, um die Beweglichkeit der Immunzellen, wie Neutrophilen und Leber Kapsel Makrophagen (LCMs) verfolgen. Dementsprechend haben wir eine neuartige Operationsmethode für die Exposition der Leber mit minimal-invasiven Chirurgie entwickelt. Mäuse wurden mit Lipopolysaccharid (LPS), eine gemeinsame Endotoxin intraperitoneal injiziert. Mit unserer neuen chirurgischen Ansatz für Belichtung und intravitalen Bildgebung der Leber, wir fanden, dass die Neutrophilen Maus Rekrutierung in LPS behandelten LysM-grün fluoreszierenden Proteins (GFP) wurde Maus Leber erhöht im Vergleich mit dem in Phosphat-gepuffert Leber mit Kochsalzlösung behandelt. Nach LPS-Behandlung stieg die Zahl der Neutrophilen deutlich mit der Zeit. Darüber hinaus visualisiert mit Hilfe von CX3Cr1-GFP-Mäusen, wir erfolgreich Leber residente Makrophagen genannt LCMs. Daher kann um die Wirksamkeit der neuen Reagenzien zur Steuerung immun Mobilität in Vivozu untersuchen, Bestimmung der Motilität und Morphologie der Neutrophilen und LCMs in der Leber wir therapeutische Wirkung im Organ Versagen und Gewebe Schäden durch identifizieren können Leukozyten-Aktivierung bei Sepsis.

Einleitung

Die Leber ist der großen Stoffwechselorgan bei Säugetieren; Es fungiert als ein Kontrollturm für Energie, Hormone und Entgiftung1. Aufgrund seiner Bedeutung haben Forscher um die Veränderungen in der Leber während einer Entzündung zu erhellen viele in Vitro und in Vivo Experimente durchgeführt. Intravitalen Mikroskopie wurde verwendet, um live-Bilder aus der Leber2 zu erfassen. In der Tat führte verschiedene Leber bildgebende Verfahren wurden2,3,4,5,6. Jedoch um einen vereinfachten chirurgischen Ansatz entwickeln und Stabilisierung der das Zielorgan und die Immunzellen, gestalteten wir ein einfaches Protokoll, das Forscher um minimieren Sie ihren Aufwand für die intravitalen Bildgebung führen können.

In dieser Studie führten wir eine stabile und neuartige bildgebende Kammer und chirurgische Technik, die verwendet werden könnte, um Blutungen und mögliche Infektionen zu minimieren. Wir bestätigen, dass die Leber für mehr als 2 h intakt geblieben. Mit dieser Methode haben wir erfolgreich Morphologien LCMs7 und Neutrophilen unter septischen Zustand identifiziert. Da diese Methode physikalische und biologische Störfaktoren wie Zittern und unerwartete Entzündung während chirurgischen Eingriffs minimiert wird, erwarten wir, dass diese Methode verwendet werden könnte, um akute Reaktionen der immunen Zellen in der Leber als Reaktion auf zu beobachten Reagenzien wie LPS.

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Protokoll

Alle Verfahren wurden gemäß den Richtlinien des institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss der Yonsei University College of Medicine, Korea durchgeführt. LysM-grün fluoreszierenden Proteins (GFP; Gfp / +) Mäuse8 und CX3Cr1-GLP (GLP / +)9 Mäuse im Alter von 8 bis 12 Wochen für intravitalen Bildgebung verwendet wurden. Alle chirurgischen Instrumente wurden autoklaviert und mit 70 % Alkohol desinfiziert.

(1) speziell angefertigte Maus Leber Bildgebung Kammer mit Support-tools

  1. Maus-Leber imaging-Kammer-Konstruktion
    1. Machen Sie eine Kammer der folgenden Größe für Maus Leber Bildgebung (Abbildung 1): innere Kammer (120 mm Länge × 160 mm Breite × 30 mm Höhe), Außenkammer (100 mm Länge × Breite 100 mm × 24 mm Höhe), Schrauben (Ф 3 mm × 30 mm Höhe), Nüssen (Ф 4 mm) , und Flügel-geformte Muttern (Ф 4 mm).
    2. Messen Sie die Aushärtung Agent und Elastomer Basis im Verhältnis 1:9 um insgesamt 120 g Silikon zu machen.
    3. Setzen Sie die Flüssigsilikon-Mischung in einem 250 mL Erlenmeyerkolben und vermischen Sie gut. Dann den Kolben in den Exsikkator gestellt und entfernen Sie Luftblasen für ca. 1 h unter Vakuum durch die Pumpe.
    4. Gießen Sie flüssiges Silikon-Mischung in eine speziell angefertigte Maus Kammer so hoch wie 10 mm Höhe und lassen Sie es Heilung für ein paar Tage (Abbildung 1A).
  2. Vorbereitung der Cover-Folien und die Leber Befestigung Bett
    1. Befestigen Sie an den Metallrahmen das Deckglas mit Silikonkleber. Für 1 Tag (Abbildung 1 b) trocknen lassen.
    2. Um das destillierte Wasser für das Wasser-Immersion-Objektiv effektiv zu halten, ist eine semipermanente Wasser blockierende Struktur unerlässlich. 1 mm Rundung Silikonkleber zu machen und über Nacht aushärten.
    3. Mischen Sie die Aushärtung Agent und Elastomer Basis und dann gießen Sie sie in eine 6-Well-Platte in einer Höhe von ca. 8-10 mm. Perform Aushärtung wie in 1.1.2-1.1.4 beschrieben.

2. Vorbereitung des LPS

  1. Bereiten Sie steril 1 × Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), die LPS-Pulver von Salmonella Enterica Serotyp Enteritidis zu verdünnen. (1 × PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4).
  2. Heizen Sie PBS im Wasserbad bei 37 ° C vor, und öffnen Sie vorsichtig die LPS Pulver Flasche (25 mg).
  3. Mit eine Pipettieren Hilfe, Gießen Sie sterilen PBS (5 mL) in die LPS Pulver Flasche und umrühren Sie vorsichtig oder auszusetzen Sie, die Lösung um die Stammlösung vorbereiten.
    Hinweis: Nach LPS Pulver verflüssigt wird, kann harte vortexen Luftblasen verursachen. Verhindern Sie, dass Luftblasen um Verlust zu minimieren, wenn Aliquote in 1,5 mL Röhrchen.
  4. Speichern Sie der LPS-Stammlösung bei −20 ° C und in LPS Injektionslösung ein 1 mg/mL zu verdünnen.
  5. Injizieren Sie 1 mg/mL-LPS-Lösung (20 mg/kg) in das Peritoneum nicht narkotisierten Maus mit einer 1-mL-Spritze. Injizieren Sie für das Tier Kontrolle die gleiche Menge an PBS.
  6. Warten Sie, bis 2 h für ausreichende Entzündungsreaktion.

3. Vorbereitung des Texas-rot Dextran, Blutgefäße zu beflecken

  1. Bereiten Sie zwei konische Rohre 15 mL und 10 mL sterile PBS.
  2. Texas-rot Dextran Pulver (25 mg) in 3 mL PBS verdünnen und gut vermischen. Übertragen Sie die Mischung auf eine leere 15 mL konische Rohr.
  3. Übertragen Sie die restlichen PBS (7 mL) auf die 15 mL konische Röhrchen mit Dextran-Mischung (3 mL).
  4. Verbinden Sie einen 0,45 µm-Spritze-Filter an der Spitze einer 10 mL Spritze. Die Spritze sollte die Nadel Filterwechsel.
  5. Filtern Sie die Dextran-Mischung (10 mL). Drücken Sie die Spritze gleichmäßig um Verschütten zu vermeiden.
  6. 500 µL 2,5 mg/mL Dextran-Lösung in das Licht blockiert 1,5-mL-Tube zu verzichten und bei −20 ° c lagern Einmal aufgetaut, Lagern Sie es bei 4° C.

4. chirurgische Verfahren

  1. Desinfizieren Sie den OP-Tisch und alle Instrumente, die mit 70 % Alkohol vor der Operation. Dann legen Sie die Werkzeuge für die Leberchirurgie und passen Sie die Heizplatte auf 37 ° C (Abb. 2A, B).
  2. Für die Anästhesie intraperitoneal Spritzen Sie die Mäuse mit 30 mg/kg Tiletamin/Zolazepam und 10 mg/kg Xylazin. Diese Lösungen können gemischt und verdünnt mit PBS-Puffer für die gleichzeitige Injektion. Bestätigen Sie Anesthetization durch leichtes Drücken der Zehe der Maus.  Gehen Sie als nächstes, wenn es keine Reflex gibt.
  3. Tragen Sie kleine Menge Augensalbe, die Trockenheit der Maus der Netzhaut zu verhindern.
  4. Entfernen von Körperbehaarung rund um den Bauchbereich mit Enthaarungscreme (Abbildung 2).
  5. 200 µL Texas Red Dextran-Lösung (Konzentration von 2,5 mg/mL) über das Heck Vene oder Retro-Orbital-Injektion mit einer Insulin-Spritze (Abb. 2D) zu injizieren.
  6. Markieren Sie den rechts subcostal Bereich mit einem Marker. Die Linie sollte vom Xiphoid bis zum Ende der Rippe gezeichnet. Schneiden Sie die Epidermis mit Zange und Schere (Abbildung 2E, F).
  7. Öffnen der Bauchhöhle mit Mikro-Schere und Zange, und setzen die Leber vorsichtig. Der linke seitliche Lappen sollte mit Wattestäbchen (Abbildung 2, H) ausgerollt werden.
  8. Gießen Sie 500 µL steriler PBS auf die Bauchhöhle, Trockenheit der Leber zu verhindern.
  9. Platzieren Sie den Mauszeiger in der rechts-Dekubitus-Position in eine speziell angefertigte Kammer, und wenden Sie eine kleine Menge von Gewebekleber auf dem Silizium-Bett an. Dann befestigen Sie vorsichtig die Leber mit Wattestäbchen (Abbildung 2I).
    Hinweis: Da das Lebergewebe extrem brüchig ist, nicht mechanisch herausziehen der Leberzellkrebs. Rollen sie mit Wattestäbchen sanft aus.
  10. Wenige Sekunden später, nass die Leber wieder mit 500 µL steriler PBS, Austrocknung von der Leber zu vermeiden. Den Metallrahmen auf die Leber und befestigen Sie es fest mit Nüssen (Abbildung 2J).

5. intravitalen Bildgebung der Leber mit zwei-Photonen-Mikroskopie

  1. Führen Sie ZEN Software (Carl Zeiss), schalten Sie den Laser, setzen die Wellenlänge 880 nm, und grün, und rot-Kanäle. Stellen Sie Laserleistung nach Fluoreszenzintensität (Abb. 3A). Emission Filterinformationen lautet wie folgt: grün/Alexa488, 500-550 nm und rot/Alexa 555, 575-610 nm.
  2. Die Kammer auf der bildgebenden Bühne legen Sie und 20 X eintauchen in Wasser Objektiv in der Nähe das Deckglas.
  3. Befestigen Sie die Silikon Kautschuk Heizung unter der Maus Körper, seine Körpertemperatur (Abb. 3 b).
  4. Drop 500 µL destilliertes Wasser auf den Metallrahmen, und ziehen Sie dann das Objektiv in der Nähe der Leber (Abbildung 3).
  5. Stellen Sie den Fokus und bestimmen Sie die Tiefe und die imaging-Bereich zu.
  6. Führen Sie Bildgebung.
  7. Injizieren Sie für die langfristige Bildgebung halbe Dosis von Tiletamin/Zolazepam und Xylazin-Gemisch pro Stunde während der Bildgebung. Aufrechterhaltung der Körpertemperatur der Mäuse bei 37 ° C ist in dieser Phase wichtig. Halten Sie immer auf Auge an der Maus seit Anesthetization Zeit von jeder Maus unterscheidet.
    Hinweis: Diese Methode eignet sich nicht für die Erholung nach der Operation und Bildgebung. Wir opfern ethisch die Maus unmittelbar nach der Operation.
  8. Überprüfen Sie das Pedal Reflexe für alle 30 min für stabile Anesthetization.

(6) Datenanalyse

  1. Öffnen Sie die Daten-Analyse-Software Volocity und dann importieren Sie die Rohdaten in der Bibliothek in die Software.
  2. Entfernen Sie Rauschen aus dem Bild die Situation zu entsprechen und eine Momentaufnahme.
    Hinweis: Um glatte Bilder zu erhalten, verwenden Sie den "Fine" oder "Median" Filter. Darüber hinaus verwenden Sie die "Kontrastverstärkung"-Funktion, um dunkle oder unscharfe Bilder klarer zu machen.
  3. Passen Sie die bearbeiteten Artikel zu 100 % und Export als JPEG oder TIFF-Dateien für Schnappschüsse und AVI-Dateien für Filme.

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Ergebnisse

Eine einfache und sehr stabile bildgebende Kammer wurde entwickelt. Der Boden der Kammer wurde mit Silikon, die verhindert Verrutschen der Maus Körper und Organe abgedeckt. Zusätzlich, da Silizium die richtige Menge an Elastizität aufweist, könnte dies induziert durch den Druck der Abdeckung Folie (Abbildung 1A, C) zu erwartenden Schaden verhindern. Zweite, Gewebe-Safe Kleber (Vet-Anleihe) wurde angewandt, um die extrahierten Leber auf dem kr...

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Diskussion

Die Leber wurde aktiv von vielen Gruppen3,10, aufgrund der Bedeutung ihrer Funktion untersucht. Zum Beispiel schlug Heymann Et Al. eine empfindliche Methode mit Agarose. Obwohl diese Methode erwies sich hochpräzise, dauert die Agarose-Einstellung. Jedoch konnte alle Verfahren mit unserer Methodik innerhalb von 30 min, andere Störfaktoren zu minimieren durchgeführt. Zweitens ist die Stabilisierung der Leberzellkrebs äußerst wichtig, weil der Herzschlag der Video s...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

Diese Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der National Research Foundation von Korea (NRF) gefördert durch die Regierung von Korea (MSIP, Grant Nr. 2016R1A2B4008199 Y-m. (H.), Ministerium für Gesundheit und Wohlfahrt, Republik Korea (gewähren Nummer: HI14C1324).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Kundenspezifische KammerLebendzelleninstrumenteKundenspezifische Größe
MetallabdeckschieberLebendzelleninstrumenteSonderanfertigungen Größe
DeckglasElektronenmikroskopie Sciences#72204-03
Sylgard 184 Silikonelastomer-KitDow Corning
ErlenmeyerkolbenDURAN21 216 36
Zellkulturplatte (flacher Typ)HYUNDAI Micro Co.H31006
ExsikkatorADARSH55204
High Q BOND SE 5 mLBJM LABZur Herstellung eines semi-permanenten Damms
Flexible Silikonkautschuk-HeizelementeOmegaSRFR/SRFG SERIES, M1250/0800
DC NetzteilToyotechDP30-03A
Phosphatgepufferte KochsalzlösungHausgemacht
Lipopolysaccharide (LPS) aus Salmonella enteria Serotyp enteritidisSigma-AldrichL6011
Texas Red DextranThermo Fisher ScientificD1830
15 mL Konisches Röhrchen aus Polypropylen
FALCON14-959-49B
0,45 μ m Filter (Minisart Spritzenfilter)Sartorius16555k
1,5 ml Mikroröhrchen, AmberAxygenMCT-150-XFür lichtblockierende
1 mL SpritzeKorea VaccineKV-S01
3 mL SpritzeKorea VaccineKV-S03
10 mL SpritzeKorea VaccineKV-S10
0,3 mL InsulinspritzeBecton Dickinson324900
Haarentfernungscreme 100 mLBody natur
WattestäbchenABDI
Zoletil 50 5 mLVirbac
Rompun 10 mLBayer
HeizplatteLive Cell InstrumentsPH-S-10DC-Controller in kundenspezifischer Größe
Live Cell InstrumentsCU-301
MikrodessektionsschereHarvard Apparatur72-5418
SchereRobozRS-5882
PinzetteRobozRS-5137
Vet bond3M1469SB
ZEN software (Black Edition)Carl ZeissProgramm für LSM 7 MP
LSM 7 MPCarl Zeiss
VolocityPerkinElmerAnalyseprogramm

Referenzen

  1. Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
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  4. Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).
  5. Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PLoS One. 6 (9), e25109(2011).
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  10. Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), (2015).

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