Quantifizierung der standortspezifischen Protein Lysin Acetylierung und Succinylation Stöchiometrie mittels Massenspektrometrie Daten-unabhängige Übernahme

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir objektive Quantifizierung der standortspezifischen Protein Acetylierung und/oder Succinylation Belegung (Stöchiometrie) eine gesamte Proteoms durch eine ratiometrischen Analyse der endogenen Modifikationen, Änderungen, die nach quantitativen chemische Acylation mit stabilen Isotopen-Label Anhydride. In Kombination mit sensiblen Daten-unabhängige Übernahme Massenspektrometrie erhalten Sie genaue Website Belegung Messungen.

Zusammenfassung

Post-translationale Modifikation (PTM) von Lysin Proteinreste durch N_Ɛ- Acylation führt zu strukturelle Veränderungen, die dynamisch Proteinfunktionen, z. B. durch enzymatische Aktivität ändern oder durch Vermittlung von Interaktionen regulieren können. Genaue Quantifizierung der standortspezifischen Protein Acylation Belegung oder Stöchiometrie, ist wesentlich für das Verständnis der funktionellen Konsequenzen der globalen Low-Level-Stöchiometrie und einzelne hochrangige Acylation Stöchiometrie von spezifischen Lysin Rückstände. Andere Gruppen haben durch den Vergleich des Verhältnis von Peptid Vorläufer Isotope von endogenen, natürlichen Fülle Acylation Messung von Lysin Acetylierung Stöchiometrie berichtet und exogene, schweren Isotopen-Label Acylation führte ihn nach quantitativen chemischen Acetylierung von Proteinen mit stabilen Isotopen-Label Essigsäureanhydrid. Dieses Protokoll beschreibt einen optimierten Ansatz mit einigen Verbesserungen, einschließlich: (1) erhöhte chemische Acylation Effizienz, (2) die Fähigkeit, Protein Succinylation neben Acetylierung zu messen, und (3) verbesserte quantitative Genauigkeit reduzierten Interferenzen mit Fragment Ion Quantifizierung von Daten-unabhängige Akquisitionen (DIA) statt Vorläufer Ionen-Signal vom datenabhängiges Erwerb (DDA). Die Verwendung von extrahierten Peakflächen von Fragment-Ionen für die Quantifizierung ermöglicht auch einzigartig Differenzierung der Standortebene Acylation Stöchiometrie von proteolytischen Peptide enthält mehrere Lysin Rückstände, die nicht mit Vorläufer Ionen möglich Signale für die Quantifizierung. Datenvisualisierung im Skyline, ein open-Source-quantitative Proteomik-Umfeld ermöglicht bequem Daten Inspektion und Überprüfung. Gemeinsam bietet dieses Workflows unvoreingenommene, präzise und genaue Quantifizierung der standortspezifischen Lysin Acetylierung und Succinylation Belegung der eine gesamte Proteom, die offenbaren und biologisch relevante Acylation Websites zu priorisieren.

Einleitung

N_Ɛ- Acylation von Lysin Proteinreste ist ein wichtiger Regulator der Proteinfunktion. Lysin Acetylierung und andere Acylations, wie Succinylation, Malonylation und Glutarylation, werden gedacht, um Stoffwechsel, Zelle und andere zelluläre Prozesse^{1,2,3,4 zu regulieren} , und wirken sich in Stoffwechselstörungen⁵. Zahlreiche Studien haben ergeben, dass Lysin Acyl Änderungen große Falte-unter verschiedenen Bedingungen in den Säugetier-Geweben Veränderungen und Zell-Linien^5,6,7,8 , sowie Bakterien^9,10,11, bieten jedoch diese relative Falte Änderungen keine Einblicke in den Anteil des gesamten Proteins geändert. Studien berichten Messungen der Acylation Website Belegung sind knapp^12,13,14, trotz der Relevanz und müssen für solche Untersuchungen, da sie mehr Details als relative Falte bieten ändern. Beispielsweise könnte eine 10-divisibel Änderung eine Erhöhung der Website Belegung von 0,01 bis 0,1 %, 1 bis 10 % oder sogar 10 bis 100 % dar. Genaue Stöchiometrie Messungen sind erforderlich, um biologische Bedeutung Acylation interpretieren und Auswirkungen bezüglich der Größe des Proteins strukturelle, vorherzusagen und gegebenenfalls funktionelle Veränderungen.

Eine vorherige Methode zur Website Belegung quantifizieren nutzt schweren stabilen Isotop chemische Kennzeichnung von unveränderten Lysin Rückstände gefolgt von Massenspektrometrie, das Verhältnis zwischen endogenen "Licht" Acetylierung im Vergleich zu den exogenen zu messen, chemisch-mit der Bezeichnung "schwere" Acetyl-Lysin mit Vorläufer Ionen-Intensitäten¹². Eine weitere aktuelle Studie von Zhou Et Al. ¹³ beschrieben einen ähnlichen Ansatz um Lysin Acetylierung Stöchiometrie zu bewerten, die auch eine komplette chemische Acetylierung alle unveränderten Lysin-Reste in Proteinen mit stabilen Isotopen Kennzeichnung eingesetzt, aber verwendet Fragment Ion Intensitäten gemessen DDA. Nakayasu Et Al. ¹⁴ verwendet einen ähnlichen Ansatz der DDA, aber stattdessen verwendet das Verhältnis von leichten und schweren Acetyl-Lysin Immonium Ionen zur Quantifizierung. Quantifizierung, basierend auf Fragment-Ionen, Immonium oder Sequenz Ionen (MS2), in den meisten Fällen führt zu weniger Signal Störungen im Vergleich zur Verarbeitung intakt Peptid Vorläufer Ionen (MS1). Jedoch kann Quantifizierung der Fragment-Ionen aus DDA generiert MS/MS Spektren stochastische Probenahme Mängel leiden wo die hohe Fülle Vorläufer Ionen sind eher für MS/MS ausgewählt werden und so zu führen, um eine einseitige und unvollständige Auswahl von Vorläufer-Ionen.

Dieses neuartige Workflow⁴ (Abbildung 1) nutzt konzeptionell ein stabiles Isotop chemische Kennzeichnung Ansatz ursprünglich von Baeza Et Al. ¹², jedoch ist der Workflow anschließend gepaart mit DIA beiden Vorläufer zu sammeln und mehrere Fragment Ion Häufigkeiten über die nachweisbaren Masse reichen^15,16 bietet genaue Stöchiometrie Berechnungen.

Peakflächen von fragment Ionen, die die Acylation Website des Interesses enthalten, oder "Unterscheidung zwischen Fragment-Ionen", zu quantifizieren, Acylation Website Belegung (Abbildung 2) verwendet werden. Fragment-Ionen, die die Änderung nicht enthalten haben identische leichte und schwere m/Z-Werte und dienen zur Identifizierung von Peptid aber nicht zur Quantifizierung. Skyline von Software¹⁷ dient zum Vorläufer und Fragment Peakflächen zu extrahieren. Das Vorhandensein von mehreren Fragment-Ionen mit einer bestimmten Acylation Website bietet Flexibilität, wenn Störungen in einigen der Fragment-Ionen erkannt werden. Datenvisualisierung im Skyline erlaubt kritische Prüfung von leicht bis schwer Fragment Ionen-Verhältnisse. Neben der manuellen Datenanalyse war ein Open-Source-R-Paket geschrieben, StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR), entwickelt, die verwendet der Vorläufer Ionen und Fragment Ion erhobenen Daten durch DIA und quantifiziert, standortspezifische Acylation Stöchiometrie von Peptiden, die mehrere Lysin Rückstände enthalten, ein Feature mit Vorläufer Ionen nur Intensität Messungen⁴nicht möglich.

Dieses Protokoll zeigt auch den Einsatz von Endoproteinase Glu-C, das ist spezifisch für die C-terminale Spaltung an Glutaminsäure und Asparaginsäure Rückstände, anstelle von Trypsin oder Arg-C Protease, da letztere oft sehr groß erzeugen und potenziell multiplizieren Acylated proteolytischen Peptide aus blockiert Trypsin Spaltung bei Acylated Lysin Rückstände. Die chemische Kennzeichnung Verfahren wurde auch Verwendung von Bernsteinsäure Anhydrid (Abbildung 1), wodurch die Quantifizierung von Succinylation Stöchiometrie Succinylation ausgedehnt. Zusätzlich zu den Verbesserungen, die Probenvorbereitung, die Umsetzung des Peptids Fraktionierung von offline, Basis pH, sank umgekehrt-Phase (bRP) Trennung von Peptiden weitere Quantifizierung Störungen, so dass besser ent-Faltung der Acylation Stöchiometrie in ganze Proteom Proben. Zusammen, diese Methode bietet und hebt mehrere Vorteile: (1) Steigerung der Effizienz der chemischen Acylation; (2) Messung von Protein Succinylation Stöchiometrie neben Acetylierung; und (3) verbesserte Quantifizierung Genauigkeit. Die verbesserte Quantifizierung ist aufgrund der verringerten Eingriffe in Fragment Ionen-Signale von DIA im Vergleich zu DDA Vorläufer Signal sowie die Durchführung von Offline-Peptid Pre Fraktionierung von bRP.

Protokoll

(1) quantitativ Acetylate und/oder Succinylate Proteine mit Isotopen-Label Essigsäure oder Bernsteinsäure Anhydrid

1. Bereiten Sie 3 Wiederholungen von 100 µg Rinderserumalbumin (BSA) Protein Probe parallel in einer Konzentration von 1 µg/µL (insgesamt 100 µL), mit Harnstoff und Triethylammoniumhydrochlorid Bikarbonat (TEAB) Lösung (8 M Harnstoff, 200 mM TEAB, pH 8).
   Hinweis: Es ist wichtig, Amin-freie Puffer zu verwenden. Die Proteinproben benutzt hier im Abschnitt repräsentative Ergebnisse sind BSA, quantitativ BSA, Succinylated und Mischungen davon nachgeben BSA mit Proben definiert Succinylation Belegung bei 0 %, 1 %, 10 %, 50 % und 100 %, bzw. (jede Probe wird vorbereitet in 3 Wiederholungen). Dieses Protokoll hat auch mit Protein Lysates aus Escherichia coli durchgeführt worden und Leber⁴Maus. Das Protokoll kann auch auf andere Zellen oder Geweben Lysates angewendet werden.
2. Reduzieren Sie 100 µL Probe der BSA (100 µg) mit 8 µL 250 mM Dithiothreitol (DTT), eine Endkonzentration von 20 mM DTT zu erreichen und die Probe bei 37 ° C für 30 Minuten unter Rühren bei 1.400 u/min inkubieren.
3. Alkylat reduzierte BSA-Probe mit 21,6 µL 200 mM Iodoacetamide, eine Endkonzentration von 40 mM Iodoacetamide zu erreichen und die Probe im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 min inkubieren.
   Hinweis: Es ist wichtig, um die Iodoacetamide-Konzentration leicht zu haben mehr als 2 X DVB-t-Konzentration um sicherzustellen, dass alle Protein Thiole reduziert alkyliert werden.
4. Gehen Sie bei der Erstellung von essigsaurem Anhydrid -d₆ (Schritt 1.4.1) oder Bernsteinsäure Anhydrid -d₄ (Schritt 1.4.2) für chemische (quantitativ) Acetylierung oder Succinylation der Proben notwendig.
   1. Bestimmen Sie das Molarity (M) von 1 g aliquoten wässrigen essigsaurem Anhydrid -d₆ -Lösung aus dem Molekulargewicht (108.13 g/Mol) und Dichte (1,143 g/mL bei 25 ° C).
      Hinweis: Die 1 g-Paket enthält 9.248 µmol von essigsaurem Anhydrid -d₆ 875 µL Volumen, nachgiebig 10,57 M Lösung für pro Acetylierung der Proben verwendet.
   2. Bereiten Sie eine 5 M Lösung von Bernsteinsäure Anhydrid -d₄ durch Auflösen des Pulvers in wasserfreiem DMSO unmittelbar vor der Reaktion, Hydrolyse des Reagens zu vermeiden. Lösen Sie 0,24 g Bernsteinsäure Anhydrid -d₄ in 461 µL von wasserfreiem DMSO, eine 5 M-Lösung zu erhalten.
5. Führen Sie quantitative chemische Acetylierung oder Succinylation durch Zugabe von jeweils 60 µmol von essigsaurem Anhydrid -d₆ (6 µL der Lösung 10,57 M) oder Bernsteinsäure Anhydrid -d₄ (12 µL der Lösung 5 M) und inkubieren Sie die Probe bei 4 ° C für 20 min auf einem Vortex-Mixer.
   Hinweis: Aufgrund der Säuregehalt des Anhydride, können Proteine ausgefällt. Nehmen Sie zur Kenntnis und stellen Sie wie unter Punkt 1.6 beschrieben.
6. Fügen Sie 10 µL von 7,25 M NaOH nach der Inkubation, erhöhen den pH-Wert auf ca. 8 O-Acylation Nebenprodukte zu beseitigen. Vortex kurz und überprüfen Sie den pH-Wert der Probe von spotting 1 µL auf pH-Papier.
   Hinweis: Es möglicherweise erforderlich, fügen Sie mehr als 10 µL von 7,25 M NaOH auf pH 8 zu erreichen. Darüber hinaus sollten sich potenziell ausgefällten Proteine wieder auflösen.
7. Wiederholen Sie die Bedienschritte pro Acylation und pH 1,5 und 1,6 für insgesamt drei Mal. Überprüfen Sie die pH-Werte und beachten Sie das Volumen der Basislösung pro Wiederholung hinzugefügt. Arbeit schnell während der oben genannten chemischen Acylation Schritte, weil die Anhydride werden Hydrolyseneigung und Reaktivität zu verlieren.
8. Fügen Sie nach der endgültigen Kennzeichnung Reaktion und pH-Wert Einstellung 10 µL Hydroxylamin-Lösung 50 % O-Acylation Nebenreaktionen zurückkehren hinzu.

2. Digest reagierte Proteinproben mit Glu-C Endoproteinase

1. Verdünnen Sie die Harnstoff-Konzentration bis zu 0,8 M mit 50 mM TEAB, pH 8 und normalisieren Sie die Probenvolumina.
2. Die Proteinproben durch Zugabe von Endoproteinase Glu-C bei einem 01:50 verdauen Protease Substrat-Protein-Verhältnis (w/w) und die Proben über Nacht bei 37 ° C mit Agitation bei 1.400 u/min inkubieren.
3. Ansäuern Sie und stillen Sie die Proteinproben Verdauung durch Zugabe von Ameisensäure auf 1 % nach Volumen.
4. Entsalzen Sie die Proben mit hydrophilen lipophilen Gleichgewicht Festphasen-Extraktion Patronen. Verwenden Sie eine 30 mg Sorbens Patrone pro Probe, maximal 5 mg Material pro Patrone^4,18.
   Hinweis: Es ist wichtig, das Sorbens innerhalb der Patrone Entsalzung dabei nass zu halten. Wenn nötig, schalten Sie die Vakuumpumpe, um den Durchgang von Lösungsmittel oder Probe durch die Patrone zu verlangsamen.
   1. Legen Sie die Patronen in den Anschlüssen auf der 24-Port Glas Block Vakuum Krümmer und schalten Sie die Vakuumpumpe. Lassen Sie nicht verwendete Ports begrenzt. Lassen Sie einen oder zwei Anschlüsse UN-angeschnittene Ärmel, niedrigeren Druck auf das Vakuummeter ggf. beizubehalten.
   2. Nass jede Patrone zweimal mit 800 µL 80 % Acetonitril (ACN)/0.2% Ameisensäure acid/19.8% Wasser. Sicherzustellen Sie, dass Lösungsmittel Stufe 2 – 3 mm höher als sorbent bleibt. Sicherstellen Sie, dass die Vakuum-Messgerät auf dem Verteiler 16,9 – 67,7 kPa (5 – 20 Hg) liest.
   3. Equilibrate jede Patrone dreimal mit 800 µL 0,2 % Ameisensäure im Wasser. Sicherstellen Sie, dass die Vakuum-Messgerät auf dem Verteiler 16,9 – 67,7 kPa (5 – 20 Hg) liest.
   4. Die Peptid-Proben auf die Patrone zu laden. Sorgen Sie für die Vakuum-Messgerät auf dem Verteiler liest 6,77 – 8,47 kPa (2 – 2,5 in Hg), und Durchfluss 1 mL/min nicht überschreiten.
   5. Jede Patrone dreimal mit 800 µL 0,2 % Ameisensäure im Wasser zu waschen. Sicherstellen Sie, dass die Vakuum-Messgerät auf dem Verteiler 16,9 – 67,7 kPa (5 – 20 Hg) liest.
   6. Entfernen Sie die Patrone aus dem Vakuum Verteiler und in einem 1,5 mL Reaktionscup zu begleichen.
   7. Eluieren Peptide einmal mit 800 µL 80 % ACN/0.2% Ameisensäure acid/19.8% Wasser und lassen Sie das Lösungsmittel mit auszubrüten Sorbens für 2 – 3 min..
   8. Verwenden Sie eine Pipette zu Push Lösungsmittel durch das Sorbens Schicht innerhalb der Patrone. Wiederholen Sie für die zweite Elution von 400 µL 80 % ACN/0.2% Ameisensäure acid/19.8% Wasser in die gleichen 1,5 mL Reaktionscup.
5. Trocknen Sie das Eluat durch Vakuum Zentrifugieren (Zentrifugation Rate auf 268 X gfixiert), in der Regel für 3 h.
   Hinweis: Bei Bedarf können getrocknete Eluat Proben gelagert werden bei-20 ° C eingefroren, bis bereit zum Fortsetzen der Fraktionierung.

(3) fraktionieren Sie Peptide mit Offline Basic-pH Reversed-Phase HPLC

1. Neu pro Acylated und Glu-C verdaut Proben (wie in den Abschnitten 1 und 2 beschrieben) in 200 µL Puffer A (10 mM Ammonium-Formiat im Wasser, pH 10) anhalten, mischen die Probe für 10 min auf einem Vortex Mixer bei 4 ° C und Zentrifugieren bei 17.500 X g für 10 min bei Zimmer Te Crikvenicas.
   Hinweis: Die daraus resultierenden Peptid-Probe ist bereit, offline fraktioniert durch hohen pH-Wert Trennung^19,20.
2. Programmieren Sie die offline HPLC-Fraktionierung-Methode je nach Instrument und Software verwendet. Die folgende Methode ist spezifisch für eine binäre HPLC Pumpensystem einschließlich einer doppelten Wellenlänge UV-Detektor, einem Autosampler, Fraktionssammler und eine C18 Säule (4,6 mm x 250 mm, 5 µm Partikelgröße), die pH 10 toleriert.
3. Sammle 40 Fraktionen für 2,1 min pro angebrochene und jeder vierte Bruchteil, was zu vier gepoolten Endkörnungen⁴kombinieren. Eine größere Anzahl von gepoolten Brüche kann zur Probe Komplexität auf Kosten der Massenspektrometrie Daten Sammlungsuhrzeit weiter zu reduzieren.
4. Trocknen die gepoolten Fraktionen in einem Gefriertrockner, erneut aussetzen der getrockneten Peptid Proben in 1 mL 50 % ACN und 1 % Ameisensäure im Wasser und auf einen kleineren Probenbehälter übertragen. Trocknen Sie die übertragenen Probe per Vakuum Zentrifugation (Zentrifugation Rate auf 268 X gfixiert), in der Regel für 1 h.
   Hinweis: Die geringen Dampfdruck von Ammonium-Formiat kann vollständige Trocknung erschweren. Wenn erhebliche Mengen an Ammoniumsalz Formiat als Salz Niederschlag nach dem Trocknen bleiben, wiederholen Sie die Festphasenextraktion.
5. Wieder aussetzen Sie, die Proben in 20 µL 0,2 % Ameisensäure in Wasser mit indizierten Retention Time (iRT) Peptid Standardmischung.
   Hinweis: Muster sind sofort bereit für die Analyse von Massenspektrometrie.

(4) DIA Analyse der fraktionierten Peptid Proben

1. Analysieren Sie die Proben unter Verwendung einer DIA LC-MS/MS-Methode, die nach der massenspektrometrischen zur Verfügung stehenden Instrumente angepasst werden kann. Die Analyse erfolgte mittels einer Nano-LC 2D HPLC-System online zu Massenspektrometer eine orthogonale Quadrupol Time-of-Flight (QqTOF) verbunden.
   1. Die Gerätesoftware so programmieren, dass Peptid Mischungen auf einem C18 vor Spalte Chip übertragen werden (200 µm x 6 mm C18-CL-Chip, 3 µm, 300 Å) und waschen mit 2 µL/min für 10 min mit dem Laden Lösungsmittel (H₂O/0.1% Ameisensäure) für Entsalzung.
   2. Die Peptide chromatographisch auf einem 75 µm 15 cm C18-CL-Chip zu trennen (3 µm, 300 Å) bei einer Durchflussmenge von 300 nL/min mit einer 2 h Farbverlauf mit typischen (und LC-System spezifische) wässrige und ACN Lösungsmittel Puffer⁴.
   3. Generieren Sie eine Variable Fenster DIA Methode, wo Fenster Massenbereich von variabler Breite (5 bis 90 m/Z) von Q1 Quadrupol in die Kollision Zelle in kleinen Schritten über die volle Massenbereich (m/Z 400-1.250) weitergegeben werden.
      Hinweis: Die Zykluszeit von 3.2 s beinhaltet einen 250 ms Vorläufer Ionen-Scan, gefolgt von 45 ms Akkumulationszeit für jedes der 64 SWATH Segmente^21,,²².
2. Peptide mit einer parallelen Analyse von Proben von DDA MS und Gebäude der Spektrenbibliotheken identifizieren oder alternativ direkt von DIA-Daten mithilfe von PIQED Software²³, die alle technischen Schritte der Datenverarbeitung behandelt Peptide identifiziert werden können, Identifikation und Import in Skyline für nachfolgende Quantifizierung.

5. Beispiel-Daten-Analyse-Tutorial

1. Herunterladen Sie die Skyline-Software (http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline) und erstellen Sie ein PanoramaWeb Konto (https://panoramaweb.org).
   Hinweis: Ausführliche Tutorials, die Verwendung von Skyline mit Daten beschreiben, finden Sie (https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorials). Andere Software-Algorithmen können stattdessen verwendet werden, um leichte und schwere Fragment Ion Peakflächen aus DIA Übernahmen, wie offene SCHNEISE²⁴, SWATH 2.0 Plugin in PeakView²⁵und Spectronaut²⁶zu extrahieren.
   1. Die Skyline-Datendatei für die Succinylated BSA repräsentative Ergebnisse (Abbildung 3) von öffentlichen Panorama herunterladen: https://panoramaweb.org/labkey/JoVEsuccBSA.url. Finden Sie auf der Panorama-Webseite "Gezielt MS läuft", und herunterladen Sie die sky.zip-Datei, wählen den DOWNLOAD-Link auf der rechten Seite. Extrahieren Sie die heruntergeladene .zip-Ordner, und klicken Sie doppelt auf die Datei skyline.sky im Skyline öffnen. Überprüfen Sie das Peptid Fragment Ion Zielstruktur (linken) und die vier Chromatogramme von definierten Prozentsätze des leichten Succinylation (richtigen Platten).
   2. Wählen Sie im Menü "Ansicht", navigieren Sie zu "Peakflächen | Vergleich zu replizieren". Die "Peak Bereiche – replizieren Vergleich" Panel mit Balkendiagramme erscheint auf der rechten Seite des Fensters. Im Bedienfeld "Peakflächen" mit der rechten Maustaste und wählen Sie "Übergänge | "Single", die die Fragment Ion Peakfläche für das gewählte Fragment Ion zeigt. Schließlich, mit der rechten Maustaste "Peakflächen" Panel und wählen Sie "Bestellung | Dokument".
   3. Die Zieltafel Baum auf der linken Seite des Fensters mit der rechten Maustaste auf das Peptid "E.LCKVASLRE. T | Verhältnisse zu | Oneheavy", die das Verhältnis von leichten Ionen-Signal über Schwerionen Signal, leicht/schwer berechnet.
      Hinweis: Dies ist nicht dasselbe wie Website Belegung Stöchiometrie Verhältnis von Light/(Heavy+Light).
   4. Beachten Sie, dass der Zielstruktur nun das Verhältnis L/H auf der rechten Seite der leichten Fragment-Ionen berichtet.
2. Bestimmen Sie die "Differenzierung Fragment-Ionen", die die Acylation Ort von Interesse zu enthalten.
   Hinweis: Wie in Abbildung 3dargestellt, wurden mit diesem genauen Beispiel die differenzierenden Ionen als y₇ (höchster Rang), y₈, b₃und b₄bestimmt. Beachten Sie, dass die nicht-differenzierenden Fragment-Ionen ein Verhältnis von 1 in der Zielstruktur zeigen.
   1. In der linken Verkleidung Zielstruktur unter 588.30 ++ Sub-Knoten des Peptids E.LCKVASLRE. T, klicken Sie auf die y7 Differenzierung Fragment ion
      K [y₇ ] – 902.49 + (rank1) [5]
      Beachten Sie die zunehmende Peakhöhe und Umgebung.
   2. In der linken Verkleidung Zielstruktur unter 588.30 ++ Sub-Knoten des Peptids E.LCKVASLRE. T, klicken Sie auf das y₅ -differenzierenden Fragment Ion ein [y₅ ] – 575.31 + (Rang 6) [1]. Beachten Sie, dass die y₅ Fragment Ion Chromatogramme und Peakflächen in der gleichen Größenordnung für alle Proben bleiben.
   3. Im Baum Zieltafel, stöbern Sie in anderen (Verhältnis als 1) Differenzierung und Differenzierung (Verhältnis 1) fragmentieren Ionen und beachten Sie die Änderungen und Muster in der Peakfläche bar Graph und Chromatogramme.
   4. Die genaue Peakflächen für die leichte und schwere Paare der differenzierenden Ionen zu bestimmen, um die Stöchiometrie berechnen (für weitere Details auch Meyer Et Al. siehe ( ⁴). Klicken Sie auf den "View | Dokumentraster"und das Dokumentraster öffnet sich. Oben links auf das Dokumentraster, klicken Sie auf "Ansichten | Ergebnisse den Übergang"zu sehen, eine mehrspaltige Tabelle mit Fragment Ionen-Informationen, z. B. Peptidsequenz, Vorläufer Mz replizieren Namen usw.
   5. Ändern Sie das Berichtsformat zu "drehen", indem wieder in das Dokumentraster "Ansichten" anklicken und "Bearbeiten-Ansicht" um die Ansicht anpassen-Fenster zu öffnen. Überprüfen Sie im linken unteren Bereich des Fensters "Ansicht anpassen" den "Pivot replizieren Namen" und wählen Sie "Ok", um die Ansicht anpassen-Fenster zu schließen. Beachten Sie, dass jetzt das Fenster "Dokument: Übergang Rasterergebnisse" Tabelle neu arrangiert hat, Gruppenname der replizieren, Verweilzeit, Bereich, Hintergrund, Peak Rang Spalten durch replizieren (1 %, 10 %, 50 %, 100 % Succinylation).
   6. Für das Peptid "E.LCKVASLRE. T"in der" Dokument Raster: Übergang "Ergebnistabelle, finden die"Vorläufer Mz"-Spalte, die"Fragment Ion"-Spalte und der Spalte 1pct_light_sw1 Fläche (1 % Succinylation). Beachten Sie, dass es zwei Vorläufer Ionen für dieses Peptid, Licht (Vorläufer Mz von 588.30 in den ersten 8 Zeilen) und schwere (Vorläufer Mz von 590.32 in den letzten 8 Zeilen).
   7. Finden Sie in der Spalte "Fragment Ion" die zwei Zeilen für das y8 Fragment Ion, das Licht und den schweren Vorläufer Ionen entspricht. Nehmen Sie aus den gleichen Zeilen in der Spalte 1pct_light_sw1 Fläche die y8 Bereiche für das Licht (15.820) und den schweren (1.426.461 auf).
3. Mit diesen Bereich Spitzenwerte, berechnen die Succinylation Stöchiometrie, oder der Anteil entsprechend der nachstehenden Formel geändert und erhalten eine Stöchiometrie Verhältnis von 0,01 oder 1 % Succinylation, das entspricht den Anteil der leichten Succinylation in diesem definiert Mischung:
   
4. Berechnen Sie das Verhältnis der Stöchiometrie für 10 % Succinylation mit y8 differenzierenden Fragment Ion Bereich Spitzenwerte aus der Spalte 10pct_light_sw1 Fläche, 144.953 (Licht) und 1.188.041 (schwer), um ein Verhältnis von 0,10 oder 10 % Succinylation zu erhalten.
5. Berechnen Sie das Verhältnis der Stöchiometrie für 100 % Succinylation mit y8 differenzierenden Fragment Ion Bereich Spitzenwerte aus der Spalte 100pct_light_sw1 Fläche, 954.513 (Licht) und 16.407 (schwer), um ein Verhältnis von 0,98 oder 98 % Succinylation zu erhalten.
6. In ähnlicher Weise berechnen Sie die Stöchiometrie-Verhältnis für 1 % Succinylation mit der b3 differenzierenden Fragment Ion Bereich Spitzenwerte aus der Spalte 1pct_light_sw1 Fläche, 55.697 (Licht) und 3.149.119 (schwer), um ein Verhältnis von 0,01 oder 1 % Succinylation zu erhalten.
7. Weiter die Stöchiometrie Verhältnis Berechnungen mit Hilfe der Formel für den differenzierenden Fragment-Ionen, y und b-Ionen, die Lysin-Succinylation Stöchiometrie Werte für 1, 10, 50 und 100 % Succinylation-Mischungen zu erhalten.

Ergebnisse

Nach der Datenerfassung differenzierende MS2-Fragment-Ionen aus proteolytischen Acylated Peptide ermittelt wurden, nachträglich extrahierten Ion Chromatogramme (XIC) im Skyline und entsprechenden Licht verarbeitet wurden und schwere Peakflächen wurden die waren exportiert Schließlich verwendet, um die Website Belegung zu berechnen. Abbildung 2A zeigt eine konzeptionelle Darstellung der wie kann man die Vorläufer-Ionen XIC erscheinen beide leichte und schwere Peptid-Signale mit, und Abbildung 2 b stellt ein Beispiel für das entsprechende Fragment Ion XICs mit Farbcodierung (Rot = Licht; blau = Heavy ) zur Differenzierung von Fragment-Ionen enthält Lysin Acylation Modifikationen.

Abbildung 3 zeigt die Daten, die aus einer Belegung Experiment, wie beschriebenen Analyse vordefinierte Kennzahlen leicht/schwer Succinylated BSA intern bei 1, 10, 50, oder 100 % und die Bestimmung der Succinylation Belegung davon erzeugt. DIA Belegung Datenimport in Frankfurter Skyline ermöglicht einfache Visualisierung der Zielstruktur, Anzeige von Peptid-Sequenzen und Fragment Ionen für die leichte und schwere Vorläufer Ionen (Abbildung 3A). Daten aus DIA-MS für jedes definierte Succinylated BSA Verhältnis offenbart immanent die relativen Unterschiede im Verhältnis von leicht bis schwer y₇ Ion, den höchsten Rang differenzierenden Fragment Ion aus dem ermittelten Peptid-Spektren-Spiel (rot, Abb. 3 b). Abbildung 4 zeigt einen Überblick über die verarbeiteten ergibt sich aus der MS2 Belegung Berechnung, die die Succinylation Prozentsätze Belegung der Eingabe Protein, bestätigt hier bestehend aus der Pre-Succinylated BSA. Gemessenen Lysin Succinylation Belegung für 20 proteolytischen Succinylated Peptide gewonnenen kommerziellen Pre-Succinylated BSA, Succinylated an definierten Prozentsätze (z.B.von 0, 1, 10, 50 und 100 %) sind in Tabelle 2dargestellt. Für jede der 20 proteolytischen BSA Peptide den höchsten Rang, Differenzierung MS2 Fragment Ion, Lysin-Succinylation (Ksucc)-Belegung, als L/(L+H) in % zu berechnen verwendet wurde. Insgesamt zeigten die MS2-basierte Quantifizierung sehr guten Genauigkeit bei der Bestimmung Acylation Belegung auch bei niedrigen Zusammensetzungen.

Abbildung 1: Stöchiometrie Workflow. (A) Proteine sind dreimal mit essigsaurem Anhydrid -d₆ zu unveränderten Lysin Rückstände acetylate inkubiert. Nächste, Schimmelpilzschäden Proteine werden mit Endoproteinase Glu-C, gefolgt von HPLC Fraktionierung der proteolytischen Peptide mit Basic-pH-Wert umgekehrt-Phase Chromatographie verdaut. Zu guter Letzt Peptide werden analysiert, indem LC-MS mit DIA mit variabler Vorläufer Fenster breiten. (B) den gleichen Workflow wird verwendet, um festzustellen, dass die Succinylation Stöchiometrie wie unter (A), mit Ausnahme der schweren Acylation Reagenz zu Bernsteinsäure Anhydrid -d₄geändert wird. Abbildung von Meyer Et al.angepasst. ⁴ (J. ÄV SOC Mass Spectrom., Open Choice). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Beispiel für mögliche Daten und Berechnungen der Stöchiometrie. (A) leicht (L) und (H) MS1 Vorläufer Schwerionen eines Schimmelpilzschäden Lysin unterscheiden sich durch 3 Masseneinheiten enthält. XICs entstehen für leichten und schweren Isotopen Umschläge in rot und blau, jeweils angegeben. (B) Quantifizierung von der MS2 Fragment Ion XICs aus DIA Akquisitionen mit "Differenzierung" leichte und schwere Fragment-Ionen, die die Acetylierung Website enthalten durchgeführt werden kann, angegeben in rot und blau. Gemeinsamen Fragment-Ionen werden in gepunkteten schwarz angezeigt und enthalten nicht die Website der Änderung. Abbildung von Meyer Et al.angepasst. ⁴ (J. ÄV SOC Mass Spectrom., Open Choice). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: Skyline-Visualisierung von Succinylated proteolytischen BSA-Peptid bei unterschiedlicher Auslastung. (A) Skyline Zielstruktur zeigt das proteolytische Peptid LCKsuccVASLRE und die daraus resultierende fragment Ionen. (B) Skyline extrahiert Fragment Ion Chromatogramme mit unterschiedlichem Succinylation Belegung. Der höchste Rang differenzierende Ion, y₇, erhöht in Peakfläche 1, 10, 50 und 100 % auf den eingegebenen Prozentsatz der Pre-Succinylated BSA (intern generiert) korrelieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: Beurteilung der BSA Acylation Stöchiometrie der BSA Pre-Succinylated. Fünf verschiedene BSA-Proben bei definierter Prozentsätze der schweren Veränderung (zB., von 0, 1, 10, 50 und 100 %) MS2 Belegung Bestimmung unterzogen wurden. Website-Belegung für 20 Succinylated BSA Peptide wurden aus den höchsten Rang differenzierenden Fragment-Ionen für fünf verschiedene BSA-Proben bei definierter Prozentsätze der leichten Änderung (z.B.von 0, 1, 10, 50 und 100 %) ermittelt. Der Box-Whisker-Plot zeigt die Verteilung der 20 Succinyl Peptide, sind Werte von 50 % von Peptiden in die "Box" (25 %-Perzentil zu 75 %-Perzentil) der obere Whisker zeigt die Werte von 75 %-Perzentil auf Maximum (100 %) und der unteren Whisker zeigt die Werte von 25 %-Perzentil auf Minimum (0 %-Perzentil). (J. ÄV SOC Mass Spectrom, Open Choice). Quantifizierung der Messungen finden Sie in Tabelle 2. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Zeit (Minuten)	% A	% B
0.00	100	0
7,27	92	8
45,27	73	27
49.27	69	31
65.27	61	39
72.27	40	60
80.00	10	90
85.00	10	90
86.00	100	0
120.00	100	0
Durchflussmenge: 0,7 mL/min
Puffer A: 10 mM Ammonium-Formiat im Wasser, pH 10
Puffer B: 10 mM Ammonium-Formiat in 90 % ACN und 10 % Wasser, pH 10
Hinweis: Der pH-Wert der beiden mobilen Phasen eingestellt bis 10 mit ordentlich Ammoniak

Tabelle 1: Farbverlauf für offline Basic-pH-Wert umgekehrt Phase HPLC Fraktionierung. Farbverlauf Länge: 120 min. Puffer A: 10 mM Ammonium-Formiat im Wasser, pH 10. Puffer B: 10 mM Ammonium-Formiat in 90 % ACN und 10 % Wasser, pH 10.

L / L + H in %	L / L + H in %	L / L + H in %	L / L + H in %	L / L + H in %
Ksucc 0 %	Ksucc 1 %	Ksucc 10 %	Ksucc 50 %	Ksucc 100 %
0,2	1.7	11.1	50,9	99,2
1.2	2.3	12.3	49,4	97,6
2.9	3.8	14	48,6	99,5
0,5	1.8	11.7	50,8	99,5
0,2	1.7	11.1	48,3	98,2
0,2	1.2	11	47,5	96,1
0,3	1.6	12.8	51	99,2
3.7	5.2	14.7	51,9	89,5
1.5	1.8	12.5	47,2	91,1
0,8	1.5	11.3	48,4	96,8
0,2	1.6	13.9	49,7	98,9
0.1	1.1	10.7	48,2	98,6
0,2	0,9	10.3	49,4	99,4
0,5	2.5	17.2	52,3	97,5
0.1	3.5	20,8	51	99
0,3	1.9	10.7	49,6	98,2
2	1.7	10.9	47,7	96,3
0,3	1.2	10	53	98
1.1	1.8	12.9	57,9	94,1
0,2	1.4	11.6	48,6	98,8

Tabelle 2: Quantifizierung der gemessenen BSA Lysin Succinylation Belegung für 20 proteolytischen Succinylated Peptide. Succinylated Peptide aus kommerziellen Pre-Succinylated BSA, Succinylated an definierten Prozentsätze (z.B.von 0, 1, 10, 50 und 100 %) gewonnen. Für jede der 20 proteolytischen BSA Peptide den höchsten Rang, Differenzierung MS2 Fragment Ion, Lysin-Succinylation (Ksucc)-Belegung, als L/(L+H) in % zu berechnen verwendet wurde.

Diskussion

Dieses Protokoll bietet eine neuartige und genaue Methode zur Quantifizierung von standortspezifischen Lysin Acetylierung und Succinylation Personen, die eine gesamte Proteom angewendet werden können. Diese Methode beruht auf der Messung von endogenen leichte Peptide und exogene schwere Peptide, von denen die letztere sind generierte in Vitro mit quantitativen chemischen Acylation von Proteinen mit deuterierte essigsaurem Anhydrid -d₆ oder Bernsteinsäure Anhydrid -d₄ (Abbildung 1). Ähnliche Methoden verwendet, stabilen Isotopen Kennzeichnung von nativen unveränderten Lysin Rückstände und durchgeführt Website Belegung Quantifizierung basierend auf entweder Vorläufer Ionen nur¹² oder Fragment Ionen vom DDA Akquisitionen^13,14. Dieses Protokoll gilt mehrere Schritte während der Probenvorbereitung, Acylation Effizienz zu verbessern und erstreckt sich die chemische Bezeichnung, Succinylation. Datenerfassung mit DIA Akquisitionen erhält Vorläufer Ionen und MS2 Fragment Ion Intensitäten über den gesamten nachweisbar Massenbereich, wodurch die Fragment-Ionen Interferenzen. Analyse und Quantifizierung über Skyline und benutzerdefinierte Skripts eigenentwickelte erlauben die Website Belegung Berechnung für Peptide mit mehr als einem Lysin Rückstände und mehr als ein Acylation an einem Standort.

Es gibt mehrere wichtige Schritte während der Vorbereitungsphase Probe dieses Protokolls, die engmaschig überwacht werden sollte. Da das gesamte Protokoll stützt sich auf effiziente chemische Modifikation von alle Lysin-Reste, ist dieser Schritt von größter Bedeutung. Anhydride reagieren mit freien Amine, Amin-haltigen Puffer oder Verunreinigung Moleküle des Proteins lysate vermieden werden müssen. Auch während der chemischen pro Acylation Schritt sicherstellen Sie, dass der pH-Wert des Reaktionsgemisches zurück zu pH 8 nach jeder der drei Inkubationen mit Anhydrid Reagenz angepasst wird, wie diese Reaktion die Mischung säuert, und O-Acylation Nebenreaktionen können sich bilden. Darüber hinaus ist Verdünnung der 8 M Harnstoff-haltige Reaktionsmischung um rund 0,8 M Harnstoff vor der Verdauung und Überprüfung, die der pH-Wert im optimalen Bereich ist wichtig für die optimale Aktivität der Endoproteinase Glu-C. Eine weitere wichtige Komponente unseres Protokolls ist der Daten-Sammlung-Schritt und die Einführung eines DIA-Workflows, die überwindet Inkonsistenzen DDA Daten Probenahme und ermöglicht die Quantifizierung der MS2 Fragment Ionen-Ebene. Ein Hauptvorteil der DIA-Methodik ist der Rückgang der Störungen, die in der Regel viel mehr anfällig und problematisch bei der MS1 Vorläufer Ionen-Signal (wie einige der früheren Publikationen vorgeschlagen haben).

Mehrere Änderungen an den Workflow können erfolgen, wenn hoch komplexe Proben vorbereiten. Die Anzahl der Fraktionen gebündelt nach offline Basic-pH-Wert umgekehrt Phase HPLC Fraktionierung gesenkt werden kann, um die Komplexität der gepoolten Proben zu senken, die auch von LC/MS. darüber hinaus mehr chromatographische Steigungen können erworben werden werden bei verwendet Akquisition, um bessere Peptid-Trennung zu ermöglichen. Alternativ können mehrere Proteasen verdauen Proben zu produzieren eine größere Auswahl an gespalten Peptide und Abdeckung von Lysin Proteinreste zu erhöhen verwendet werden. Probeläufe und Optimierung können mit kommerziellen BSA mit bestimmten Prozentsätzen der Acetylierung oder Succinylation durchgeführt werden.

Eine Einschränkung dieses Protokolls ist potenziell leichte Website Belegung Überschätzung wegen andere Lysin-Modifikationen, wie Methylierung oder Ubiquitination, etc.an den gleichen Standort⁴vermisst. Berechnet aus der Peakflächen von leichten und schweren Acyl Modifikationen, L/(L+H), ist die Website-Belegung basierend auf der Annahme, dass die Gesamthöhe der Änderung an einem Standort Lysin aus nur endogene "light" Acylation (L besteht) und chemisch mit der Bezeichnung "schwer" Acylation (H). Jedoch kann die tatsächliche Summe Acylation Belegung an einem Standort in Vivo andere Modifikationen über Acetylierung und/oder Succinylation enthalten. Darüber hinaus die gemeldeten isotopischen Reinheit der gekauften Reagenzien essigsaurem Anhydrid -d₆ (99 %) und Bernsteinsäure Anhydrid -d₄ (> 98 %) kann dazu beitragen, eine kleine Überschätzung von bis zu 2 % (Succinyl) oder 1 % (Acetyl) von der endogene Acylation Stufe⁴. Diese leichte Überschätzung addieren, die Schwierigkeiten bei der Quantifizierung der Standorte mit weniger als 1 % Belegung. Grosse Fülle Unterschiede zwischen der kompletten chemisch Acylated Peptide und die native Acylated Peptide auch zur Website Belegung Quantifizierung Fehlermöglichkeiten, vor allem für die niedrigen endogenen Acylated Peptide²⁷. Eine aktuelle Studie von Weinert Et Al. ²⁷ festgestellt, dass verminderte Fülle Unterschiede zwischen kompletten pro acetyliert Peptide die Quantifizierung Fehler²⁷reduzieren können.

Stöchiometrie Quantifizierungen gesammelt, unter Verwendung dieses Protokolls können genau bestimmen, wichtige Acylation Hotspots in ein bestimmtes Protein und Form Hypothesen für biologische Follow-up-Experimente, wie Site-verwiesene Mutagenese bestimmter Standorte von Interesse. Dieses Protokoll könnte auch kombinierten Effekte der niedrigen Acylation Stöchiometrie Sites aufdecken, die indirekte oder subtile Einflüsse auf strukturelle Proteinstabilität ausüben könnte und zellulären Umgebung lokalisiert. Darüber hinaus böte Durchführung dieses Protokolls, Acetylierung und Succinylation und andere mögliche Lysin Acylation Modifikationen über Acetylierung zu messen einzigartige Einblicke in die dynamische Acylation Auswirkungen auf Proteine unter verschiedenen biologischen Bedingungen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
wässriges Essigsäureanhydrid-d6	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	175641-1G	1 % Isotopenreinheit
d4	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	293741	mit Sequenzierungsqualität von 2 % Isotopenreinheit
Glu-C	Roche, Indianapolis, IN, USA (über Sigma)	10791156001	1:50 Protease-zu-Substrat-Protein-Verhältnis (wt:wt)
Oasis HLB Festphasenextraktion (SPE) Kartuschen	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT 094225
HPLC-Acetonitril	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA	BJAH015-4
HPLC-Wasser	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA	BJAH365-4
Iodacetamid	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	I1149-25G
Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	D9779-5G
FLUKA Ameisensäure (FA) für die Massenspektrometrie	Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA	C988C27	~98%
Harnstoff	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	PI29700
Rinderserumalbumin (BSA)	Pierce, Rockford, IL, USA	88341
Triethylammoniumbicarbonat (TEAB)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	T7408-100ML
wasserfreies Dimethylsulfoxid (DMSO)	Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA	43998
Natriumhydroxid (NaOH)	EMDMillipore, Burlington, MA, USA	SX0590
50%ige Hydroxylaminlösung in Wasser	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	438227-50ML
LC-MS Qualität Wasser	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA	BJLC365-4
LC-MS Acetonitril	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA	BJLC015-4
Eppendorf Themomixer Compact	Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland	T1317-1EA
Thermo Scientific Savant SPD131DDA SpeedVac Konzentrator	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	SPD131DDA-115
Waters 1525 binäres HPLC-Pumpensystem	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT022939
Waters 2487 Dual Wavelength UV-Detektor	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT081110
Waters 717plus Autosampler	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT022939
Waters Fraction Collector III	Waters Corp., Milford, MA, USA	186001878
Agilent Zorbax 300Extend C18	Säule Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA	770995-902
Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5 Lyophilizer	Labconco, Kansas City MO, USA	7751000
indexierte Retentionszeit (iRT) Normalisierungspeptid Standard	Biognosys AG, Schlieren, Zürich, Schweiz	Ki-3002-2
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC System	Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA	modell# 845
orthogonales Quadrupol Time-of-Flight (QqTOF) TripleTOF 5600 Massenspektrometer	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	pro Angebot
orthogonales Quadrupol Time-of-Flight (QqTOF) TripleTOF 6600 Massenspektrometer	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	pro Angebot
C18 Vorsäulenchip (200 μ m & times; 6 mm ChromXP C18-CL Chip, 3 & mu; m, 300 Å)	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	804-00006
SWATH 2.0 Plugin in PeakView 2.2	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	Software-Download Sciex
Spectronaut	Biognosys AG, Schlieren, Zürich, Schweiz	Sw-3001
C18-CL Chip (75 & Mikro; m x 15 cm ChromXP, 3 & micro; m, 300 Å)	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	804-00001