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Methodenartikel

Paraffin einbetten und dünn schneiden von mikrobiellen Kolonie Biofilmen für die mikroskopische Analyse

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DOI:

10.3791/57196

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23. März 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Columbia University, 2Department of Biology, Barnard College, Columbia University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben, Fixierung, Paraffin einbetten und dünne Stationspunkte Techniken für mikrobielle Kolonie Biofilmen. In vorbereiteten Proben können Biofilm Unterkonstruktion und Reporter Expressionsmuster von Mikroskopie visualisiert werden.

Zusammenfassung

Über Paraffin einbetten-Schnitt ist eine weitgehend etablierte Methode in eukaryontischen Systemen. Hier bieten wir eine Methode zur Fixierung, einbetten und intakte mikrobielle Kolonie Biofilme mit perfundierten Paraffin-Wachs-Schnitt. Um diese Methode für den Einsatz auf Kolonie Biofilme anzupassen, wir entwickelten Techniken für die Pflege jedes Sample auf seine Wachstumssubstrat und mit einer Agar-Overlayer Laminieren und Lysin Fixativ Projektmappe hinzugefügt. Diese Optimierungen verbessern Probe Aufbewahrung und Erhaltung der mikromorphologischer Funktionen. Proben, die auf diese Weise zubereitet sind dünn schneiden und Bildgebung durch Licht, Fluoreszenz, und Transmissionselektronenmikroskopie zugänglich. Wir haben diese Technik auf Kolonie Biofilmen von Pseudomonas Aeruginosa, Pseudomonas Synxantha, Bacillus Subtilisund Vibrio Choleraeangewandt. Das hohe Niveau der Details sichtbar in Proben von dieser Methode generiert kombiniert mit Reporter Stamm Engineering oder die Verwendung von bestimmten Farbstoffen, bieten spannende Einblicke in die Physiologie und Entwicklung mikrobieller Gemeinschaften.

Einleitung

Die meisten Mikroben haben die Fähigkeit, Form Biofilme, zusammengehalten Gemeinschaften von Zellen durch selbst erstellte Matrizen. Biofilme können in vielen Arten von physischen Setups mit verschiedenen Regimen Nährstoff- und Substrat Bestimmung angebaut werden. Spezifischen Assays für die Biofilmbildung tendenziell reproduzierbare vielzellige Strukturen ergeben, und gemeinsame Architekturen für phylogenetisch Artenvielfalt auf der makroskopischen Ebene oder Gemeinschaft eingehalten werden. Wenn Mikroben als Kolonien auf festem Medium unter Atmosphäre gewachsen sind, makroskopische Morphologie vermittelt Informationen über die Kapazität für die Produktion von Matrix und oft korreliert mit anderen Eigenschaften 1,2,3. Die interne Architektur der mikrobiellen Kolonien liefern auch Hinweise auf Biofilm-spezifische Chemie und Physiologie, aber schwer zu charakterisieren. Aktuelle Anwendungen von Cryoembedding und Kryoschneiden Techniken zu Bakterienkolonien ermöglichten Bildgebung und Visualisierung von Besonderheiten in noch nie da gewesenen Auflösung 4,5,6. Studien mit tierischem Gewebe haben jedoch gezeigt, dass Paraffin einbetten bietet hervorragende Erhaltung der Morphologie im Vergleich zu Cryoembedding 7 und verwendet wurde, um Bakterien im Gewebe 8,9zu visualisieren. Deshalb haben wir ein Protokoll zur Fixierung, Paraffin einbetten und dünn schneiden von mikrobiellen Kolonie Biofilmen entwickelt. Hier beschreiben wir die Vorbereitung von Pseudomonas Aeruginosa PA14 Kolonie-Biofilm Dünnschliffe 10,11, aber wir haben diese Technik Biofilme bilden die Bakterien auch erfolgreich angewendet Pseudomonas Synxantha, Bacillus Subtilis, und Vibrio Cholerae12.

Der Prozess von Paraffin einbetten und dünn schneiden Biofilmen folgt einer einfachen Logik. Erstens sind die Biofilme in einer Schicht von Agar, Morphologie während der Verarbeitung zu bewahren umhüllt. Zweitens die eingehüllte Biofilme sind eingetaucht in ein Fixiermittel, Crosslink Makromoleküle und Mikromorphologie bewahren. Diese sind dann mit Alkohol dehydriert, mit einem nicht-polaren Lösungsmittel gelöscht und dann mit flüssigem Paraffin Wachs infiltriert. Sobald infiltriert, sind die Proben eingebettet in Wachs Blöcke für schneiden. Abschnitte sind geschnitten, montiert auf Folien und dann rehydriert um mehr nativen Zustand zurücksenden. Ab diesem Zeitpunkt können sie gebeizt oder in Eindeckmedium für die mikroskopische Analyse abgedeckt.

Dieses Protokoll produziert Dünnschliffe von mikrobiellen Biofilmen für histologische Analyse geeignet. Kolonie Biofilm Unterkonstruktionen sind sichtbar, wenn Dünnschliffe vorbereitet, mit dieser Methode durch Lichtmikroskopie abgebildet werden. Biofilme können auch auf Medien mit fluoreszierenden Flecken angebaut werden spezifisch für einzelne Features oder gebeizt Rehydratation Schritt unmittelbar vor der Montage (Schritte 9.5 9.6). Zu guter Letzt können Mikroben entwickelt werden, um fluoreszierende Proteine in einer konstitutiven oder regulierten Mode ermöglicht Berichten in Situ Zelle Verteilung oder Gen-Ausdrucks innerhalb dieser Gemeinschaften zu produzieren. Wir haben diese Methoden verwendet, um Kolonie Biofilm Tiefe, Zelle Verteilung Matrix Verteilung, Wachstumsmuster und raumzeitlichen Genexpression zu bestimmen.

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Protokoll

1. Wachstum von Pseudomonas Aeruginosa Biofilms Kolonie

  1. Vorbereitung der Medium-Bilayer Platten
    1. Bereiten Sie eine Tryptone von 10 g/L, 10 g/L Agar (siehe Tabelle der Materialien) Lösung in entionisiertem Wasser.
    2. Autoklaven für 20 min. Abkühlen auf 50-60 ° C in einem Wasserbad.
    3. 45 mL der Agar-Tryptone-Lösung in ein 100 x 100 mm quadratische Schale gießen (siehe Tabelle der Materialien) mit einem 50 mL konische Rohr. Ermöglichen das Agar zu festigen (~ 20-30 min). Gießen Sie eine zweite, 15 mL Schicht auf die erste Schicht. Über Nacht erstarren lassen, Deckel entfernen Kondenswasser aus ggf. durch mit einem fusselfreien Tuch abwischen.
  2. Spotting Kolonie Biofilme
    1. Streifen Sie die Stämme von Interesse aus den Beständen der Gefrierschrank auf LB-Agar-Platten-13 und inkubieren Sie im Dunkeln für 12-16 h bei 37 ° C und 80-100 % Relative Luftfeuchtigkeit.
    2. Können Sie für jede Sorte oder replizieren eine einzelne Kolonie impfen 2 mL LB und im Dunkeln für 12-16 h bei 37 ° C mit Schütteln bei 250 u/min inkubieren.
    3. Sub-Kultur durch eine Verdünnung von 1: 100 in frisches LB und im Dunkeln für 2,5-3 h bei 37 ° C mit Schütteln bei 250 u/min Inkubation.
    4. Optische Dichte mit einem Spektralphotometer messen und justieren Sie mit sterilen LB eine Zellsuspension mit einer OD zu erreichen500 nm von ~ 0,5.
    5. Abhängig von der gewünschten Kolonie Größe, Pipettieren 2,5-10 µL Zellsuspension auf einem Medium-Bilayer Teller (vorbereitet in Schritt 1.1) und erlauben Ort trocknen für ~ 20 min. verlassen die Petri-Deckel einen Spalt offen, in der Nähe einer offenen Flamme trocknen erleichtern können.
    6. Inkubieren Sie vor Ort Kolonien bei 25 ° C und 80-100 % Relative Luftfeuchtigkeit, im Dunkeln für bis zu 4 Tage.

2. Zubereitung der Fixativ

  1. Bereiten Sie die Fixativ Lösung am Tag der Ernte Probe. Verdünnen Sie 37 % Formaldehyd (FA) mit 1 X PBS-Puffer auf eine Endkonzentration von 4 % FA.
    Achtung: FA ist flüchtig und giftig. Schutzausrüstung tragen und arbeiten in einem gut gelüfteten Abzug.
  2. Unmittelbar vor der Anwendung, L-Lysin-Hydrochlorid in 4 % auflösen FA (vorbereitet in Schritt 2.1) bei Raumtemperatur, eine Endkonzentration von 50 mM L-Lysin HCl.

3. direkte Anwendung Fixativ auf der Kolonie Biofilm [Optional]

Hinweis: Wir haben festgestellt, dass Biofilm Morphologie ist am besten erhalten, wenn das Agar-Overlay vor Fixierung hinzugefügt wird. Allerdings ist dieser Schritt auch eine Änderung der Umweltbedingungen, die Genexpression beeinflussen könnten. Fluoreszierende Reporter Expressionsmuster sollte daher überprüft werden, mit einem besonderen Protokoll, in dem die Fixierung Schritt vor der Zugabe der Overlay-Agar, durchgeführt wird, wie hier beschrieben.

  1. Am Tag der Aufzeichnung, und arbeiten in einem gut gelüfteten Abzug pipette das Fixiermittel vorbereitet in Schritt 2 direkt auf die Agar-Oberfläche um die Kolonie Rand, so dass es zu der Kolonie Peripherie zu erreichen, ohne eintauchen. Gelten Sie nur wie viel Fixiermittel wie voll ist erforderlich, um die Kolonie umgeben, ca. 500 µL. ermöglichen das Fixiermittel in der Kolonie und den umliegenden Agar verbreiten.
  2. Sobald das Fixiermittel vollständig absorbiert in die Kolonie und umgebenden Medien, ca. 20-30 min wurde, und passives FA nicht mehr sichtbar auf dem Teller ist, wiederholen Sie Schritt 3.1. Lassen Sie das Fixiermittel in der Kolonie und den umliegenden Agar verbreiten.
  3. Sobald das Fixiermittel vollständig absorbiert in die Kolonie wurde und umgebende Medien wiederholen Sie Schritt 3.1, diesmal direkt die Oberfläche der Kolonie Fixiermittel zuweisen. Diese Fixiermittel in der Kolonie und den umliegenden Agar verbreiten lassen, weiter zu Schritt 4 nur nachdem alle Fixativ wurde aufgenommen und ist nicht mehr sichtbar auf dem Teller.

4. überstehende Kolonien mit Agar

  1. Am Tag der Fixierung bereiten Sie ein 10 g/L Agar Lösung in entionisiertem Wasser und Autoklaven für 10-20 Minuten zu lösen. In einem Wasserbad auf 50 ° c abkühlen.
  2. Übergießen Sie 15 mL der Lösung Agar sanft das Wachstumsmedium und Kolonie. Ermöglichen der Agar, ein Gel bei Raumtemperatur für 5 min (Abbildung 1 b) zu bilden.
  3. Verwenden Sie eine scharfe Rasierklinge, schneiden Sie ein Quadrat, 3-lagig Futter mit der Kolonie zwischen den oberen beiden Schichten laminiert. Wenn mehrere Proben vorbereiten, sicherzustellen Sie, dass jedes Futter auf eine vergleichbare Größe geschnitten wird.
  4. Entfernen Sie vorsichtig die überschüssige Agar aus der Kolonie-haltigen Futter.
  5. Um die beiden oberen Schichten des Nährbodens (mit der Kolonie) Weg von der Unterschicht des Futters (Abbildung 1) zu heben, den flachen Kopf einer Spachtel in 1 x PBS oder Wasser nass und sanft zwischen den oberen und unteren Schichten einfügen. Die laminierte Kolonie sollte die Unterschicht trennen. Achten Sie darauf, nicht zu verfälschen oder die laminierte Kolonie zu biegen, wenn es von seinem Sockel heben.

5. Fixierung

  1. Arbeiten in einem gut gelüfteten Abzug sofort die laminierte Kolonie (d. h. 2-lagige Chuck) in einer Einbettung Kassette übertragen (siehe Tabelle der Materialien), gekennzeichnet mit einem chemikalienbeständigen Markierstift. Legen Sie die einbettende Kassette in ein Glas-Folie-Mailer (siehe Tabelle der Materialien), enthält das Fixiermittel in Schritte 2.1-2.2 vorbereitet. Stellen Sie sicher, es gibt keine Luftblasen in der einbettenden Kassette gefangen.
  2. Inkubieren Sie die Probe im Fixiermittel über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur.

6. Probenverarbeitung: Puffer waschen, Austrocknung, Clearing und Infiltration

  1. Waschen Sie nach der Übernachtung Fixierung die Probe zweimal mit 1 X PBS-Puffer für 1 h. Die besten Ergebnisse zu automatisieren Reagenz Homogenisierung mit dem Spin Funktion eines automatischen Gewebe-Prozessors (siehe Tabelle der Materialien) auf einer niedrigen Einstellung eingestellt. Wenn kein Prozessor verfügbar ist, kann die Verarbeitung manuell ausgeführt werden.
  2. Folgen Sie das Puffer waschen durch Wasserentzug durch eine abgestufte Reihe von Ethanol (EtOH) Verdünnungen mit 1 X PBS-Puffer (25 %, 50 %, 70 %, 95 %) für 1 h bei Raumtemperatur.
  3. Entwässern in drei wäscht von 100 % EtOH für 1 h bei Raumtemperatur.
  4. Deutlich dehydrierte Probe in drei wäscht von 100 % orange Öl basierenden Clearing Agent (siehe Tabelle der Materialien) für 1 h bei Raumtemperatur.
  5. Infiltrieren die geräumte Stichprobe zweimal mit geschmolzenem Paraffin Wachs (siehe Tabelle der Materialien), beheizt bis 55˚C, 2 h.

7. Probe einbetten

  1. Füllen Sie ein Wachs Schimmel mit flüssigem Paraffin Wachs auf 55 ° c erhitzt. Mit einem Spatel beheizten, flache schnell übertragen das eingedrungene Futter aus der Einbettung Kassette in die Wachs-Form, um sicherzustellen, dass das Futter Parallel zur Grundfläche des Schimmels liegt. Vermeiden Sie übermäßigen Druck auf das Spannfutter. Wachs Formen können benutzerdefinierte 3-d gedruckt werden oder sind im Handel erhältlich (siehe Tabelle der Materialien).
  2. Lassen Sie Wachs, über Nacht bei 4 ° c erstarren. Proben in feste Wachs geformt können auf unbestimmte Zeit bei 4 ° c gelagert werden.
  3. Sobald das Wachs erstarrt ist, Verbrauchsteuern Sie die Probe aus der Form und schneiden Sie überschüssiges Wachs aus um die Probe mit einer Rasierklinge. Überschüssiges Wachs erstreckt sich von einem Ende der Probe, parallel zur Ebene der Schnitt, die verwendet werden, um es in das Mikrotom Klemme zu verlassen (siehe Tabelle der Materialien). Auch eine Hülle aus Wachs, ca. 1 mm dick, um die Probe verlassen und seine Flächen zu glätten.

8. Schneiden

  1. Erhitzen Sie ein Wasserbad auf 42 ° c. Klemmen Sie die Probe in das Mikrotom mit der Oberfläche der Kolonie senkrecht orientiert sich an den Rand des Blattes (siehe Tabelle der Materialien).
  2. Schneiden Sie die Probe in Intervallen von 50 µm, bis die gewünschte Ebene der Kolonie erreicht worden ist, aus denen Abschnitte erfasst werden.
  3. Schneiden Sie eine Band von die gewünschte Anzahl von 10 µm dicke Abschnitte mit einem Mikrotom legen Sie auf einer speziellen Geschwindigkeit von 75-80 u/min und einen Freiwinkel von 6-10˚. Verwenden Sie einen feinen Spitzen Pinsel, um das Band von der Klinge zu lösen.
  4. Übertragen Sie das Band mit einem Tropfen Wasser an der Spitze einer Pasteurpipette (bevorzugt) oder Zange, sanft auf das Wasserbad werden. Achten Sie darauf, um Trapping Luftblasen unter dem Abschnitt zu vermeiden.
  5. Sofort fügen Sie eine Folie in das Wasserbad und positionieren Sie es unterhalb des Menübands in einem Winkel von 45°.
  6. Tippen Sie auf den schmalen Rand der Multifunktionsleiste auf die Folie, knapp unterhalb der mattierten Label. Das Band sollte halten.
  7. Ziehen Sie die Folie aus dem Wasserbad, Einstellung des Winkels, senkrecht zur Oberfläche des Wassers zu werden, und ermöglicht das Band flach gegen die Folie entlang seiner Länge liegen. Zu vermeiden, überfüllen überschüssiges Wasser unterhalb der Multifunktionsleiste.
  8. Stehen Sie vorsichtig die Folie auf eine saugfähige fusselfreien Tuch, wicking überschüssiges Wasser aus dem Abschnitt.
  9. Legen Sie die Folie auf einem Papiertuch und bei Raumtemperatur über Nacht im Dunkeln trocknen lassen. Folien können auf unbestimmte Zeit bei 4 ° c im Dunkeln aufbewahrt werden.

9. Hitze-Befestigung, Rehydratation und Montage

  1. Erhitzen Sie eine flache Heizplatte auf 45 ° c. Erhitzen Sie die Folie für 30-60 min. Das Wachs wird halb geschmolzen werden und gegen die Folie glätten.
  2. Heben Sie die Folie von der heißen Platte und legen Sie ihn flach auf eine glatte, flache, Raumtemperatur-Oberfläche mit darauf achten, dass das geschmolzene Wachs ziehen nicht auf beiden Seiten der Folie, bis das Wachs erstarrt (~ 1 min).
  3. De-Wachs mit einem Glas-Folie-Mailer, Folien in vier Waschungen von clearing Agent für jeweils 5 min über eine Absauganlage Büchner Lösung zwischen den Waschgängen entfernen.
  4. Waschen Sie die Folien dreimal in 100 % EtOH für 1 min.
  5. Aktivieren Sie die Folien in einer abgestuften Reihe von Ethanol in der umgekehrten Reihenfolge der Bearbeitung (95 %, 70 %, 50 % und 25 %) für 1 min, jeweils gefolgt von zwei 1-min-Waschungen mit 1 X PBS-Puffer.
  6. Sofort die Abschnitte in ein Tris gepufferte Eindeckmedium montieren (siehe Tabelle der Materialien) und wenden Sie ein Deckglas, die Einführung von Luftblasen zu vermeiden. Eindeckmedium über Nacht bei Raumtemperatur polymerisieren zu ermöglichen.
  7. Sobald polymerisiert, versiegeln Sie das Deckglas auf der Folie mit klaren Nagellack. Versiegelte Folien können auf unbestimmte Zeit im Dunkeln bei 4 ° c gespeichert werden.

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Ergebnisse

Diese Methode generiert Biofilm dünn-Abschnitte wobei morphologische Merkmale und Zonen der Genexpression durch DIC, Fluoreszenz-Mikroskopie und TEM abgebildet werden können. Während DIC Bildgebung mit einem 40 X Öl Immersion Ziel darzutun, einige morphologische Merkmale (Abb. 2E) sein kann, wir haben festgestellt, dass Fluoreszenz Mikroskopie Stämme entwickelt, um konstitutiv express fluoreszierendes Protein liefert verbesserte Visualisierung der Zelle Verte...

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Diskussion

Einbetten von Paraffin und dünn schneiden Gewebeproben ist eine klassische histologische Technik, die ermöglicht die Abbildung von Mikro-morphologische Strukturen und wird häufig auf eukaryotischen Geweben verwendet und mit einigem Erfolg auf mikrobielle Proben8 angewendet wurde ,9. Während Cryoembedding für die starke Bindung des endogenen und immunofluorescent Signals ermöglicht, ist Paraffin einbetten generell vorzuziehen, da sie besseren Schutz der Morpholog...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von NSF-Karriere-AWARD-1553023 und NIH/NIAID Award R01AI103369 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
5 3/4" Pasteur-PipetteFisher Scientific13-678-6AGekauft in verschiedenen Biogeschäften 
Agar Teknova A7777
Buchner Aspirator (Vakuum) Flasche Pyrex5340Gekauft in univeristy biostores 
Chemisch beständiger MarkierungsstiftVWR103051-182Hersteller: Leica
Clear FingernagellackIm Laden gekauft
Congo Red Indicator GradeVWRAAAB24310-14Hersteller: Alfa Aesar
Coomassie Blue VWREM-3340Hersteller: EMD Millipore
TRIS-gepuffertes Eindeckmedium (mit DAPI)Fisher Scientific50 247 04Hersteller: Electron Microscopy Sciences
Embedding Mold 3D-gedruckte hauseigene
Einbettungsform (kommerziell) Elektronenmikroskopie Wissenschaften70182
Ethanol 200PDecon Labs, Inc. 2701Gekauft in univeristy biostores 
feiner Spitzeim Laden gekauft, Pinsel
Glas Deckgläser 60x22mmFisher Scientific12-519-21C
Glas Rehydration Mailer Ted Pella2104320 Folien-Mailer 
Histoclear-II, Clearingmittel auf Orangenölbasis Fisher Scientific50 899 90150Hersteller: National Diagnostics
Histosette, Einbettung CasetteFisher Scientific15 182 701A
L-Lysinhydrochlorid Fisher ScientificBP386 100
Mikrotomklingen mit niedrigem ProfilFisher Scientific22 210 048Hersteller: Sturkey 
Mikropipette VWR89080-004Promo-Pack
Mikropipetten-Spitzen Siehe KommentarbereichSiehe Kommentarbereich Siehe KommentarbereichS. 10 (Fisher Scientific, 02 707 469), S. 200 (VWR, 89079-474), S. 1250 (VWR, 89079-486)
Mikrotom Fisher Scientific905200U/00016050Modell: HM355S, Hersteller: Microm, NON-CATALOG, Herstellerkatalog # 905200U/00016050
Formaldehyd, 37% wässrig (Formalin)Ricca ChemicalRSOF0010-500A
Paraplast Xtra (Paraffinwachs)VWR15159-486Hersteller: McCormick Scientific
Petrischalen Quadrat 100x100x15mmLabor Einwegprodukte D210-16
Kaliumchlorid EMD Chemikalien PX1405-1Bestandteil von phosphatgepufferter Kochsalzlösung, hergestellt im eigenen Haus 
Kaliumphosphat Fisher ScientificP380-500Komponente aus phosphatgepufferter Kochsalzlösung, selbst hergestellt
Rasierklingen VWR55411-050Gekauft in univeristy Biostores 
Rutschenwärmer Fisher ScientificNC0865259NON-CATALOG, Lieferantenkatalog # 12857D
Natriumchlorid VWR0241-1KGBestandteil von phosphatgepufferter Kochsalzlösung, hergestellt im eigenen Haus 
Natriumphosphat VWRBDH9296.500, Bestandteil von phosphatgepufferter Kochsalzlösung, selbst hergestellt 
Suprafrost Histologie Folien Fisher Scientific12-544-2
Gewebe-Flotations-Wasserbad Fisher ScientificNC0815797Hersteller: Ted Pella, Lieferantenkatalog # 28156-B
Automatischer Tissue-Prozessor Fisher Scientific813160U/Q#00009061Modell: STP120 Gewebeprozessor
TryptonTeknova T9012
Hefe-ExtraktTeknova Nr. Y9010
Pinsel mit

Referenzen

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